Name: quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)
Uploaded: 2017-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM at JoVE.com

המחברים להכיר את גורדון ואת בטי מור קרן מענקים 4037 4038 אל המכון הטכנולוגי של קליפורניה למימון העבודה הזאת.

1. וצמיחה של ספירה של חיידקים הערה: זה חל על כמעט כל זן חיידקי גדל בינונית המתאימה 36. בדוגמה שלנו, אנו משתמשים שלושה זנים: בסרישיה marcescens כמו זן נפוץ, קל לזיהוי המעבדה; קטן יותר, מאוד תאי סביבתיים זן, מר Shewanella oneidensis-1. כדי להשוות בין גילוי של תאי לעומת בתאים ?...

<ol>
	<li>Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Fluorescence+Microscopy+Technique+for+Detecting+Viable+Mycobacterium+avium+ssp.+paratuberculosis+Cells+in+Milk.">Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk.</a> Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).</li><li>Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+total+aerobic+microbial+counts+on+meat+and+in+meat+products+by+means+of+the+direct+epifluorescence+filter+technique.">Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique.</a> Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).</li><li>Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enumeration+of+Salmonella+on+sample+slides+of+poultry+carcass+wash+water+using+image+analysis+with+fluorescent+microscopy.">Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy.</a> Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).</li><li>Durtschi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+bacterial+detection+in+cerebrospinal+fluid+by+fluorescent+staining+on+low-fluorescence+membrane+filters.">Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters.</a> J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).</li><li>Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Automatic+Methods+Based+on+Image+Processing+Techniques+for+Tuberculosis+Detection+from+Microscopic+Sputum+Smear+Images.">A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images.</a> J Med Syst. 40, (2016).</li><li>Riepl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+solid-phase+cytometry+and+epifluorescence+microscopy+for+rapid+assessment+of+the+microbiological+quality+of+dialysis+water.">Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water.</a> Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).</li><li>Hwang, C. Y., Cho, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-infected+bacteria+in+oligotrophic+open+waters+of+the+East+Sea,+Korea.">Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea.</a> Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).</li><li>Kepner, R. L., Pratt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorochromes+for+Direct+Enumeration+of+Total+Bacteria+in+Environmental-Samples+-+Past+and+Present.">Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present.</a> Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).</li><li>Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+rapid+direct+viable+count+method+to+deep-sea+sediment+bacteria.">Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria.</a> J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).</li><li>Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+detection+of+putative+life+on+Europa.">Strategies for detection of putative life on Europa.</a> Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).</li><li>Gleeson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosignature+Detection+at+an+Arctic+Analog+to+Europa.">Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa.</a> Astrobiology. 12, 135-150 (2012).</li><li>Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).</li><li>Konstantinidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lander+mission+to+probe+subglacial+water+on+Saturn's+moon+Enceladus+for+life.">A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life.</a> Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).</li><li>McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow+the+Plume:+The+Habitability+of+Enceladus.">Follow the Plume: The Habitability of Enceladus.</a> Astrobiology. 14, 352-355 (2014).</li><li>Hoover, R. B., Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. , (2015).</li><li>Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics:+application+of+genomics+to+uncultured+microorganisms.">Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms.</a> Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).</li><li>Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blue+nucleic+acid+dyes+for+flow+cytometric+enumeration+of+bacteria+in+aquatic+systems.">Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).</li><li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I.">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fluorescent+gram+staining+and+activity+assessment+of+activated+sludge+bacteria.">Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).</li><li>Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+Of+Acridine-Orange+And+Gram+Stains+For+Detection+Of+Microorganisms+In+Cerebrospinal-Fluid+And+Other+Clinical+Specimens.">Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).</li><li>Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+gram+stain+for+flow+cytometry+and+epifluorescence+microscopy.">A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).</li><li>Saida, H., Ytow, N., Seki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photometric+application+of+the+Gram+stain+method+to+characterize+natural+bacterial+populations+in+aquatic+environments.">Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).</li><li>Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternate+Gram+Staining+Technique+Using+A+Fluorescent+Lectin.">Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin.</a> Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).</li><li>Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Rapid+Technique+For+Counting+Microorganisms+Directly+On+Membrane+Filters.">New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters.</a> Stain Technology. 58, 343-346 (1983).</li><li>Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+staining+and+enumeration+of+small+numbers+of+total+bacteria+in+water+by+solid-phase+laser+cytometry.">Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).</li><li>Yagupsky, P., Nolte, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+aspects+of+septicemia.">Quantitative aspects of septicemia.</a> Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).</li><li>Kang, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+single+bacteria+in+unprocessed+blood+using+Integrated+Comprehensive+Droplet+Digital+Detection.">Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection.</a> Nat Commun. 5, 5427 (2014).</li><li>Hand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).</li><li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).</li><li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+characterization+of+the+fission+yeast+cell+cycle+by+monitoring+dry+mass+with+digital+holographic+microscopy.">Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy.</a> J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).</li><li>Jo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+identification+of+individual+bacteria+using+Fourier+transform+light+scattering.">Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering.</a> Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).</li><li>Wallace, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+compact+implementation+of+an+off-axis+digital+holographic+microscope.">Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope.</a> Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).</li><li>Lindensmith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Submersible,+Off-Axis+Holographic+Microscope+for+Detection+of+Microbial+Motility+and+Morphology+in+Aqueous+and+Icy+Environments.">A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments.</a> Plos One. 11, e0147700 (2016).</li><li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains.">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li><li>Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+flgM,+a+gene+encoding+the+anti-sigma+28+factor+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).</li><li>Adler, J., Templeton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+environmental+conditions+on+the+motility+of+Escherichia+coli.">The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli.</a> Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).</li><li>Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+wave+propagation+in+Image+J.">Numerical wave propagation in Image J.</a> Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).</li><li>Schnars, U., J&#252;ptner, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+recording+and+numerical+reconstruction+of+holograms.">Digital recording and numerical reconstruction of holograms.</a> Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).</li></ol>

