Name: conditional knockdown of gene expression in cancer cell lines to study the recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment
Uploaded: 2017-11-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Författarna vill erkänna Jacqueline Rosenberg för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete stöds av den oss Department of Health and Human Services/National Institutes of Health med ett bidrag till YA DeClerck (bevilja 5R01 CA 129377) och TJ Martell stiftelsen. MH Kubala är mottagare av en forskning karriär utveckling Fellowship award för Saban Research Institute vid Children's Hospital Los Angeles.

Avsnittet protokoll som använder humana monocyter erhållits från friska frivilliga följer riktlinjerna i Children's Hospital Los Angeles mänskliga forskningsetisk kommitté och har godkänts av den institutionella Review Board under den mänskliga Material Protokoll nummer: CCI 08-00208.
1. beredning av Cancer cellinjer med tetracyklin-reglerade shRNA uttryck
<ol><li>Kloning av shRNA PAI-1 i Tet-pLKO-puro vektor 8 , 9...

<ol>
	<li>Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transgenic+technologies.">Conditional transgenic technologies.</a> J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).</li><li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology.">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li><li>Franklin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+origin+of+tumor-associated+macrophages.">The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages.</a> Science. 344 (6186), 921-925 (2014).</li><li>Ruffell, B., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+therapeutic+resistance+in+cancer.">Macrophages and therapeutic resistance in cancer.</a> Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Mizuguchi, H., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+adenovirus-mediated+tetracycline-controllable+expression+system.">Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system.</a> Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).</li><li>Meyer-Ficca, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+inducible+expression+systems+in+transient+transfection+studies.">Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies.</a> Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).</li><li>Wiederschain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-vector+inducible+lentiviral+RNAi+system+for+oncology+target+validation.">Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation.</a> Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).</li><li>Wee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN-deficient+cancers+depend+on+PIK3CB.">PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).</li><li>Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+CXCR4+by+inducible+small+interfering+RNA+inhibits+breast+cancer+cell+invasion+in+vitro.">Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro.</a> Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).</li><li>Solari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYCN-dependent+expression+of+sulfatase-2+regulates+neuroblastoma+cell+survival.">MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival.</a> Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).</li><li>Liao, Y., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+RNAi+system+and+its+application+in+novel+therapeutics.">Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics.</a> Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Jungi, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+chemotaxis+by+a+reversible+Boyden+chamber+eliminating+cell+detachment.">Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).</li><li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+autocrine+motility+factor+suppress+gastric+cancer.">Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer.</a> Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Sorbus+commixta+on+the+invasion+and+migration+of+human+hepatocellular+carcinoma+Hep3B+cells.">Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells.</a> Int J Mol Med. , (2017).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes,+peripheral+blood+mononuclear+cells,+and+THP-1+cells+exhibit+different+cytokine+expression+patterns+following+stimulation+with+lipopolysaccharide.">Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide.</a> Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).</li><li>Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+monocytes+versus+THP-1+monocytes+for+in+vitro+biocompatibility+testing+of+dental+material+components.">Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components.</a> J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation.">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li><li>Flo, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+of+human+monocytes+using+magnetic+particles+covered+by+anti-lymphocyte+antibodies.">Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies.</a> J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).</li><li>Grondahl-Hansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cytosolic+tumor+extracts+predicts+prognosis+in+low-risk+breast+cancer+patients.">Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).</li><li>Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+of+serous+ovarian+cancer+from+cystic+to+solid+tumors+is+associated+with+increased+expression+of+mRNA+for+urokinase+plasminogen+activator+(uPA),+its+receptor+(uPAR)+and+its+inhibitor+(PAI-1).">Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1).</a> Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).</li><li>Devy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-+or+antiangiogenic+effect+of+plasminogen+activator+inhibitor+1+is+dose+dependent.">The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent.</a> FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).</li><li>Bajou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+protects+endothelial+cells+from+FasL-mediated+apoptosis.">Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis.</a> Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).</li><li>Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+promotes+inflammatory+process+induced+by+cigarette+smoke+extraction+or+lipopolysaccharides+in+alveolar+epithelial+cells.">Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells.</a> Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Targeting+of+Plasminogen+Activator+Inhibitor-1+Decreases+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Migration+and+Neointima+Formation.">Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).</li><li>Carmeliet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+role+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+in+arterial+wound+healing+and+neointima+formation:+a+gene+targeting+and+gene+transfer+study+in+mice.">Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice.</a> Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).</li><li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+receptor+LRP+together+with+tPA+and+PAI-1+coordinates+Mac-1-dependent+macrophage+migration.">Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration.</a> EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).</li><li>Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+regulates+infiltration+of+macrophages+into+melanoma+via+phosphorylation+of+FAK-Tyr(9)(2)(5).">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5).</a> Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).</li><li>Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+is+a+critical+downstream+target+of+p53+in+the+induction+of+replicative+senescence.">Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence.</a> Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).</li><li>Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protumorigenic+activity+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+through+an+antiapoptotic+function.">Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function.</a> J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).</li><li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV.">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages,+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells.</a> Science. 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocytes+undergo+excessive+apoptosis+following+temozolomide+activating+the+ATM/ATR+pathway+while+dendritic+cells+and+macrophages+are+resistant.">Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant.</a> PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).</li></ol>

