Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

Denne studien ble gjort mulig med midler fra den hollandske Kreftforeningen (KWF; EMCR 2012-5473) og World Cancer Research midler International (WCRF, prosjektet nr 2014-1181)

Alle prosedyrer ble gjort i henhold til lokale dyrevelferd lover og retningslinjer.
1. forberedelse av instrumenter og kultur medier retter
<ol><li>Autoclave 1 sett av intestinal saks, normal saks og tang i en sterile containeren.</li>
	<li>Plass en 96-brønnen (flat bunn) rett i en inkubator på 37 ° C.</li>
	<li>Klargjør 10 mL av fullstendig kultur medium med reagensene oppført i tabell av materialer.</li>
	<li>Inkuber komplett middels på 37 ° C i et vannbad.</li>
	<li>Tine rekonstitu...

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

ORA tillater raffinert funksjonell analyse av de to viktigste komponentene for intestinal stamcelleforskningen nisje, nemlig Lgr5+ og Paneth celler. Denne tilnærmingen har vært tidligere ansatt og andre små modifikasjoner6,10,11. Her presenterer vi ORA prosedyren som en reproduserbar og standardisert laboratorium protokoll. Også vi rapportere om virkningene av Apc downregulation i Lgr5<s...

Intestinal epitel mest raskt selv fornyende vevet i pattedyr kroppen og, som sådan, har vært gjenstand for en overflod av studier for identifikasjon og funksjonell karakteristikk av voksne stamceller bosatt nederst på crypt av Lieberkühn, øremerket av uttrykk av Lgr5 genet og avhengig av kanoniske Wnt signaler1. Spesielt er Lgr5+ stamceller flankert og støttes av spesialiserte nisje celler, i.e. Paneth celler, som også avhenger av Wnt Signaliser for deres modning2. Sammen disse to celletyper populasjonsgjennomsnittet selvtillit fornyelse av intestinal epithelial fôr og bevare den daglige homøostatisk balanse: Lgr5+ stamceller raskt dele og gi opphav til stamfar og mer spesialiserte intestinal epithelial celler. Paneth celler gir viktig nisje faktorer (f.eksDll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ stamceller2. Kapasiteten til intestinal Krypter når belagt ex vivo å danne organisert og selv fornyende strukturer kalt organoids, eller "mini-guts", har blitt utnyttet som en eksperimentell verktøy for å gi innsikt i prosesser som selvtillit fornyelse og differensiering i normal og patologiske forhold inkludert kreft4. Organoid kulturer er opprettet fra flere vev, inkludert tarmen, bukspyttkjertelen, leveren og nyre, fra både mus og prøver fra mennesker4. Utvinning metoden og vekstfaktorer ansatt for å utvikle disse organoid kulturer er vev-spesifikke og utformet for å kjøre flere avstamning differensiering og etterligne så nært den opprinnelige stamcelleforskningen nisje i vivo. Organoids kan ha potensielle programmer inkludert behandling av genetiske sykdommer, vurdering av terapeutiske effekten i kreft, analyse av medikament toksisitet eller studiet av organogenesen i vitro5.
Total, den viktigste begrensningen av organoid kulturer når etablert fra vevsprøver er mangel på celle-spesifisitet. For eksempel intestinal organoids etablert fra hele intestinal Krypter tillater ikke analyse av mobilnettet enkeltkomponenter omfattet vev kilden (f.ekshele Krypter inneholder Lgr5+, Paneth, og stamfar celler).
Her beskriver vi en roman metoden, kalles ORA, som kombinerer fordelene med intestinal organoid kulturer med funksjonell analyse av de mest grunnleggende komponentene, nemlig stem (Lgr5+) og nisje (Paneth) celler. Dette oppnås gjennom unike evne til Paneth og Lgr5+ cellene skal fysisk knytte hverandre når co ruges og gi opphav til organoids2,6,10. Vi tok nytte av denne funksjonen og pre-behandlet de to celletyper individuelt tidligere tillater seg å gjeninnføre organoids. Når du gjør dette, kan hver celle komponent utsettes for enhver gitt narkotika, vekstfaktor, biokjemiske inhibitor, genetisk modifisering eller kjemisk behandling før rekonstituering og organoid formasjon. Derfor kan bruker ORA analysen bestemme om en bestemt behandling eller genetisk modifisering har en bestemt effekt på stamceller eller deres nisje motpart.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Final concentration: 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin *</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Final concentration: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y27632 *</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jagged-1 *</td>
			<td>Anaspec Bio</td>
			<td>AS-61298</td>
			<td>Final concentration: 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-spondin *</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Final concentration: 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS11789</td>
			<td>Final concentration: 100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 TER119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>008875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

