Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

מחקר זה התאפשר על ידי מימון ההולנדי האגודה למלחמה בסרטן (KWF; EMCR 2012-5473) את העולם סרטן מחקר קרנות הבינלאומי (WCRF; פרויקט מס ' 2014-1181)

כל ההליכים נעשו על פי חוקים לרווחת בעלי חיים מקומיים והנחיות.
1. הכנת כלי נגינה, תרבות המדיה ומנות
<ol><li>אוטוקלב 1 סט של מעיים מספריים, מספריים רגילה, מלקחיים במיכל סטרילי.</li>
	<li>מניחים צלחת 96-ובכן (בתחתית שטוח) בתוך אינקובטור ב 37 º C.</li>
	<li>הכינו 10 מ"ל של מדיום תרבות שלמה עם ריאגנט...

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

אורה מאפשר ניתוח פונקציונלי מעודן של שני מרכיבים חיוניים של הגומחה תאי המעי, כלומר Lgr5+ ותאי Paneth. גישה זו כבר מועסקים בעבר עם שינויים קלים6,10,11מאת, ואחרים. כאן, אנו מציגים את ההליך אורה כפרוטוקול מעבדה מתוקננת הדירים. בנוסף, אנחנו ?...

האפיתל במעי הוא הרקמה ביותר במהירות עצמי המתחדש בגוף יונקים ו, בתור שכזה, היה מושא שפע של מחקרים שמטרתם זיהוי ואפיון פונקציונאלי של תאי גזע בוגרים המתגוררים בחלק התחתון של התת-קרקעי המופרש, תגייס לביטוי של הגן Lgr5 ותלוי ונ ט הקנוני אותות1. ראוי לציין, תאי גזע Lgr5+ מוקף, נתמך על ידי תאים נישה מיוחדים, קרי Paneth תאים, אשר גם תלוי ונ ט איתות שלהם התבגרות2. יחד, מסוגי התאים שני ביסוד התחדשות עצמית של רירית אפיתל המעי, לשמר את האיזון homeostatic יומי: Lgr5+ תאי גזע במהירות לחלק, להצמיח קדמון, יותר והתמחה מעיים אפיתל תאים; תאי Paneth לספק נישה חיוני גורמים (למשל, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ גזע תאים2. הקיבולת של מעיים כוכים כאשר מצופה ex-vivo כדי ליצור מבנים מאורגנים עצמי המתחדש שנקרא organoids, או "מיני-אומץ", נוצלה ככלי ניסיוני כדי לספק תובנות תהליכים כגון התחדשות עצמית, בידול בתנאים נורמליים ופתולוגיים כולל סרטן4. תא צורב תרבויות הוקמו מתוך מספר רקמות, לרבות המעי, הלבלב, הכבד, הכליה, העכבר והן דוגמאות האנושי4. שיטת החילוץ של גורמי גדילה המועסקים לפתח תרבויות תא צורב אלה הם רקמות ספציפיות נועד כונן מרובה שושלת היוחסין בידול ואת לחקות ככל האפשר את גומחת תאי גזע המקורי ויוו. Organoids ייתכן יישומים אפשריים כולל הטיפול של מחלות גנטיות, להערכת יעילות טיפולית בסרטן, הניתוח של רעילות התרופה או המחקר של organogenesis במבחנה5.
הכולל, המגבלה העיקרית של תרבויות תא צורב כאשר נוצרו מדגימות רקמה הוא חוסר תא-ירידה לפרטים. לדוגמה, מעיים organoids נוצרו מכוכים מעיים כל אינם מאפשרים הניתוח של רכיבים בודדים הסלולר הקיף בתוך המקור רקמות (למשל, מכילים כוכים כל Lgr5+, Paneth, ו ובתאים).
כאן, אנו מתארים שיטה, המכונה אורה, המשלבת את היתרונות של תרבויות תא צורב מעיים עם ניתוח תפקודי של מרכיביו הבסיסיים ביותר, כלומר גזע (Lgr5+) ותאים נישה (Paneth). זו מושגת באמצעות היכולת הייחודית של Paneth, Lgr5+ תאים לשיוך פיזית עם אחד לשני כאשר שיתוף מודגרות להצמיח organoids2,6,10. אנו ניצלו תכונה זו, טרום טיפול בנפרד את סוגי תאים שני מתנים את אותם צריך להשרות organoids. תוך כדי כל רכיב תא תיחשף כל נתון סמים, פקטורי גדילה, מעכב הביוכימי, ההנדסה הגנטית או טיפול כימי לפני שיחזור ויצירת תא צורב. לכן, שימוש וזמינותו אורה יאפשר הקביעה של הטיפול בתרופה מסוימת או ההנדסה הגנטית יש אפקט מסוים על תאי גזע או עמיתו הנישה שלהם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Final concentration: 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin *</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Final concentration: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y27632 *</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jagged-1 *</td>
			<td>Anaspec Bio</td>
			<td>AS-61298</td>
			<td>Final concentration: 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-spondin *</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Final concentration: 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS11789</td>
			<td>Final concentration: 100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 TER119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>008875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

