Name: quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)
Uploaded: 2017-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM at JoVE.com

Die Autoren erkennen die Gordon und Betty Moore Foundation Stipendien 4037 und 4038, California Institute of Technology für die Finanzierung dieser Arbeit.

1. Wachstum und Aufzählung der Bakterien Hinweis: Dies gilt für fast jeder Bakterienstamm in die entsprechende mittlere 36 angebaut. In unserem Beispiel verwenden wir drei Sorten: Serratia Marcescens als eine gemeinsame, leicht identifizierbare Lab Belastung; und ein kleiner, sehr bewegliche Umweltbelastung, Shewanella Oneidensis MR-1. Um die Erkennung von vergleichen bewegliche vs. nicht-bewegliche Zellen, nicht bewegliche Shewanella Mutan...

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	<li>Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Fluorescence+Microscopy+Technique+for+Detecting+Viable+Mycobacterium+avium+ssp.+paratuberculosis+Cells+in+Milk.">Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk.</a> Food Anal. 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Express. 23, 15792-15805 (2015).</li><li>Wallace, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+compact+implementation+of+an+off-axis+digital+holographic+microscope.">Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope.</a> Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).</li><li>Lindensmith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Submersible,+Off-Axis+Holographic+Microscope+for+Detection+of+Microbial+Motility+and+Morphology+in+Aqueous+and+Icy+Environments.">A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments.</a> Plos One. 11, e0147700 (2016).</li><li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. 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Numerische Rekonstruktion von Hologrammen: für die numerische Rekonstruktion von Hologrammen, die eckige Spektrum-Methode (ASM) verwendet. Dies beinhaltet die Faltung des Hologramms mit dem Grün-Funktion für die DHM. Die komplexe Wellenfront des Bildes an eine bestimmte Brennebene kann durch den Einsatz der Fourier-Convolution-Theorem wie folgt berechnet werden:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq2.jpg">(1)
Wo <img alt="Equ...