שחזור המספרי של הולוגרמות: את שיקומה המספרי של הולוגרמות, משמשת השיטה ספקטרום זוויתי (ASM). פעולה זו כרוכה קונבולוציה של ההולוגרמה עם פונקציית גרין עבור סוג התושבות שלהם מופיעים. ניתן לחשב את חזית גל מורכבים של התמונה-מטוס מוקד מסוים על ידי העסקת את משפט קונבולוציה פורייה כדלקמן:
...

הנחישות של ספירת חיידקים מדויק בדגימות שתדללו מאוד חיוני ביישומים רבים: כמה דוגמאות מים ומזון באיכות ניתוח1,2,3; זיהוי של פתוגנים דם, נוזל מוחי שדרתי או sputum4,5; ייצור של מוצרים פרמצבטיים, כולל במים סטריליים6; וניתוח סביבתי קהילתי בסביבות oligotrophic כגון פתוח האוקיינוס ואת משקעים7,8,9. גם גוברת ההתעניינות גילוי החיים מיקרוביאלי אפשרי הקיימים על הירחים הקפואים של יופיטר ושבתאי, במיוחד Europa10,11 ו-12,אנקלדוס13, 14, אשר ידועים מהסבא האוקיינוסים נוזלי. כי אין משימה מאז ויקינג בשנת 1978 ניסתה למצוא הקיימים חיים בכוכב אחר, חלה התפתחות מוגבלת של טכנולוגיות וכלים עבור זיהוי חיידקים וספירת במהלך משימות שטח15.
שיטות מסורתיות של הרוזן הצלחת למצוא רק culturable תאים, אשר יכולים לייצג מיעוט של מינים של זנים סביבתיים, לפעמים &#60; 1%16. צלחות דורשים ימים או שבועות של דגירה להצלחה מקסימלית, כתלות במתח. מיקרוסקופ Epifluorescence החליף במידה רבה צלחת ספירות כמו תקן זהב עבור ספירת חיידקים מהיר ומדויק. גרעין-חומצה-תיוג צבעי פלורסנט כגון 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי), SYBR ירוק או כתום acridine זה לאגד חומצות גרעין הן צבע אופייני בשימוש17,18,19 , על פי מחקרים רבים להשתמש ניאון שילוט גרם לחתום20,21,22,23,24. בשיטות אלה ללא ריכוז שלפני מדרגות מוביל אל הגבולות של זיהוי (LoDs) של תאי5 ~ 10 מ"ל. שיפורים בלוד אפשריים באמצעות סינון. דגימת נוזל היא ואקום-מסוננים על גבי הממברנה, בדרך כלל פוליקרבונט ושחור אידיאלי כדי להפחית את הרקע. נמוך-רקע צבענים כמו הכתמים DNA הנ ל ניתן להחיל ישירות את המסנן25. עבור ספירה מדויקת לפי העין, תאים5 ~ 10 נדרשים לכל מסנן, ופירוש לדוגמאות ובדילול מאשר תאי5 ~ 10 מ"ל, דגימה משמעותי חייב להיות שנאספו ואמצעי סינון. מכשירי סריקה בלייזר פותחו על מנת לחקור באופן שיטתי את כל האזורים של המסנן, וכך להפחית את מספר התאים הדרושים עבור ספירה, דוחפים את הגבולות של זיהוי אל תאי2 ~ 10 מ ל26. עם זאת, אלה לא יהיו זמינות, במעבדות רוב והן דורשות חומרה מתוחכמים כמו גם תוכנה כי היתר אישור מומחה כי נצפתה חלקיקים הם חיידקים ופסולת לא.
לעיון, מבוגרים עם אלח דם בדרך כלל מתחילים להופיע התסמינים-&#60; 100 תאים למ"ל של דם, ותינוקות -&#60; 10 תאים/מ ל. תיקו דם במבוגר לוקח 10 מ"ל, וממנו תינוק, 1 מ"ל. שיטות מבוססות-PCR מעוכבים על ידי הנוכחות של פלורה פתוגניים שאינם ואנושי DNA על ידי עיכוב PCR הרכיבים השונים הדם27,28. למרות מגוון רחב של טכניקות המתעוררים, תרבויות נשארים תקן הזהב לאבחון של זיהומים למחזור הדם, ובמיוחד באזורים הכפריים יותר או מדינות מתפתחות. גילוי של חיים על כוכבים אחרים, חישובים תרמודינמי יכולים להעריך את התקציב אנרגיה עבור החיים ובכך ביומסה אפשרי הצפוי. 1 - תאים למ"ל 100 צפויים להיות הגיוני למה ב- Europa29. ניתן בקלות לראות ממספרים אלה כי זיהוי של מספר קטן מאוד של תאים של כמויות גדולות של תמיסה מימית היא בעיה לא פתורה חשוב.