האפיתל במעי מאופיין על ידי שיעור תחלופה מהירה בצורה קיצונית. ביונקים, הציפוי אפיתל כולו מתחדש תוך 4-5 ימים. תאי גזע בוגרים מעיים שוכנים בתחתית המופרש אמורים לעבור על ידי ביטוי של הגן Lgr5 , לשמור על הומאוסטזיס באמצעות שלהם האופיינית בקצב גבוה proliferative1. לאורך כל המעי הדק, Lgr5+ תאי גזע שנטוו עם תאים הפרשה מיוחדים הנקראים תאי Paneth. תאי Paneth מפרישים חומרים אנטי בקטריאליים (קרי, ליזוזים ו cryptdins/defensins) ולעשות מאמץ תפקיד השליטה על הפלורה במעיים. לאחרונה, פונקציה הרומן התגלה עבור תאי Paneth, כלומר היכולת שלהם לספק תמיכה נישה לתאי גזע Lgr5+ דרך מספר ליגנדים מפתח Wnt3, EGF ו- Dll12.
כאשר מבודדים לשעבר vivo ותרבותית בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים ורכיבים מטריצה חוץ-תאית, כוכים מעיים כל להצמיח מאריכים וקרא עצמית חידוש מבנים תלת-ממד organoids המזכירים מאוד את הקריפטה-סיסי ארכיטקטורה האפיתל של המעי הדק למבוגרים3. תא צורב תרבויות, כאשר הוקמה מתוך כל כוכים, לאפשר המחקר של התחדשות עצמית ובידול של הגומחה תאי המעי, אך ללא התייחסות התרומה של מרכיבים בודדים, כלומר Lgr5+ , תאי Paneth.
כאן, אנו מתארים את הגישה של הרומן וזמינותו תא צורב כי מנצל היכולת של Paneth ו Lgr5+ תאים כדי לשייך ויוצרים organoids כאשר ותרבותית משותפת. גישה זו, המכונים כאן "תא צורב שיחזור assay" (אורה), מאפשרת שינוי גנטי וביוכימי של Paneth או Lgr5+ תאי גזע, ואחריו שיחזור לתוך organoids. ככזו, היא מאפשרת ניתוח תפקודי של שני מרכיביה העיקריים של גומחת תאי גזע מעיים.

תא צורב שיחזור וזמינותו מאפשר ניתוח פונקציונלי נפרדים של הרכיבים החיוניים נישה, תאי גזע של האפיתל במעי, הפגינו כאן על ידי RNA מפריעות קטן (siRNA) של הגן Apc .
כדי להשיג מטרה זו, אנו קודם מנוצל פלורסנט תא מופעל מיון (FACS) כדי להפריד בין 8000 Lgr5</e...

Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

תא צורב מעיים תרבויות הוקם מתוך כל כוכים, ואינם מאפשרים הניתוח של התחדשות עצמית ובידול באופן ספציפי תא. פרוטוקול זה מתאר הכינון של גזע ממוינת (Lgr5+), נישה (Paneth) תאים, אשר להצמיח organoids תוך מתן אפשרות שינוי הביוכימי, גנטית מוקדמת שלהם, אנליזה פונקציונלית.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

ליגנין Down-תקנה של<em&gt; Zea mays</em&gt; באמצעות dsRNAi וKlason ליגנין ניתוח

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

ביו-מאמר מיקרומערכים למיקרוטקטיקה וניתוח מולקולרי של נויטרופילים אנושיים

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

בידוד, הרחבה והתמיינות של תאי גזע מזנכימליים ממשטח השומן האינפרא-פטלרי של מפרק העיזים מחניק

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...