Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00
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この研究はオランダ癌協会 (KWF; からの資金によって可能になったEMCR 2012-5473) と世界がん研究基金国際 (WCRF; プロジェクト号 2014-1181)

すべてのプロシージャは、動物愛護の法律および指針に従って行われました。
1. 楽器、文化、メディア、料理の準備
<ol><li>腸はさみ、通常のはさみや滅菌コンテナーに鉗子のオートクレーブ 1 セット。</li>
	<li>37 ° C でインキュベーターの場所 96 ウェル (フラットボトム) の皿</li>
	<li>材料の表に記載されている試薬を用いる完全な培養液 10 mL を準備します。</li>
	<li>37 ?...

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

又は、2 つの基本的なコンポーネント腸管幹細胞ニッチすなわちLgr5+ 、パネート細胞の洗練された機能解析が可能します。このアプローチは、わずかな変更6,10,11私たちと他の人が以前採用されています。再現性と標準化された実験室のプロトコルとして又は手順を紹介します。また、遺伝子導入の可能性の?...

腸上皮は哺乳類の体内で最も急速に自己更新組織で、同定と地下室の下部に存在する大人の幹細胞の機能解析を目的とした研究の茄多のオブジェクトをされていますLieberkühn、 Lgr5遺伝子の発現による目的税とカノニカル Wnt 信号1に依存しています。特に、 Lgr5+幹細胞は並ぶ、専門にされたニッチ細胞、すなわちパネート細胞で、また彼らの成熟2Wnt シグナルに依存によってサポートされています。一緒に、これらの 2 つの細胞型腸上皮の自己複製の根底にあるし、毎日恒常性平衡を保持: Lgr5+幹細胞は急速に分割し、前駆細胞に上昇を与えるより専門的な腸上皮細胞;パネート細胞に不可欠なニッチな要因 (例えば、Dll1 Wnt3、EGF) を提供するLgr5+幹細胞2。メッキ前のヴィヴォ組織と自己の構造を形成する organoids、または「ミニ根性」と呼ばれるとき腸陰窩の能力は、自己更新などのプロセスへの洞察力を提供するために実験的なツールとして悪用されていると分化癌4を含む正常および病的条件。Organoid 文化は、腸、膵臓、肝臓、腎臓、マウスおよびひと試料4からを含むいくつかの組織から確立されています。抽出法およびこれら器官毛細文化を開発する採用の成長因子が組織特異的多系統分化を駆動し、できるだけ元の幹細胞ニッチを模倣するように設計体内。Organoids 遺伝的疾患の治療、がんの治療効果、薬物の毒性の解析または器官培養5研究の評価を含む潜在的なアプリケーションがあります。
全体的にみて、organoid 文化組織サンプルから確立されたときの主な制限は、細胞特異性の欠如です。たとえば、腸陰窩から確立された腸オルガノイドは組織のソースの内で包含される個々 の細胞成分の分析を許可しない (例えば、全体の陰窩を含むLgr5+、パネートと前駆細胞)。
ここでは、手法、オラと呼ばれるの最も基本的なコンポーネント、すなわち幹 (Lgr5+)、ニッチ (Paneth) 細胞の機能解析と腸管における文化の利点を組み合わせたについて述べる。Paneth のユニークな能力を通してそしてLgr5+細胞に物理的に互いの共同培養 organoids2,6,10に上昇を与えるとを関連付けます。我々 はこの機能の利点を取り、オルガノイドを再構成する前に個別に 2 つのセル型が前処理します。その際、各細胞成分はある薬剤、成長因子、生化学的阻害剤、遺伝子組み換え、または再構成と organoid 形成前に化学治療に公開できます。したがって、又は分析を使用すると、特定の薬物治療や遺伝子組み換えが幹細胞またはそのニッチ相手に特定の効果をあるかどうかの決定ができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Final concentration: 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin *</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Final concentration: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y27632 *</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jagged-1 *</td>
			<td>Anaspec Bio</td>
			<td>AS-61298</td>
			<td>Final concentration: 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-spondin *</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Final concentration: 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS11789</td>
			<td>Final concentration: 100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 TER119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>008875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

腸の粘膜上皮は、非常に急速な率が特徴です。哺乳類、全体の上皮をリニューアルして、4-5 日以内。成人の腸管幹細胞 Lieberkühn の陰窩の下部に存在するLgr5遺伝子の発現による計上、その増殖率が高い特徴的な1を介して恒常性を維持します。、小腸全体Lgr5+パネート細胞と呼ばれる特殊な分泌細胞と幹細胞が混在しています。パネート細胞は (すなわちリゾチーム、cryptdins/ディフェンシン) 抗菌化合物を分泌して腸内細菌叢の制御の役割を発揮します。もっと最近、パネート細胞、すなわち Wnt3、EGF, および Dll12としていくつかのキー配位子Lgr5+幹細胞ニッチ サポートを提供する能力の新たな機能が発見されています。
腸陰窩が長命に上昇を与えるex vivoを分離すると特定の成長因子と細胞外マトリックス成分の存在下で培養したとクリプト絨毛のような高い organoids と呼ばれる 3 D 構造の自己更新3大人の小腸の上皮のアーキテクチャです。Organoid 文化、全体の陰窩から確立されたとき個々 のコンポーネント、すなわち、 Lgr5+の貢献に対処せず、腸管幹細胞ニッチの分化と自己複製の研究を許可してパネート細胞。
ここでは、Paneth の能力の活用における分析への新しいアプローチについて述べるし、 Lgr5+は関連付けるオルガノイドを形成する細胞と共培養します。このアプローチは、ここで「organoid 再構成法」という (ORA) Paneth の遺伝学的および生化学的な変更をことができますまたはLgr5+幹細胞オルガノイドに再構成が続きます。そのため、腸管幹細胞のニッチの 2 つの主要なコンポーネントの機能解析をことができます。

Organoid 再構成アッセイでは、 Apc遺伝子の小さな干渉 RNA (siRNA) を行い, ここで、腸上皮の幹細胞のニッチとの基本的なコンポーネントの個別の機能解析をことができます。
この目的を達成するために私たちはまず近交系 C57BL6/J マウスから 8000 Lgr5+細胞と 6000 のパネート細胞を分離する (FACS) を並べ替え...

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The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

腸内における文化は全体の陰窩からされ細胞特異的自己複製と分化の解析を許可しません。このプロトコルを記述する並べ替えられた幹 (Lgr5+) の再構成とその前の生化学的および遺伝性の変更と機能解析を可能にしながらオルガノイドを生じさせる (Paneth) 細胞のニッチします。

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

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