Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

이 연구 (KWF; 네덜란드 암 학회 로부터 자금에 의해 가능 하 게 되었다 EMCR 2012-5473)와 세계 암 연구 기금 국제 (WCRF; 프로젝트 번호 2014-1181)

모든 절차는 로컬 동물 복지 법률과 지침에 따라 수행 되었다.
1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비
<ol><li>장가 위, 일반가 위, 및 살 균 컨테이너에 집게의 압력솥 1 세트.</li>
	<li>(플랫 바닥) 96 잘 접시 37 ° c.에는 인큐베이터에 배치</li>
	<li>시 약 재료의 테이블에 나열 된 완전 한 문화 매체의 10 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>물 욕조에 37 ° C에서 완전 한 매체를 품 어.</li>
	<li>해 동...

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

오 라는 두 가지 필수 구성 요소 장 줄기 세포 틈새의 즉 Lgr5+ 그리고 Paneth 세포의 세련 된 기능 분석을 허용 한다. 이 방법은 이전 우리와 다른 사람에 의해 약간의 수정6,,1011를 고용 하고있다. 여기, 재현할 수 및 표준화 된 실험실 프로토콜 또는 프로시저 선물이. 또한, 우리 유전자 구현의 가능성의 예를 들어 <e...

장 상피 포유류 몸에 있는 가장 빠르게 자기 갱신 조직 그리고, 따라서, 식별 및 크립 트의 하단에는 성인 줄기 세포의 기능적 특성을 겨냥 하는 연구의 과다의 개체 Lieberkühn, Lgr5 유전자의 표현에 의해 갑니다 고 정식 Wnt 신호1의 특히, Lgr5+ 줄기 세포 형벌 이며 전문된 틈새 세포, 즉 Paneth 세포, 또한 그들의 성숙2Wnt 신호에 의존 하는 의해 지원. 함께, 이러한 두 셀 형식 자체-갱신 창 자 상피 안 대기의 기초 및 일일 homeostatic 균형 유지: Lgr5+ 줄기 세포는 급속 하 게 분할 하 고 뿌리를 및 더 많은 전문 장 상피 셀; Paneth 세포 제공 필수 틈새 요인 (예를 들어, Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ 줄기 세포2. 장 지하실 때 도금 비보 전 조직과 자체 갱신 구조를 형성 하기 위하여 organoids, 또는 "미니-배 짱", 용량 자체 갱신 등 프로세스에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험 도구로 이용 되 고 암4를 포함 하 여 정상 및 병 적인 조건에서 차별화. Organoid 문화 소장, 췌 장, 간, 그리고 신장, 마우스 및 인간의 샘플4에서 포함 하 여 여러 조직에서 설립 되었습니다. 추출 방법 및 성장 요인이 organoid 문화를 개발 하는 조직 및 다중 계보 차별화를 운전 하 고 최대한 원래 줄기 세포 틈새를 모방 하도록 설계 된 vivo에서. Organoids는 유전 질환의 치료, 암에서 치료 효능, 약물 독성의 분석 또는 생체 외에서organogenesis5의 연구의 평가 포함 하 여 잠재적인 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
전반적으로, organoid 문화 조직 샘플에서 설립 하는 때의 주요 제한은 세포 특이성의 부족입니다. 예를 들어 장 organoids 전체 장 지하실에서 설립 조직 소스 내 포함 개별 세포 구성 성분의 분석을 허용 하지 않습니다 (예를 들어, 전체 지하실 포함 Lgr5+, Paneth, 그리고 조상 세포)입니다.
여기, 우리 소설 메서드, 오 라로 그것의 가장 기본적인 구성 요소, 즉 줄기 (Lgr5+)와 틈새 (Paneth) 세포의 기능 분석 장 organoid 문화의 장점을 결합 하 여 설명 합니다. 이 Paneth의 독특한 능력을 통해 이루어집니다 그리고 실제로 공동 인 큐베이 팅 및 organoids2,,610을 때 서로 연관 Lgr5+ 세포. 우리는이 기능 활용 하 고 미리 organoids를 다시 구성 하도록 허용 하기 전에 개별적으로 2 개의 세포 유형 취급. 때 이렇게, 특정된 약물, 성장 인자, 생화학 억제제, 유전자 조작, 또는 재구성 및 organoid 형성 전에 화학적 치료 각 셀 구성 요소를 노출 될 수 있습니다. 따라서, 지금 분석 결과 사용 하 여 특정 약물 치료 또는 유전 수정에 줄기 세포 또는 그들의 틈새에 특정 효과 있는지 여부의 결정을 허용할 것 이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Final concentration: 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin *</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Final concentration: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y27632 *</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jagged-1 *</td>
			<td>Anaspec Bio</td>
			<td>AS-61298</td>
			<td>Final concentration: 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-spondin *</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Final concentration: 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS11789</td>
			<td>Final concentration: 100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 TER119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>008875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

