Name: the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

Denna studie har möjliggjorts genom finansiering från den holländska Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) och World Cancer Research medel International (WCRF; projekt nr 2014-1181)

Alla förfaranden var klara enligt lokala djurskyddet lagar och riktlinjer.
1. beredning av instrument, kultur Media och rätter
<ol><li>Autoklav 1 uppsättning intestinal sax, normala sax och pincett i en steril behållare.</li>
	<li>Placera en 96 brunnar (platt botten) maträtt i en inkubator vid 37 ° C.</li>
	<li>Förbereda 10 mL av komplett odlingsmedium med reagenser i tabell i material.</li>
	<li>Inkubera komplett mediet vid 37 ° C i ett vattenbad.</li>
	<li>Tina rekonstituerade basa...

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5.">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li><li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine.">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32 (2015).</li><li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis,+Inflammation,+and+Cancer.">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li><li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury.">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965 (2012).</li><li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function.">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer.">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li><li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction.">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li></ol>

ORA tillåter den raffinerade funktionell analysen av de två väsentliga delarna av intestinal stamcellsnischen, nämligen Lgr5+ och Paneth celler. Detta tillvägagångssätt har tidigare varit anställd av oss och andra med smärre ändringar6,10,11. Här presenterar vi ORA förfarandet som ett reproducerbart och standardiserade laboratorium protokoll. Också, vi rapportera om effekterna av Apc ned...

Intestinala epitelet är den mest snabbt själv förnya vävnaden i kroppen hos däggdjur och, som sådan, har varit föremål för en uppsjö av studier syftar till att identifiera och funktionell karakterisering av de adulta stamceller som bor längst ned i kryptan av Lieberkühn, öronmärkta av uttryck av genen Lgr5 och beroende av kanoniska Wnt signaler1. Noterbart är Lgr5+ stamceller flankerad och stöds av specialiserade nisch celler, dvs Paneth celler, vilket också beror på Wnt signalering för deras mognad2. Tillsammans, dessa två celltyper ligger bakom självförnyelse av intestinal epitel slemhinnan och bevara den dagliga homeostatiska balansen: Lgr5+ stamceller snabbt dela upp och ge upphov till stamceller och mer specialiserade intestinal epitelial celler; Paneth celler ger väsentliga nisch faktorer (t.ex., Dll1, Wnt3, EGF) till Lgr5+ stamceller2. Kapaciteten för intestinal kryptor när guldpläterade ex vivo att bilda organiserade och själv förnya strukturer kallas organoids, eller ”mini-tarmar”, har utnyttjats som en experimentell verktyg för att ge insikt i processer såsom självförnyelse och differentiering i normala och patologiska förhållanden inklusive cancer4. Organoid kulturer har fastställts från flera vävnader, inklusive tarmen, bukspottkörtel, lever och njure, från både mus och mänskliga prover4. Metoden utvinning och de tillväxtfaktorer som anställd att utveckla dessa organoid kulturer är vävnadsspecifika och utformade att köra flera härstamning differentiering och så nära som möjligt efterliknar ursprungliga stamcellsnischen invivo. Organoids kan ha potentiella tillämpningar inklusive behandling av genetiska sjukdomar, bedömning av terapeutisk effekt i cancer, analys av drug toxicitet eller studiet av organogenes in vitro-5.
Sammantaget är den största begränsningen av organoid kulturer när etablerade från vävnadsprover brist på cell-specificitet. Till exempel intestinal organoids etablerat från hela tarmens kryptor inte tillåter analys av enskilda cellkomponenter omfattade inom vävnad källan (t.ex., hela kryptor innehåller Lgr5+, Paneth, och progenitorceller).
Här beskriver vi en ny metod, kallad ORA, som kombinerar fördelarna med intestinal organoid kulturer med den funktionella analysen av dess mest grundläggande komponenter, nämligen stammen (Lgr5+) och nisch (Paneth) celler. Detta uppnås genom den unika förmågan av Paneth och Lgr5+ celler för att fysiskt associera med varandra när Co inkuberas och ge upphov till organoids2,6,10. Vi drog fördel av denna funktion och pre behandlas de två celltyper individuellt innan de tillåts att rekonstruera organoids. När du gör så, varje cell komponent kan utsättas för någon viss drog, tillväxtfaktor, biokemiska hämmare, genmodifiering eller kemisk behandling innan beredning och organoid bildandet. Alltså kommer att med ORA analys möjliggöra fastställandet av huruvida en specifik läkemedelsbehandling eller genetisk modifiering har en specifik effekt på stamcellerna eller deras nisch motsvarighet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Final concentration: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF *</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td>Final concentration: 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin *</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Final concentration: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y27632 *</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jagged-1 *</td>
			<td>Anaspec Bio</td>
			<td>AS-61298</td>
			<td>Final concentration: 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-spondin *</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Final concentration: 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS11789</td>
			<td>Final concentration: 100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24 APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-kit PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD31</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV 421 CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 TER119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>008875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666548-250EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the organoid reconstitution assay (ora) for the functional analysis of intestinal stem and niche cells

