Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev muliggjort af tilskud fra den hollandske Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) og World Cancer Research midler International (WCRF; project no. 2014-1181)

Alle procedurer blev gjort lokale dyrevelfærd love og retningslinjer.
1. forberedelse af instrumenter, dyrkningsmedier og retter
<ol><li>Autoklave 1 sæt intestinal saks, normal saks og pincet i en steril beholder.</li>
	<li>Sted en 96-brønd (flad bund) fad i en inkubator ved 37 ° C.</li>
	<li>Forberede 10 mL af komplet næringssubstratet med de reagenser, der er anført i tabel af materialer.</li>
	<li>Inkuber den fuldstændige medium ved 37 ° C i et vandbad.</li>
	<li>Tø rekonstituere...

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

ORA tillader den raffinerede funktionel analyse af de to væsentlige komponenter i den intestinale stamcelle niche, nemlig Lgr5+ og Paneth cellerne. Denne tilgang har tidligere været ansat ved os og andre med mindre ændringer6,10,11. Vi præsenterer her, ORA procedure som laboratorier reproducerbare og standardiseret protokol. Også, vi rapport om virkningerne af Apc downregulation i Lgr5<...

Den intestinale epitel er den mest hurtigt selv fornyelse væv i pattedyr kroppen og som sådan har været genstand for et utal af undersøgelser med henblik på identifikation og funktionel karakterisering af de voksne stamceller bosat nederst i krypten af Lieberkühn, øremærkede ved ekspression af Lgr5 -gen og afhængige af canonical Wnt signaler1. Især, er Lgr5+ stamceller flankeret og støttet af specialiserede niche celler, dvs Paneth cellerne, som også afhænger af Wnt signalering til deres modning2. Sammen, disse to celletyper ligge til grund for self-fornyelse af den intestinale epitel foring og bevare den daglige homeostatiske balance: Lgr5+ stamceller hurtigt dividere og give anledning til Stamform og mere specialiseret intestinale epitel celler; Paneth cellerne give væsentlige niche faktorer (f.eks.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ stilk celler2. Kapacitet af intestinal Krypter når forgyldt ex vivo til at danne organiseret og selvstændig fornyelse strukturer kaldes organoids, eller "mini-modet", er blevet udnyttet som en eksperimentel redskab til at give indsigt i processer som selvfornyelse og differentiering i normale og patologiske betingelser herunder kræft4. Organoid kulturer har været etableret fra flere væv, herunder tarm, bugspytkirtel, lever og nyrer, fra både musen og menneskelige prøver4. Metoden udvinding og vækstfaktorer ansat til at udvikle disse organoid kulturer er væv-specifikke og designet til at køre flere lineage differentiering og efterligner så tæt som muligt de oprindelige stamceller niche in vivo. Organoids kan have potentielle applikationer, herunder behandling af genetiske sygdomme, vurderingen af den terapeutiske virkning i kræft, analyse af lægemiddeltoksicitet eller studiet af organogenesis in vitro-5.
Samlet set er den største begrænsning af organoid kulturer når etableret fra vævsprøver manglende celle-specificitet. For eksempel tarm organoids etableret fra hele tarm Krypter ikke tillader analyse af enkelte cellulære komponenter omfattede inden for væv kilde (f.eks.hele Krypter indeholder Lgr5+, Paneth, og stamceller).
Her, beskriver vi en roman metode, betegnes som ORA, der kombinerer fordelene ved tarm organoid kulturer med den funktionelle analyse af dets mest grundlæggende komponenter, nemlig stilk (Lgr5+) og niche (Paneth) celler. Dette opnås gennem en unik evne af Paneth og Lgr5+ celler for at fysisk forbinder med hinanden når Co udruget og give anledning til organoids2,6,10. Vi tog fordel af denne funktion og forbehandlet to celletyper individuelt før den tillader dem at rekonstruere organoids. Når du laver så hver celle komponent kan blive udsat for enhver given stof, vækstfaktor, biokemiske inhibitor, genetisk modifikation eller kemisk behandling inden rekonstitution og organoid dannelse. Derfor vil tillade bruge ORA assay bestemmelse af om en specifik behandling eller genetisk modificering har en specifik virkning på stamcellerne eller deres niche modstykke.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Final concentration: 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin *</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Final concentration: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y27632 *</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jagged-1 *</td>
			<td>Anaspec Bio</td>
			<td>AS-61298</td>
			<td>Final concentration: 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-spondin *</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Final concentration: 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS11789</td>
			<td>Final concentration: 100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 TER119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>008875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