Består av en mängd olika celltyper, är TME avgörande för utvecklingen av cancer. För att fastställa optimala odlingsbetingelser, locka cancerceller monocyter genom utsöndring av kemotaktiska faktorer. Här presenterar vi ett protokoll för att studera mekanismen av monocyt rekrytering av tumör celler in vitro. För detta ändamål används en kombination av inducerbara gen uttryck system, rening av primära humana monocyter, och som ett exempel på en migration assay, Boyden kammare analysen.
<p cla...

Tumör associerade makrofager (TAMs) bidra till tumörutveckling genom att främja tumörtillväxt, metastaser och reglering av immunsvar2. Cancerceller rekrytera inflammatorisk monocyter, som infiltrera tumör och differentieras till pro-tumörframkallande TAMs3. Infiltration av tumören med TAMs korrelerar med dålig kliniskt utfall och har kopplats till makrofager4,5immunhämmande roll. Men mekanismerna för rekrytering av makrofager att tumören inte är väl undersökt och en bättre förståelse av de inblandade vägarna är avgörande för vidare befordran av fältet och lovande terapier. En av utmaningarna i att studera interaktioner mellan tumör och normala celler i tumören närmiljön (TME) är komplexiteten av mekanismer och celler inblandade, som kräver in vitro- metoder som gör dissekering av överhörning. Här presenterar vi en mångsidig metod som kan användas för att studera de parakrin effekt av en cancer cell-derived, utsöndrade proteinet migration av andra celltyper som makrofager, in vitro. Med ett system där uttrycket av shRNA mot en cancer cell-derived protein som deltar i rekrytering av monocyter är under kontroll av tetracyklin inducerbara arrangören, är parakrin effekt utsöndrade proteinet på monocyter quantitated. I detta protokoll följt kloning av shRNA sekvenser i den tetracyklin reglerade vektor presenteras av generation av stabil cancer cellinjer. Ytterligare, rening av primära humana monocyter och en Boyden kammare analys används för att analysera parakrin effekt en cancer-cell härrör protein på migration av monocyter.
Nedreglering av protein kodande gener är vanligen tillämpas med siRNA och shRNA tekniker, men inte utan begränsningarna av dess användning. Den långsiktiga knock-down (KD) av gener kan framkalla sekundära adaptiv Svaren av celler som störa experimentella resultat. Bristande temporal kontroll över genuttryck gör det utmanande att studera ett protein dynamisk roll över tid eller rollen av ett protein som är avgörande för cellöverlevnad. Denna fråga är särskilt viktigt i i vivo inställningar, där rollen av ett protein i tumörutveckling och progression kan kräva nedreglering av uttrycket av proteinet av intresse endast efter tumör är etablerad. Villkorliga KD har fördelen av att förebygga ett för tidigt dödliga effekten av KD på celler och för att möjliggöra analys av rollen av protein i olika stadier av tumörtillväxt, medan ovillkorlig KD kan resultera i brist på tumörutveckling.
Ett antal villkorlig KD system har utvecklats för att hantera begränsningar i stabil KD. De villkorliga gen uttryck system inkluderar Ecdysone-inducerbara överuttryck system, med cytokrom P450-induktion system1, och tetracyklin reglerad gen uttryck system. De tetracyklin-reglerad gen uttryck system tillåter kontroll över uttryck för shRNA vid tillägg av den antibiotiska tetracyklin (eller dess mer stabil analog - doxycyklin). I Tet-ON system, ett uttryck för shRNA induceras i närvaro av tetracyklin/doxycyklin vilket resulterar i en genuttryck KD, medan i Tet-OFF system, ett uttryck för shRNA dämpas i närvaro av tetracyklin resulterar i genuttryck. En nackdel med tetracyklin-inducerbara system är tidigare rapporterade låga nivåer av uttryck av shRNA i avsaknad av doxycyklin - so-called leakiness6,7. I Tet-ON system som beskrivs här, vid administrering av tetracyklin, bindningen av konstitutivt uttryckta tetracyklin repressor (te) protein till sekvensen Tet-responsive element (TRE) inom H1 promotor regionen shRNA av intresse är undertryckta. Detta resulterar i uttryck av shRNA och hämning av översättning av proteinet av intresse i en tetracyklin-beroende sätt8,9.