Intestinala epitelet kännetecknas av en extremt snabb omsättningshastighet. Hos däggdjur förnyas hela epitelial slemhinnan inom 4-5 dagar. Intestinal stamceller bor längst ned i kryptor av Lieberkühn, är öronmärkta av uttryck av genen Lgr5 och bevara homeostas genom sin karaktäristiska höga proliferativ kurs1. Hela tunntarmen, Lgr5+ stamceller samsas med specialiserade sekretoriska celler kallas Paneth celler. Paneth celler utsöndrar antibakteriell föreningar (dvs, lysozym och cryptdins/defensins) och utöva en kontrollerande roll på tarmfloran. Mer nyligen, har upptäckt en ny funktion för Paneth celler, nämligen deras kapacitet att stödja nisch Lgr5+ stamceller genom flera viktiga ligander som Wnt3, EGF och Dll12.
När isolerade ex vivo och odlade i närvaro av specifika tillväxtfaktorer och extracellulär matrix komponenter, hela tarmens kryptor ge upphov till långlivade och själv förnya 3D-strukturer som kallas organoids som mycket liknar de crypt-villus epitelial arkitekturen av vuxen tunntarmen3. Organoid kulturer, när etablerade från hela kryptor, tillåta studien av självförnyelse och differentiering av intestinal stamcellsnischen, men utan att ta itu med bidrag av dess enskilda komponenter, nämligen den Lgr5+ och Paneth celler.
Här beskriver vi en ny metod för organoid analysen som tar fördel av möjligheten för Paneth och Lgr5+ celler för att associera och bildar organoids när Co odlade. Detta synsätt, här benämnd ”organoid beredning assay” (ORA), tillåter de genetiska och biokemiska modifieringen av Paneth eller Lgr5+ stamceller, följt av beredning i organoids. Som sådan, gör det den funktionella analysen av de två viktigaste delarna av intestinal stamcellsnischen.

Organoid beredning analysen kan den separata funktionella analysen av väsentliga nisch och stamceller komponenter av intestinal epitel, här visat av små störande RNA (siRNA) av Apc -genen.
För att uppnå detta mål måste utnyttjas vi först fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS) för att separera 8000 Lgr5+ och 6000 Paneth celler från inavlade C57BL6/J möss. I fig...

Watch this Scientific Journal Video about The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells at JoVE.com

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid beredning analysen (ORA) för den funktionella analysen av Intestinal Stem och nisch celler

Intestinal organoid kulturer är etablerade från hela kryptor och tillåter inte analys av självförnyelse och differentiering i en cell-specifika mode. Det här protokollet beskriver beredning av sorterade stem (Lgr5+) och nischade (Paneth) celler, som ger upphov till organoids samtidigt som deras tidigare biokemisk och genetisk modifiering och funktionell analys.

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Användning av mänskliga perivaskulär stamceller för benuppbyggnad

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Ett mikroflödes Chip för Mångsidig kemisk analys av enskilda celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Lignin nedreglering av<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi och Klason lignin Analys

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimera Utmätning av Human mesenkymala stamceller på Poly (ε-kaprolakton) Electrospun Garner

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll för mikroRNA överföring till benmärgen-härrör hematopoetiska stamceller att aktivera Cell teknik kombinerat med magnetiska inriktning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel Mikroarrayer för chemotaktisk och molekylär analys av human neutrophil svärma in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Isolering, expansion och differentiering av mesenkymala stamceller från den infrapatellära fettkudden i getkvävningsleden

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...