בנייר זה, נדגים זיהוי של סרישיה marcescens , Shewanella oneidensis (מוטציה פראי-סוג, שאינם תאי) בריכוזים של 105, 104, 103ו- 100 תאים למ"ל באמצעות ציר. מיקרוסקופ הולוגרפית דיגיטלי (סוג התושבות שלהם. מופיעים). היתרון המפתח של סוג התושבות שלהם מופיעים על מיקרוסקופ אור המסורתית היא ההדמיה סימולטני של אמצעי אחסון מדגם עבה ברזולוציה גבוהה — ביישום זה, היה תא הדגימה בעובי 0.8 מ מ. צ'יימברס דוגמת אלה נבנו על ידי הרך-ליתוגרפיה של polydimethylsiloxane (PDMS) של תבנית אלומיניום במכונה-דיוק עם סובלנות של ± 50 מיקרומטר. זה מייצג שיפור כ 100-fold לעומק של שדה מעל ובעוצמת מיקרוסקופ אור. סוג התושבות שלהם מופיעים גם מספקת מידע שלב כמותית, המאפשרות מדידות של מרחק אופטי (מוצר של שבירה, עובי). סוג התושבות שלהם מופיעים ובטכניקות דומות שימשו עבור ניטור בקטריאלי, מחזור התא שמרים, חישוב של חיידקי יבש המונים30,31,32; פיזור ההבדלים עשוי לשמש גם כדי להבדיל בין זני חיידקים33.
המכשיר שנשתמש שהותקן במיוחד לשימוש עם מיקרואורגניזמים, שפורסמו בעבר34,35, תכנון ובנייה, הם הפגינו ודן. פתרונות מימית מסופקים ללא הרף לתא 0.25 µL נפח דגימה באמצעות משאבת מזרק; קצב הזרימה נקבעת על ידי קצב מסגרות המצלמה כדי להבטיח הדמיה של אמצעי האחסון מדגם כולו. חישוב סטטיסטי מנבאת את מספר אמצעי האחסון מדגם חייב לדימות כדי לזהות מספר משמעותי של תאים על ריכוז נתון.
ליישומים זיהוי תא, לא היה שחזור של הולוגרמות לתוך משרעת ותמונות שלב הכרחי; הניתוח בוצע על ההולוגרמה raw. פעולה זו חוסכת שטח דיסק ומשאבים רבים חישובית: הולוגרמה 500 מגה וידאו יהיה 1-2 טרה-בתים כאשר שיחזר. עם זאת, נדון שחזור באמצעות עומק של הדגימה כדי לאשר כי הולוגרמות מייצגים את המין הרצוי. תכונה חשובה של סוג התושבות שלהם מופיעים הוא יכולתה לפקח הן בעוצמה והן שלב של התמונות. אורגניזמים שקופים כמעט בעוצמת (כמו רוב התאים ביולוגי) מופיעים בבירור שלב. כמו היא טכניקה ללא תווית, אין צבעים משמשים. . זהdvantage ליישומים טיסת חלל אפשרי, מאחר צבעי עלול לא לשרוד את התנאים של משימה, — וחשוב מכך – אי אפשר להניח לעבוד עם אורגניזמים מחוץ לכדור הארץ, אשר רשאי להשתמש DNA או RNA לקידוד. . זה גם יתרון לעבודה בסביבות קיצוניות כגון הקוטב הדרומי, שבו צבע עלול להיות קשה להביא את המיקום המרוחק ו עלולה להיפגם בעת אחסון... שחזור של תמונות לתוך שלב משרעת מתבצע באמצעות חבילת תוכנות קוד פתוח שאנחנו עשינו הזמינים ב GitHub (שמפו) או באמצעות ImageJ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7710</td>
			<td>Many options for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10053-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon (Corning Life Sciences)</td>
			<td>352002</td>
			<td>Loose-capped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hauser chamber</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td>Luer-Lok tip not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to 1/16&#8221; barbed fitting</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable 1/16&#8221; ID PVC tubing for flow</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>8000-0004</td>
			<td>Sold by length, purchase accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Materials Section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holographic Microscope</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Wallace et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-source software</td>
			<td>Custom</td>
			<td>https://github.com/bmorris3/shampoo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)