Andra tillgängliga Tet-ON system inkluderar samtidiga inpressning av den TetO sekvens mellan TATA box och proximala sekvens element (PSE) och mellan TATA box och transkription starta webbplatsen utvecklad av Chan et al. 10 detta system kräver mindre än toxiska doser av tetracyklin att reglera shRNA uttryck, dock under en icke-inducerad stat, låga nivåer av shRNA uttrycks. Krüppel-associerade box (KRAB) baserat Tet-ON system11 inkluderar KRAB, ett zink finger protein, som försökspersoner gener ligger inom 3 kb KRAB bindande webbplatsen transkriptionell dämpning. Den chimär protein tTRKRAB kan binda till TetO, och på grund av det stora utbudet av DNA kontrollerbar kapacitet, TetO inte behöver begränsas mellan transkriptionen starta webbplatsen och arrangören och har låg effekt på aktiviteten av arrangören. Under icke-inducerad staten rapporterades kontrollerbar RNA interferens systemet att visa en lägre nivå av läckt uttryck shRNA11,12; Det kräver dock en sekventiell, två-vektor kloning strategi. I jämförelse med tidigare utvecklade villkorlig KD system såsom Ecdysone-inducerbara överuttryck systemet eller cytokrom P450-induktion system, tetracyklin-reglerade systemet har fördelen av dess robusthet och reversibilitet, och därför är mest används rutinmässigt system13. Det system som används i detta protokoll har fördelen över den dubbla TetO knock-in system och KRAB Tet-ON system eftersom det kräver rakt fram, enda vektor kloning, möjliggör snabb generering av flera kloner, och den uppvisar mycket låga nivåer av leakiness i den avsaknad av doxycyklin.
TME är avgörande för utvecklingen av cancer. För att underlätta tumörtillväxt, rekrytera cancerceller inflammatorisk monocyter genom att utsöndra kemotaktisk proteiner. Rekryteras monocyter infiltrera tumören och differentieras till pro-tumörframkallande TAMs som bidrar till tumörtillväxt och metastasering. In vitro studier av immunceller rekrytering utnyttja migration analyser, med Boyden kammare assay som allmänt används14,15,16,17. I denna analys, är korrektiv proteinet källan, till exempel cancerceller eller ett renat protein, placerad i botten kammare. Immunceller är placerade i den övre kammaren separerade med porösa membran från bottenfack. Celler migrerar mot ökande gradient korrektiv, och de som finns på den nedre sidan av membranet är målat och räknade under mikroskopet. Här testar vi funktionen korrektiv av Plasminogen aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) på monocyter genom att generera stabila, inducerbara cancer cell linjer där uttrycket av PAI-1 regleras av doxycyklin tillägg. Vi använder mänskliga primära monocyter i Boyden kammare migration analysen för att bedöma PAI-1 roll i monocyt migration. Skillnader mellan människors primära monocyter och utbredda monocytic cellinjer som THP1 har rapporterats och inkluderar olika cytokin uttryck mönster18; exempelvis 5-10 gånger ökning av TNF-α uttryck nivåer av THP1 celler jämfört med humana monocyter19. THP1 celler härrör från mänskliga leukemiceller monocytic, är lätta att underhålla och föröka med genomsnitt fördubbling tid 19-50 h20. Tvärtom, kännetecknas humana monocyter av en kort livslängd i frånvaro av tillväxtfaktorer. Eftersom monocyter renas från blodet av givare, en hel del variation uppstår bland individerna och beroende på metoden rening, kan kontaminering med andra celltyper inträffa. Ändå primära monocyter är relevanta och har det rekommenderats att använda eller bekräfta de resultat som erhålls med de monocytic cellinjer som använder primära monocyter i biologisk forskning19. Här beskriver vi ett protokoll för rening av människans primära monocyter från perifert blod. Alternativa metoder för monocyt rening inkluderar täthet lutning och vidhäftning protokoll och två steg med enda lutningar av Ficoll-Hypaque följt av en Percoll gradient21. Renhet av monocyt befolkningen erhålls genom dessa metoder varierar mellan 70-90%. Den metod som beskrivs här används en täthetlutning följt av en negativ immun urval22 och möjliggör rening av humana monocyter utan direktkontakt med antikroppar, därmed undvika deras oavsiktlig aktivering och resulterar i en > 95% ren befolkningen av monocyter.