Den intestinale epitel er karakteriseret ved en meget hurtig omsætningshastighed. Hos pattedyr, er hele epithelial foring fornyes inden for 4-5 dage. Tarm stamceller fra voksne bor i bunden af Krypter af Lieberkühn, er øremærket ved ekspression af Lgr5 -gen og bevare homøostase gennem deres karakteristiske høje proliferativ sats1. I hele tyndtarmen, Lgr5+ stamceller er sammenblandet med specialiserede sekretoriske celler kaldet Paneth cellerne. Paneth celler udskiller antibakterielle stoffer (dvs., lysozym og cryptdins/defensins) og udøve en kontrollerende rolle på tarmfloraen. For nylig, en ny funktion er blevet opdaget for Paneth cellerne, nemlig deres kapacitet til at niche støtte Lgr5+ stamceller gennem flere centrale ligander som Wnt3, EGF og Dll12.
Når isoleret ex vivo og kulturperler bestemte vækstfaktorer og ekstracellulære matrix komponenter, hele tarm Krypter give anledning til langlivede og selvstændig fornyelse 3D strukturer kaldet organoids, der meget ligner krypt-villus epitelial arkitektur af voksen tyndtarmen3. Organoid kulturer, når etableret fra hele Krypter, tillade studiet af selvfornyelse og differentiering af den intestinale stamcelle niche, uden dog at tackle bidrag af dens enkelte komponenter, nemlig Lgr5+ og Paneth cellerne.
Her, vi beskrive en ny tilgang til organoid analysen, der udnytter muligheden i Paneth og Lgr5+ celler til at knytte og danne organoids når Co kulturperler. Denne tilgang, betegnes som "organoid rekonstitution assay" (ORA), tillader den genetiske og biokemiske ændring af Paneth eller Lgr5+ stamceller, efterfulgt af rekonstituering i organoids. Som sådan, det giver mulighed for den funktionelle analyse af de to vigtigste komponenter i tarm stamcelle niche.

Organoid rekonstitution assay tillader den separate funktionelle analyse af de væsentlige niche og stamceller komponenter i den intestinale epitel, her vist ved små interfererende RNA (siRNA) af Apc -genet.
For at nå dette mål må udnyttet vi først fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) for at adskille 8000 Lgr5+ celler og 6000 Paneth cellerne fra indavlede C57BL6/J mus. I <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid rekonstitution Assay (ORA) for den funktionelle analyse af Intestinal stilk og Niche celler

Tarm organoid kulturer er etableret fra hele krypter og tillader ikke, at analysen af selvfornyelse og differentiering i en celle-specifikke mode. Denne protokol beskriver rekonstituering af sorterede stilk (Lgr5+) og niche (Paneth) celler, som giver anledning til organoids samtidig med at deres forudgående biokemiske og genetiske modifikation og funktionelle analyse.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Brug af menneskelige perivaskulær stamceller til Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Mikrofluid Chip til Alsidig kemisk analyse af enkelte celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedregulering af<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimering Binding af humane mesenchymstamceller på Poly (ε-caprolacton) elektrospundne Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ Fluorescens mikroskopi-baseret enkelt Liposome-analyse til påvisning af den kompositoriske Inhomogenitet mellem individuelle Liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Isolering, ekspansion og differentiering af mesenkymale stamceller fra den infrapatellære fedtpude i gedekvæleleddet

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...