Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

Cette étude a été rendue possible par le financement de la société néerlandaise de Cancer (KWF ; EMCR 2012-5473) et le World Cancer Research Fonds International (WCRF ; projet no 2014-1181)

Toutes les procédures ont été effectuées selon les directives et lois locales de bien-être animal.
1. préparation des Instruments, les milieux de Culture et plats
<ol><li>Ensemble d’autoclave 1 intestinale Ciseaux Ciseaux normaux et pinces dans un flacon stérile.</li>
	<li>Placer un plat de 96 puits (fond plat) dans un incubateur à 37 ° C.</li>
	<li>Préparer 10 mL de milieu de culture complet avec les réactifs énumérés dans la table des matières.</li>
	<li>Incuber le milieu ...

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

L’ORA permet l’analyse fonctionnelle raffinée des deux composantes essentielles de la niche de cellules souches intestinales, à savoir Lgr5+ et cellules de Paneth. Cette approche a été utilisée précédemment par nous et d’autres avec de légères modifications6,10,11. Nous présentons ici la procédure ORA comme un protocole de laboratoire standardisée et reproductible. En outre, nous rapportons ...

L’épithélium intestinal est le tissu autorenouvellement plus rapidement dans l’organisme chez les mammifères et, à ce titre, a fait l’objet d’une pléthore d’études visant à l’identification et la caractérisation fonctionnelle des cellules souches adultes résidant au fond de la crypte de Lieberkühn, affectée par l’expression du gène Lgr5 et fonction canonique Wnt signaux1. Notamment, Lgr5+ des cellules souches sont flanqués et pris en charge par des cellules spécialisées de créneau, c'est-à-dire des cellules de Paneth, qui dépendent aussi de signalisation Wnt pour leur maturation2. Ensemble, ces deux types de cellules sous-tendent l’auto-renouvellement de la muqueuse épithéliale intestinale et préservation de l’équilibre homéostatique quotidienne : Lgr5+ cellules souches rapidement diviser et donner lieu à des progéniteurs et plus spécialisée intestinales épithéliales cellules ; Les cellules de Paneth fournissent des facteurs essentiels de niche (p. ex., Dll1, Wnt3, EGF) à Lgr5+ 2les cellules souches. La capacité des cryptes intestinales lorsque plaqué ex vivo pour former des structures organisées et autorenouvellement appelée organoïdes, ou « mini-tripes », a été exploitée comme un outil expérimental pour donner un aperçu des processus tels que l’auto-renouvellement et différenciation dans des conditions normales et pathologiques, y compris le cancer4. Organoïde cultures ont été établis de plusieurs tissus, y compris l’intestin, le pancréas, le foie et le rein, à la fois des souris et des échantillons humains4. La méthode d’extraction et les facteurs de croissance employés pour développer ces cultures organoïde sont tissu-spécifique et conçues pour conduire la différenciation des lignées multiples et imiter autant que possible la niche de cellules souches original in vivo. Organoïdes peut avoir des applications potentielles, y compris le traitement des maladies génétiques, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique dans le cancer, l’analyse de la toxicité des médicaments ou l’étude de l’organogenèse in vitro5.
Dans l’ensemble, la principale limitation des cultures organoïde lorsque établies à partir d’échantillons de tissus est un manque de spécificité cellulaire. Par exemple, organoïdes intestinales, établis à partir des cryptes intestinales ensemble ne permettent pas l’analyse des différents composants cellulaires englobés dans la source de tissu (par exemple, contiennent des cryptes toute Lgr5+, Paneth, et cellules souches).
Nous décrivons ici une nouvelle méthode, dénommée ORA, qui combine les avantages des cultures organoïde intestinale avec l’analyse fonctionnelle de ses éléments plus fondamentaux, à savoir les souches (Lgr5+) et les cellules de la niche (Paneth). Ceci est réalisé grâce à la capacité unique de Paneth et des cellules pour associer physiquement à l’autre lorsque co incubés et donner lieu à organoïdes2,6,10 Lgr5+ . Nous avons pris parti de cette fonctionnalité et prétraités individuellement les deux types cellulaires avant leur permettant de reconstituer organoïdes. Ce faisant, chaque composant de la cellule peut être exposé à n’importe quel médicament, facteur de croissance, inhibiteur biochimique, modification génétique ou traitement chimique avant reconstitution et organoïde formation. Par conséquent, essai sur les ORA permettra à la détermination de la question de savoir si un traitement médicamenteux spécifique ou la modification génétique a un effet spécifique sur les cellules souches ou leur homologue de niche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Final concentration: 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin *</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Final concentration: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y27632 *</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jagged-1 *</td>
			<td>Anaspec Bio</td>
			<td>AS-61298</td>
			<td>Final concentration: 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-spondin *</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Final concentration: 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS11789</td>
			<td>Final concentration: 100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 TER119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>008875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