Bestimmung der genauen bakteriellen zählt in sehr verdünnten Proben ist in vielen Anwendungen von entscheidender Bedeutung: einige Beispiele sind Wasser und Nahrung Qualität Analyse1,2,3; Nachweis von Krankheitserregern in Blut, Liquor cerebrospinalis oder Sputum4,5; Herstellung von pharmazeutischen Produkten, einschließlich steriles Wasser6; und Umwelt-Community-Analyse in oligotrophen Umgebungen wie das offene Meer und Sedimente7,8,9. Es gibt auch immer mehr Interesse an der Erkennung von möglichen erhaltene mikrobielles Leben auf den eisigen Monden von Jupiter und Saturn, besonders Europa10,11 und Enceladus12,13, 14, die bekanntermaßen Untergrund flüssigen Ozeane haben. Weil keine Mission seit Viking 1978 versucht hat, erhaltene Leben auf einem anderen Planeten zu finden, gab es begrenzte Entwicklung der Technologien und Instrumente für bakterielle Identifikation und im Weltraum-Missionen15zählen.
Traditionelle Methoden der Keimzahl finden nur kultivierbare Zellen, die eine Minderheit von Tierarten in ökologischer Belastungen manchmal darstellen können &#60; 1 %16. Platten erfordern Tage oder Wochen Inkubation für maximalen Erfolg, abhängig von der Belastung. Epifluoreszenz Mikroskopie hat weitgehend Platte zählt als Goldstandard für die schnelle und genaue mikrobielle Aufzählung ersetzt. Nukleinsäure-Säure-labeling fluoreszierende Farbstoffe z. B. 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI), SYBR Green oder Acridin Orange, die an Nukleinsäuren binden sind typische verwendeten Farbstoffe17,18,19 , obwohl viele Studien verwenden unterzeichnen fluoreszierende Indikatoren Gramm20,21,22,23,24. Mit diesen Methoden ohne Vorkonzentrierung Stufen führt zu Nachweisgrenzen (DGS) ~ 105 Zellen pro mL. Verbesserungen in der DG sind mit Filterung möglich. Eine flüssige Probe wird Vakuum gefiltert auf eine Membran, in der Regel aus Polycarbonat und idealerweise schwarz, Hintergrund zu reduzieren. Low-Hintergrund Farbstoffe wie die oben genannten DNA-Flecken direkt auf den Filter25angewendet werden können. Für die genaue Zählung vom Auge, ~ 105 Zellen pro Filter, was, dass für mehr als 10 ~5 Zellen pro mL verdünnten Proben bedeutet erforderlich sind, erhebliche Probenvolumina gesammelt und gefiltert werden müssen. Laserscanning-Geräte wurden entwickelt, um systematisch erkunden alle Regionen des Filters und reduzieren damit die Anzahl der Zellen erforderlich für die Zählung, Nachweisgrenzen bis zu ~ 102 Zellen pro mL26schieben. Aber diese sind nicht verfügbar in den meisten Labors und benötigen anspruchsvolle Hardware als auch Software, die Experten Bestätigung zu erlauben, die Partikel beobachtet Bakterien und keine Ablagerungen sind.
Als Referenz, Erwachsene mit Sepsis zeigen Symptome bei in der Regel beginnen &#60; 100 Zellen/mL Blut und Säuglinge bei &#60; 10 Zellen/mL. Eine Blutprobe von einem Erwachsenen dauert 10 mL, und von einem Kleinkind, 1 mL. PCR-basierte Methoden sind durch die Anwesenheit von menschlichen und nicht-pathogenen Flora DNA und durch Hemmung der PCR-Komponenten in der Blut-27,-28gehemmt. Trotz einer Vielzahl von Zukunftstechniken bleiben Kulturen der Goldstandard für die Diagnose der Blutbahn Infektionen, vor allem in ländlichen Gebieten oder sich entwickelnden Nationen. Für die Erkennung von Leben auf anderen Planeten können Thermodynamische Berechnungen den Energiehaushalt und damit die erwarteten möglich Biomasse abschätzen. 1 - 100 Zellen/mL sollen thermodynamisch günstigen auf Europa29sein. Es ist leicht aus diesen Zahlen ersichtlich, Erkennung von sehr kleinen Zahl von Zellen in großen Mengen wässrigen Lösung eine wichtige ungelöste Problem ist.
In diesem Beitrag zeigen wir Erkennung von Serratia Marcescens und Shewanella Oneidensis (Wildtyp und nicht bewegliche Mutant) bei Konzentrationen von 105, 104, 103und 100 Zellen/mL über eine off-Axis holographische Digitalmikroskop (DHM). Der entscheidende Vorteil des DHM über traditionelle Lichtmikroskopie ist die gleichzeitige Darstellung der dicken Probenvolumen mit hoher Auflösung – in dieser Implementierung wurde die Probenkammer 0,8 mm dick. Diese Probenkammern entstanden durch die Soft-Lithographie von Polydimethylsiloxan (PDMS) aus einer Präzision bearbeitete Aluminium-Form mit einer Toleranz von ± 50 µm. Dies entspricht einer ca. 100-fold Verbesserung in der Tiefe des Feldes über Hochleistungs-Lichtmikroskopie. DHM bietet auch quantitative Phaseninformationen ermöglicht Messungen der optischen Weglänge (Produkt aus Brechungsindex und Dicke). DHM und ähnliche Techniken sind verwendet worden, für die Überwachung der Bakterien und Hefe Zellzyklus und Berechnung der bakteriellen trockene Masse30,31,32; Streuung Unterschiede können auch verwendet werden, um Bakterienstämme33zu unterscheiden.
Das Instrument, das wir verwenden ist speziell für den Einsatz mit Mikroorganismen, wie zuvor veröffentlichten34,35, nach Mass und seine Architektur und Konstruktion werden gezeigt und diskutiert. Wässrige Lösungen sind eine 0,25 µL Volumen Probenraum über Spritzenpumpe kontinuierlich zugeführt; die Durchflussrate richtet sich nach Kamera-Frame-Rate um Bildgebung des gesamten Probenvolumen zu gewährleisten. Eine statistische Berechnung prognostiziert die Anzahl der Probenvolumina, die abgebildet werden müssen, um eine beträchtliche Anzahl von Zellen in einer bestimmten Konzentration zu erkennen.
Für Handy-Anwendungen war die Rekonstruktion der Hologramme in Amplitude und Phase Bilder nicht erforderlich; Analyse wurde auf das rohe Hologramm durchgeführt. Das spart erhebliche Rechenressourcen und Speicherplatz: 500 Mb Hologramm video 1-2 Tb bei rekonstruiert werden. Jedoch diskutieren wir Rekonstruktion durch Tiefe der Probe zu bestätigen, dass die Hologramme die gewünschten Arten vertreten. Ein wichtiges Merkmal des DHM ist seine Fähigkeit, Intensität und Phase der Bilder zu überwachen. Organismen, die nahezu transparent in ihrer Intensität (wie die meisten biologischen Zellen) sind eindeutig in Phase angezeigt. Da es eine markierungsfreie Technik ist, werden keine Farbstoffe eingesetzt. Dies ist ein einDvantage für möglich Raumfahrt-Anwendungen, da Farbstoffe nicht die Voraussetzungen einer Mission überleben können und – noch wichtiger ist – kann nicht davon ausgegangen werden, mit Außerirdischen Organismen arbeiten, die nicht für die Codierung von DNA oder RNA nutzen dürfen. Es ist auch ein Vorteil für die Arbeit in extremen Umgebungen wie der Arktis und Antarktis, wo Farbstoffe können schwierig sein, zu der abgelegenen Lage bringen und bei der Lagerung beeinträchtigen können. Rekonstruktion von Bildern in Phase und Amplitude erfolgt mithilfe einer Open-Source-Software-Pakets, die wir auf GitHub (SHAMPOO) zur Verfügung gestellt haben oder ImageJ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7710</td>
			<td>Many options for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10053-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon (Corning Life Sciences)</td>
			<td>352002</td>
			<td>Loose-capped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hauser chamber</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td>Luer-Lok tip not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to 1/16&#8221; barbed fitting</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable 1/16&#8221; ID PVC tubing for flow</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>8000-0004</td>
			<td>Sold by length, purchase accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Materials Section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holographic Microscope</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Wallace et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-source software</td>
			<td>Custom</td>
			<td>https://github.com/bmorris3/shampoo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)