Det protokoll som presenteras här används för att upprätta ett funktionellt Tet-ON system för genuttryck KD i human cancer cellinjer för att studera korrektiv effekten av cancer-derived utsöndrade proteinet PAI-1 på monocyter. PAI-1 förekommer i ökad utsträckning av en mängd olika tumörer och dess uttryck paradoxalt nog korrelerar med dålig kliniskt resultat23,24. PAI-1 pro-tumörframkallande roll är ett resultat av dess proangiogena och anti-apoptotiska funktioner25,26. PAI-1 har visat sig bidra till inflammation genom att främja rekrytering av makrofager till platsen för inflammationen27. PAI-1 visades att främja muskulatur cellmigration28,29 och delta i Mac-1 beroende makrofag migration30. PAI-1 överuttryck har också visat att väsentligt öka rekryteringen av Raw 264,7 makrofager B16F10 melanom tumörer31. Rollen av PAI-1 i TAM migration har dock inte undersökts i detalj. Vi använder protokollet beskrivs för att besvara frågan om huruvida PAI-1 lockar monocyter till cancerceller. Denna metod tillåter dissekering av överhörning mellan tumör och TME genom tysta utsöndrade proteinet i cancerceller och analysera komponenterna i TME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Tet-pLKO-puro lentiviral vector</td>
			<td style="width:177px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">21915</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Tetracycline-free)</td>
			<td style="width:177px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>10771-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td style="width:177px;">StemCell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Magnet</td>
			<td style="width:177px;">StemCell</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI HF</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI HF</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>R3552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cut Smart buffer</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>B7200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System</td>
			<td style="width:177px;">PROMEGA</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX vector</td>
			<td style="width:177px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G vector</td>
			<td style="width:177px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:405px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain</td>
			<td style="width:177px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">123-869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:177px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XhoI restriction enzyme</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase buffer</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA 0.5 M solution</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R1021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td style="width:177px;">Stem Cell</td>
			<td style="width:119px;">18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">0.1% Poly-L-Lysine solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;M syringe filters</td>
			<td style="width:177px;">VWR International</td>
			<td>28145-479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5881-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride(NaCl)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653-5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dithioerythritol (DTE)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B8255-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">792780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tryptone</td>
			<td style="width:177px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">J859-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">yeast extract</td>
			<td style="width:177px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">70161-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ampicillin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9393-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">puromycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R1021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0&#956;m Transparent PET Membrane</td>
			<td style="width:177px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton-Tipped Applicator&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Medline</td>
			<td style="width:119px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protocol Hema 3 STAT pack&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">123-869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Resolve Immersion Oil, High Viscosity</td>
			<td style="width:177px;">Richard Allan Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conditional knockdown of gene expression in cancer cell lines to study the recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment

siRNA och shRNA-medierad knock-down (KD) metoder för reglering av genuttryck är ovärderliga verktyg för att förstå genen och protein funktion. Emellertid i fall att KD av proteinet av intresse har en dödlig effekt på celler eller den förväntade effekten av KD är är tidsberoende, ovillkorlig KD metoder inte lämpliga. Villkorliga system är mer lämpliga i dessa fall och har varit föremål för stort intresse. Dessa inkluderar Ecdysone-inducerbara överuttryck system, cytokrom P450-induktion system1, och tetracyklin reglerad gen uttryck system.
Tetracyklin reglerad gen uttryck systemet möjliggör reversibel kontroll över proteinuttryck genom induktion av shRNA uttryck i närvaro av tetracyklin. I detta protokoll presenterar vi en experimentell design med funktionella Tet-ON system i human cancer cellinjer för villkorlig reglering av genuttryck. Sedan visar vi användningen av detta system i studien av tumör cell-monocyt interaktion.

Tre shRNA sekvenser testades för den mest effektiva KD av PAI-1. För detta, var shRNA sekvenser mot PAI-1 och äggröra (tabell 1) klonad i Tet-pLKO-puro uttryck vektor efter det protokoll som beskrivs ovan. Den HT-1080 fibrosarkom cellinje var stabilt transfekterade med genererade konstruktioner och cellerna behandlades med doxycyklin i 3 dagar. Uttrycket av PAI-1 kontrollerades av Western blotting ()figur 2A) och intensit...

Watch this Scientific Journal Video about Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Detta protokoll fungerar som ett system för att ställa in ett funktionellt Tet-ON system i cancer cellinjer och dess efterföljande användning, i synnerhet för studerar roll för tumör cell-derived proteiner i rekrytering av monocyter/makrofager att den tumör mikromiljö.

Villkorliga Nedslagning av genuttryck i Cancer cellinjer att studera rekrytering av monocyter/makrofager att den tumör mikromiljö

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Lung tumör Cell rekrytering Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal skiva Tumör Modell: Visualisering och kvantifiering av genuttryck och tumör invasiv använda genetiska mosaiker

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Påvisande av mitokondrier membranet Potential att studera CLIC4 Knockdown-inducerad HN4 Cell apoptos In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virus leverans av CRISPR guider till murina prostatan för gen ändring

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Att upprätta cellinjer överuttryck DR3 för att bedöma den apoptotiska svar på anti mitotiska Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Analysera tumör gen uttrycks faktorer med CorExplorer webb Portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombinerad villkorlig Knockdown och anpassad sfärbildning assay att studera en Stemness-Associated Gene av patient-derived Gastric Cancer Stamceller

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...