Intestinal epitel er preget av en ekstremt rask omløpshastighet. I pattedyr, er hele epithelial fôr fornyet i 4-5 dager. Voksen intestinal stamceller finnes nederst i krypten i Lieberkühn, er øremerket av uttrykk av Lgr5 genet og bevare homeostase gjennom sine karakteristiske proliferativ høyt1. Gjennom hele tynntarmen, Lgr5+ stamceller er blandet med spesialiserte sekretoriske celler kalt Paneth celler. Paneth celler skiller antibakterielle forbindelser (dvs., lysozyme og cryptdins/defensins) og utøve en kontrollerende rolle på tarmfloraen. Flere nylig, en ny funksjon har blitt oppdaget for Paneth cellene, nemlig evnen til å gi nisje støtte til Lgr5+ stamceller gjennom flere viktige ligander som Wnt3 og EGF Dll12.
Når isolerte ex vivo og kultivert i nærvær av bestemte vekstfaktorer og ekstracellulær matrix komponenter, hele intestinal Krypter gi opphav til varige og selvtillit fornyelse 3D strukturer kalt organoids som ligner svært krypt-villus epitel arkitektur av voksen tynntarmen3. Organoid kulturer, når etablert fra hele crypts tillate studiet av selvtillit fornyelse og differensiering av intestinal stamcelleforskningen nisje, men uten å ta opp forholdet mellom de enkelte komponentene, nemlig den Lgr5+ og Paneth celler.
Her beskriver vi en ny tilnærming til den organoid analysen som utnytter muligheten for Paneth og Lgr5+ celler for å knytte og danner organoids da co kulturperler. Denne her referert til som "organoid rekonstituering analysen" (ORA), tillater den genetiske og biokjemiske modifikasjon av Paneth eller Lgr5+ stamceller, etterfulgt av rekonstituering i organoids. Slik kan funksjonell analyse av de to viktigste komponentene av intestinal stamcelleforskningen nisje.

Organoid rekonstituering analysen tillater separat funksjonell analyse av de viktigste nisje og stamcelleforskningen komponentene for intestinal epitel, her demonstrert av lite forstyrrende RNA (siRNA) av Apc genet.
For å oppnå dette, utnyttet vi først fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) for å skille 8000 Lgr5+ cellene og 6000 Paneth fra innavlet C57BL6/J mus. Et flytskjema til ORA ana...

Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid rekonstituering analysen (ORA) for funksjonell analyse av Intestinal stammen og nisje celler

Intestinal organoid kulturer er etablert fra hele Krypter og tillater ikke analyse av selvtillit fornyelse og differensiering i en celle-spesifikk måte. Denne protokollen beskriver rekonstituering av sorterte stamme (Lgr5+) og nisje (Paneth) celler, som gir opphav til organoids mens deres tidligere biokjemiske og genetiske modifikasjoner og funksjonell analyse.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Bruk av menneskelige perivaskulær stamceller for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Microfluidic Chip for Allsidig Kjemisk analyse av enkeltceller

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedregulering av<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi og Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimalisere Vedlegg of Human stamceller på Poly (ε-kaprolakton) elektrospunnede Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikkel Mikroarrayer for kjemotaktisk og molekylær analyse av human nøytrofil svermer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Isolering, utvidelse og differensiering av mesenkymale stamceller fra Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...