Genau erkennen und zählen spärliche bakterielle Proben hat viele Anwendungen in der Lebensmittel-, Getränke- und pharmazeutischen Industrie, in der medizinischen Diagnostik und für die Lebens-Erkennung von unbemannten Missionen zu anderen Planeten und Monde des Sonnensystems. Derzeit sind spärliche bakterielle Proben von Kultur-Beschichtung oder Epifluoreszenz Mikroskopie gezählt. Kultur-Platten erfordern lange Inkubationszeit Zeit (Tage bis Wochen) und Epifluoreszenz Mikroskopie erfordert umfangreiche Färbung und Konzentration der Probe. Hier zeigen wir wie einfallenden digitalen holographischen Mikroskopie (DHM) zum Auflisten von Bakterien in sehr verdünnter Kulturen (100-104 Zellen/mL). Erstens ist der Bau von benutzerdefinierten DHM zusammen mit detaillierten Anweisungen auf den Aufbau einer kostengünstigen Instrument diskutiert. Die Grundsätze der Holographie werden besprochen, und ein statistisches Modell wird verwendet, um abzuschätzen, wie lange Videos sollte sein, Zellen, basierend auf die optische Leistungsmerkmale des Instruments und die Konzentration der bakterielle Lösung (Tabelle 2) zu erkennen . Videoerkennung von Zellen bei 105, 104, 103und 100 Zellen/mL zeigt sich in Echtzeit mit UN-rekonstruierten Hologrammen. Rekonstruktion von Amplitude und Phase Bildern zeigt sich mit einer Open-Source-Software-Paket.

Die Ergebnisse sollten die Möglichkeit, lebende und tote Bakterien auf einem sehr niedrigen Niveau von DHM zu erkennen geben. Die Anzahl der Bakterien gezählt sollte mit der erzielten Ergebnisse mit Petroff-Hauser zählen Industrie- und Platte Grafen übereinstimmen. Statistische Standardmethoden bieten Informationen über die Genauigkeit der verschiedenen Nachweismethoden bei verschiedenen bakteriellen Konzentrationen.
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Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digitaler holographischer Mikroskopie (DHM) ist eine volumetrische Technik, die können bildgebende Proben, die 50-100 X dicker als Hellfeld Mikroskopieren mit vergleichbarer Auflösung, mit der Fokussierung durchgeführt Nachbearbeitung. Hier DHM dient zur Identifizierung, zählen, und verfolgen Mikroorganismen bei sehr niedrigen dichten und verglichen mit optischen Dichtemessungen, Keimzahl und direkte Zählung.

Quantifizierung von Mikroorganismen in geringen Konzentrationen mit Hilfe digitalen holographischen Mikroskopie (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Forschung

Biotechnik

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The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
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