장 상피는 매우 빠른 회전 속도 의해 특징입니다. 포유류에서 전체 상피 안 대기는 4-5 일 이내에 갱신 됩니다. 성인 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 하단에, Lgr5 유전자의 표현에 의해 배정 있으며 그들의 특성 높은 증식 속도1통해 항상성 유지. 작은 창 자에 걸쳐 Lgr5+ 줄기 세포 Paneth 세포 라고 하는 특수 분 비 세포와 혼합 된. Paneth 세포 항균 화합물 (즉, lysozyme과 cryptdins/defensins) 분 비와 창 자 식물에 제어 역할을 발휘. 더 최근에, 소설 함수 Paneth 세포, 즉 그들의 용량을 Wnt3, EGF, 및 Dll12로 몇 가지 주요 ligands 통해 Lgr5+ 줄기 세포 틈새 지원 제공에 대 한 발견 되었습니다.
전 비보 를 격리 하 고 특정 성장 인자와 세포 외 기질 구성 요소 존재 양식, 전체 장 지하실을 일으키 긴와 매우 유사한 크립 트 모 organoids 라는 자체 3D 구조를 갱신 성인 소장3의 상피 아키텍처입니다. Organoid 문화, 전체 지하실에서 설치 될 때 비록 그것의 개별 구성 요소, 즉는 Lgr5+ 의 기여를 해결 하지 않고 자기 갱신의 연구와 장 줄기 세포 틈새의 허용 및 Paneth 세포입니다.
여기, organoid 분석 결과 Paneth의 능력을 활용 하는 새로운 접근 방식을 설명 및 Lgr5+ 연결 하 고 organoids 형성을 셀 때 공동 경작. 이 이렇게, 여기 "organoid 재구성 분석 결과" 라고 (오 라), Paneth 유전 그리고 생 화 확 적인 수정할 수 있게 또는 Lgr5+ organoids로 재구성 뒤 줄기 세포. 따라서, 장 줄기 세포 틈새의 두 가지 주요 구성 요소 기능 분석을 수 있습니다.

Organoid 재구성 분석 결과 Apc 유전자의 작은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 증명 여기 장 상피의 필수 틈새 및 줄기 세포 구성 요소의 별도 기능 분석을 수 있습니다.
이 목표를 달성 하기 위해 우리는 먼저 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 타고 난된 C57BL6/J 쥐에서 8000 Lgr5+ 세포와 6000 Paneth 세포를 분리 하 활용. <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

장 organoid 문화 전체 지하실에서 설정 되 고 셀 전용 패션에 자기 갱신과 차별화의 분석을 허용 하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 정렬 된 줄기 (Lgr5+)의 재구성, 틈새 (Paneth) 세포, 그들의 이전 생 화 확 및 유전 수정 및 기능 분석 하는 동안 organoids을 일으키.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

연구

생체공학

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

폴리 (ε 카프로 락톤) 전기 방사 원사에 인간 중간 엽 줄기 세포의 첨부 파일을 최적화

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

염소 스티플 관절의 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 확장 및 분화

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...