Name: cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

Авторы с благодарностью отмечаем работу Наваб Мохамад доктор, Алан Фогельман и Редди Сриниваса за их ключевую роль в развитии более ранних итераций этой модели. T.A.A. поддерживается КМТИ университета вице-канцлера докторантура стипендий. AJ и AH поддерживаются NHMRC Грант проекта 1108792. TK поддерживается NIH предоставляет низ K08AI08272, гранта NIH/NCATS # µL1TR000124.

всех экспериментов с использованием человеческого биологические образцы были выполнены с одобрения этики из университета Калифорнии-Лос-Анджелес, Лос-Анджелес и Альфред больницы человеческой этики Комитета, Мельбурне.
 Примечание: существует много вариантов флюрохро...

Протокол, описанные здесь предлагает надежный инструмент ответить вопросы важных исследований относительно роли функции HDL в атеросклероза и заболеваний человека. Assay количественно перекиси содержание ЛПВП липидов на мг HDL-C помощью ферментационная амплификация (ПХ). Этот подход позво...

Атеросклеротические сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) является ведущей причиной смерти во всем мире1,2. Эпидемиологические исследования показали, что низкие уровни холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL), как правило, обратно, связанные с риском развития атеросклероза1,2. Хотя некоторые исследования поддерживают atheroprotective роль для ЛПВП1,2, механизм, по которому HDL ослабляет посвящения и прогрессирования атеросклероза является комплекс 3,4. Таким образом было высказано предположение о том, что сложная структура и функции ЛПВП, а не абсолютный уровень может более точно предсказать атеросклероза 5,6,,78. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. Эти i) сократить ее уровень холестерина измеряем потенциальных 9, ii) уменьшить противовоспалительный и повышение ЛПВП связанные pro воспалительные белки 6,7, iii) снижение антиоксидантной фактор уровней и деятельности и HDL способностью ингибировать окисления липопротеидов низкой плотности (LDLox)10 и iv) увеличить липидов гидропероксид содержание и окислительно-восстановительной деятельности (HDLox)9,11. Надежные анализы, которые оценивают pleotropic функции HDL (например холестерин измеряем, Антиоксидантная функция) может дополнить определение HDL-HDL-C в клинике.
HDL функция обычно оценивается на основе ячеек методами, такими как холестерин измеряем пробирного8,12,,1314. Эти методы имеют основные ограничения, включая значительную гетерогенность в отношении типов клеток используется, тип индикации сообщили, отсутствие стандартизации и накладывающееся воздействие триглицеридов 7,15. Эти недостатки представляют трудности для крупных клинических исследований16. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. Измеряем холестерина является одним из наиболее важных функций ЛПВП, но он только может определяться на основе ячеек анализов. Другие подходы для определения HDL функции, такие как протеомики17,18,19,20,21,,2223, 24 и хемотаксис анализов на основе ячеек Моноцит HDL функция 17,,2225 не были стандартизированы и не может использоваться в крупных масштабах человеческих исследований.
HDL имеет значительные антиоксидантными atheroprotective эффект5,6,,78. Антиоксидантная функция HDL определил присутствии ЛПНП в предыдущей ячейке бесплатно флуориметрический анализов 26. Эти биохимические методы флуориметрический HDL антиоксидантные функции были первоначально разработан Мохамад Наваб и Алан Фогельман и их коллег26. Хотя многие человеческие исследования использовали эти методы для определения HDL функция 17,18,19,20,21,22,23 ,24, липидов (HDL)-липидов (ЛПНП) и липидов флюрохром взаимодействия может ограничить воспроизводимость этих клеток бесплатно неферментативного биохимических анализов HDL функция27,28.
Последнее время интерес была сосредоточена на функциональных последствий HDL окисления, что является результатом окисления липидов и белков в пределах HDL 27,29,30. Предыдущие исследования показали, что окисление HDL ухудшает HDL функция 27,29,30. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Таким образом могут быть использованы для определения HDL функция 9,17,,2031 и учитывая известные ограничения предыдущих анализов HDL функция7, HDL липидной перекиси содержание 15,27,32, мы развитых флуориметрический альтернативный метод, который дает количественную оценку HDL липидной перекиси содержание (HDLox) 32. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C- 32. Биохимический принцип анализа показано на рисунке 1. Мы показали, что этот подход на основе флуоресценции не имеют ограничений предварительного HDL функция анализов27,28. Этот assay далее уточнены и стандартизированы в нашей лаборатории, так, чтобы он надежно может использоваться в крупных масштабах человеческой исследований, даже с криоконсервированных плазменный 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. Индикация этот assay ассоциируется с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. здесь мы опишем этот простой, но надежный метод для измерения HDL липидной перекиси содержания (HDLox). Этот assay может использоваться как инструмент, ответить на вопросы важных исследований относительно роли функции HDL заболеваний человека где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов имеют ключевую роль (например, атеросклероз)32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent</td>
			<td>Pointe Scientific</td>
			<td>H7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red reagent.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Esterase.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cholesterol Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Resorufin fluorescense Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Reaction Buffer.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>TR39601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 200, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>14-488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>&#160;14-387--955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 2.01 software</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Plate reader</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein

Холестерина низкой липопротеинов высокой плотности (HDL-C) являются одним из самых мощных независимых негативные предикторы атеросклеротической сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Структура и функции ЛПВП, вместо того, чтобы HDL-C может более точно предсказать атеросклероза. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. HDL функция определяется обычно ячейки на основе анализов, таких как холестерин измеряем пробирного но эти анализы имеют многочисленные недостатки отсутствием стандартизации. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. HDL окисления повреждает функцию HDL. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Липидов зонд взаимодействия следует рассматривать при интерпретации результатов неферментативного флуоресценции assays для измерения окислительное состояние липидов. Это побудило нас к разработке свободных клеток биохимических ферментативного метода для оценки HDL перекиси содержание липидов (HDLox), способствующий HDL дисфункции. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C. Вот протокол describedfor определение HDL-перекисного окисления с помощью флюрохром реагента. Пробирного изменчивость может быть уменьшена строгой стандартизации экспериментальных условиях. Более высокие значения HDLox связаны с снижение HDL антиоксидантные функции. Индикация этот assay связан с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов. Этот технический подход является надежный метод оценки функции HDL в человеческих заболеваний, где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов играют ключевую роль (например, атеросклероз).

В каждом также шаг 7.3 добавляются 50 мкл каждого образца HDL. 50 мкл раствора HRP, 5 ед/мл (0,25 U) затем добавляются в каждой скважине как шаг 7.5. Образцы инкубируют 30 минут при 37 ° C как шаг 7,6. 50 мкл Реагента флюрохром затем добавляются в каждой скважине как шаг 7.7 (конечная концент?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Здесь мы описываем флуориметрический свободных клеток биохимических assay для определения HDL-перекисного окисления липидов. Этот быстрый и воспроизводимые assay может использоваться для определения функции HDL в крупных исследований масштаба и может способствовать нашему пониманию функции HDL заболеваний человека.

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Высокая пропускная Анализ фенотипу<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Высокая пропускная способность измерения внеклеточной ДНК-релиз и количественный NET Формирование в нейтрофилах человека<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Высокая пропускная способность гена Tagging в<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...