L’épithélium intestinal se caractérise par un taux de rotation extrêmement rapide. Chez les mammifères, le revêtement épithélial entière est renouvelé dans les 4-5 jours. Les cellules souches adultes intestinaux se trouvent au fond des cryptes de Lieberkühn, sont affectés par l’expression du gène Lgr5 et préserver l’homéostasie grâce à leur caractéristique fort taux proliférative1. Tout au long de l’intestin grêle, Lgr5+ cellules souches s’entremêlent avec les cellules sécrétrices spécialisées appelées cellules de Paneth. Les cellules de Paneth sécrètent des composés antibactériens (c.-à-d., lysozyme et cryptdins/défensines) et exercent un rôle dominant sur la flore intestinale. Plus récemment, une nouvelle fonction a été découvert pour les cellules de Paneth, à savoir leur capacité à fournir un soutien de niche de cellules souches Lgr5+ à travers plusieurs ligands principaux au Wnt3, EGF et Dll12.
Lorsque isolés ex vivo et cultivées en présence de facteurs de croissance spécifiques et des constituants de la matrice extracellulaire, des cryptes intestinales ensemble donnent lieu à longue durée de vie et renouvellement des structures 3D appelé organoïdes qui ressemblent fortement à la crypte-villosités architecture épithéliale de l' intestin grêle adulte3. Organoïde cultures, lors de toute cryptes, permettent l’étude de l’auto-renouvellement et la différenciation de la niche de cellules souches intestinales, sans toutefois aborder la contribution de ses composants, à savoir le Lgr5+ et Cellules de Paneth.
Ici, les auteurs décrivent une nouvelle approche à l’analyse d’organoïde qui tire parti de la capacité de Paneth et des cellules de Lgr5+ pour associer et former les organoïdes lorsque conjointement mis en culture. Cette approche, ici dénommée « essai de reconstitution organoïde » (ORA), permet la modification génétique et biochimique de Paneth ou Lgr5+ des cellules souches, suivis de la reconstitution dans organoïdes. À ce titre, elle permet l’analyse fonctionnelle des deux principales composantes de la niche de cellules souches intestinales.

L’essai de reconstitution organoïde permet l’analyse fonctionnelle séparée des composants essentiels de niche et de cellules souches de l’épithélium intestinal, témoigne ici de petits ARN interférents (siARN) du gène Apc .
Pour atteindre cet objectif, nous avons utilisé tout d’abord fluorescent cellulaire activé triant (FACS) pour séparer les cellules Lgr5+ 8000 et 6000 cellules de...

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The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

L’essai de Reconstitution organoïde (ORA) pour l’analyse fonctionnelle des souches intestinales et des cellules de Niche

Les cultures organoïde intestinale sont établis de cryptes ensemble et ne permettent pas l’analyse de l’auto-renouvellement et différenciation de façon spécifique des cellules. Ce protocole décrit la reconstitution de tige triée (Lgr5+) et les cellules (Paneth), donnant lieu à organoïdes, tout en permettant leur préalable modifications biochimiques et génétiques et l’analyse fonctionnelle de niche.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

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