זיהוי וספירת דגימות בקטריאליות דליל במדויק היא נדבך מזון ומשקאות, תעשיות התרופות עיבוד, בתוכנית האבחון הרפואי, ועל גילוי החיים על ידי משימות רובוטיות אחרות כוכבי לכת, ירחים של מערכת השמש. כיום, דגימות בקטריאליות דליל נספרים על ידי מיקרוסקופ ציפוי או epifluorescence תרבות. תרבות צלחות דורשים זמן דגירה פעמים (ימים עד שבועות), ודורש מיקרוסקופ epifluorescence מכתים נרחב וריכוז של המדגם. . הנה, נדגים כיצד להשתמש מהציר דיגיטלי מיקרוסקופ הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים) כדי ספירת חיידקים בתרבויות שתדללו מאוד (100-104 תאים/mL). ראשית, נדון הקמת סוג התושבות שלהם מופיעים מותאם אישית, יחד עם הוראות מפורטות על בניית כלי נגינה בעלות נמוכה. העקרונות של הולוגרפיה נידונות, ומשמשת מודל סטטיסטי כדי להעריך כמה זמן צריך קטעי וידאו ניתן לזהות תאים, בהתבסס על מאפייני ביצועים אופטיים של המכשיר ועל הריכוז של הפתרון חיידקי (טבלה 2) . זיהוי וידאו של תאים ב-105, 104, 103ותאים למ"ל 100 הוכח בזמן אמת באמצעות הולוגרמות האו ם המשוחזרת. שחזור של משרעת ותמונות שלב הוא הפגין באמצעות חבילת תוכנות קוד פתוח.

התוצאות צריך לציין את היכולת לזהות חיידקים חי וגם מת ברמות נמוכות מאוד על ידי סוג התושבות שלהם מופיעים. מספר החיידקים נספרים צריך להיות עקבי עם התוצאות המתקבלות באמצעות Petroff-האוזר הספירה קאמרית וצלחת הסעיפים. שיטות סטטיסטיות סטנדרטי לספק מידע על הדיוק של שיטות זיהוי שונ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM at JoVE.com

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים) היא טכניקה הנפחי המאפשרת הדמיה דגימות ש-50-100 X עבה יותר brightfield מיקרוסקופ ברזולוציה דומות, עם התמקדות ביצע עיבוד דפוס. כאן סוג התושבות שלהם מופיעים משמש לזיהוי, סופר, ומעקב מיקרואורגניזמים-מאוד נמוך צפיפות לעומת מדידות צפיפות אופטית צלחת ספירה, ספירה ישירה.

לכימות מיקרואורגניזמים בריכוזים נמוכים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

אינדוקציה של אותות הדבקה תלויי שימוש בעוצמה נמוכה אולטראסאונד

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; להנדסת רקמות עור

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

רוד מבוססי ייצור של מכשירים גריפר פניאומטיים רובוטית להתאמה אישית רך עבור מניפולציה רקמה עדינה

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...