Name: quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)
Uploaded: 2017-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM at JoVE.com

Forfatterne bekrefter Gordon og Betty Moore Foundation gir 4037 og 4038 til ved California Institute of Technology for finansiering dette arbeidet.

1. vekst og opplisting av bakterier Merk: Dette gjelder for nesten alle bakterielle belastningen vokst i den aktuelle middels 36. I vårt eksempel, bruker vi tre stammer: Serratia marcescens som en vanlig, lett identifiserbare lab stamme; og en mindre, svært motile miljømessige belastninger, Shewanella oneidensis MR-1. Hvis du vil sammenligne påvisning av motile vs ikke-motile celler, ikke-motile Shewanella mutant, Δ FlgM, brukes også fo...

<ol>
	<li>Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Fluorescence+Microscopy+Technique+for+Detecting+Viable+Mycobacterium+avium+ssp.+paratuberculosis+Cells+in+Milk.">Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk.</a> Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).</li><li>Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+total+aerobic+microbial+counts+on+meat+and+in+meat+products+by+means+of+the+direct+epifluorescence+filter+technique.">Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique.</a> Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).</li><li>Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enumeration+of+Salmonella+on+sample+slides+of+poultry+carcass+wash+water+using+image+analysis+with+fluorescent+microscopy.">Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy.</a> Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).</li><li>Durtschi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+bacterial+detection+in+cerebrospinal+fluid+by+fluorescent+staining+on+low-fluorescence+membrane+filters.">Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters.</a> J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).</li><li>Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Automatic+Methods+Based+on+Image+Processing+Techniques+for+Tuberculosis+Detection+from+Microscopic+Sputum+Smear+Images.">A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images.</a> J Med Syst. 40, (2016).</li><li>Riepl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+solid-phase+cytometry+and+epifluorescence+microscopy+for+rapid+assessment+of+the+microbiological+quality+of+dialysis+water.">Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water.</a> Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).</li><li>Hwang, C. Y., Cho, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-infected+bacteria+in+oligotrophic+open+waters+of+the+East+Sea,+Korea.">Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea.</a> Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).</li><li>Kepner, R. L., Pratt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorochromes+for+Direct+Enumeration+of+Total+Bacteria+in+Environmental-Samples+-+Past+and+Present.">Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present.</a> Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).</li><li>Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+rapid+direct+viable+count+method+to+deep-sea+sediment+bacteria.">Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria.</a> J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).</li><li>Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+detection+of+putative+life+on+Europa.">Strategies for detection of putative life on Europa.</a> Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).</li><li>Gleeson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosignature+Detection+at+an+Arctic+Analog+to+Europa.">Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa.</a> Astrobiology. 12, 135-150 (2012).</li><li>Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).</li><li>Konstantinidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lander+mission+to+probe+subglacial+water+on+Saturn's+moon+Enceladus+for+life.">A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life.</a> Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).</li><li>McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow+the+Plume:+The+Habitability+of+Enceladus.">Follow the Plume: The Habitability of Enceladus.</a> Astrobiology. 14, 352-355 (2014).</li><li>Hoover, R. B., Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. , (2015).</li><li>Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics:+application+of+genomics+to+uncultured+microorganisms.">Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms.</a> Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).</li><li>Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blue+nucleic+acid+dyes+for+flow+cytometric+enumeration+of+bacteria+in+aquatic+systems.">Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).</li><li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I.">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fluorescent+gram+staining+and+activity+assessment+of+activated+sludge+bacteria.">Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).</li><li>Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+Of+Acridine-Orange+And+Gram+Stains+For+Detection+Of+Microorganisms+In+Cerebrospinal-Fluid+And+Other+Clinical+Specimens.">Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).</li><li>Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+gram+stain+for+flow+cytometry+and+epifluorescence+microscopy.">A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).</li><li>Saida, H., Ytow, N., Seki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photometric+application+of+the+Gram+stain+method+to+characterize+natural+bacterial+populations+in+aquatic+environments.">Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).</li><li>Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternate+Gram+Staining+Technique+Using+A+Fluorescent+Lectin.">Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin.</a> Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).</li><li>Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Rapid+Technique+For+Counting+Microorganisms+Directly+On+Membrane+Filters.">New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters.</a> Stain Technology. 58, 343-346 (1983).</li><li>Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+staining+and+enumeration+of+small+numbers+of+total+bacteria+in+water+by+solid-phase+laser+cytometry.">Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).</li><li>Yagupsky, P., Nolte, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+aspects+of+septicemia.">Quantitative aspects of septicemia.</a> Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).</li><li>Kang, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+single+bacteria+in+unprocessed+blood+using+Integrated+Comprehensive+Droplet+Digital+Detection.">Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection.</a> Nat Commun. 5, 5427 (2014).</li><li>Hand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).</li><li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).</li><li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+characterization+of+the+fission+yeast+cell+cycle+by+monitoring+dry+mass+with+digital+holographic+microscopy.">Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy.</a> J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).</li><li>Jo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+identification+of+individual+bacteria+using+Fourier+transform+light+scattering.">Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering.</a> Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).</li><li>Wallace, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+compact+implementation+of+an+off-axis+digital+holographic+microscope.">Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope.</a> Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).</li><li>Lindensmith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Submersible,+Off-Axis+Holographic+Microscope+for+Detection+of+Microbial+Motility+and+Morphology+in+Aqueous+and+Icy+Environments.">A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments.</a> Plos One. 11, e0147700 (2016).</li><li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains.">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li><li>Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+flgM,+a+gene+encoding+the+anti-sigma+28+factor+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).</li><li>Adler, J., Templeton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+environmental+conditions+on+the+motility+of+Escherichia+coli.">The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli.</a> Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).</li><li>Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+wave+propagation+in+Image+J.">Numerical wave propagation in Image J.</a> Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).</li><li>Schnars, U., J&#252;ptner, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+recording+and+numerical+reconstruction+of+holograms.">Digital recording and numerical reconstruction of holograms.</a> Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).</li></ol>

Numerisk rekonstruksjon av hologrammer: For numeriske gjenoppbyggingen av hologrammer, brukes metoden kantete spektrum (ASM). Dette innebærer convolution av hologrammet med Green funksjon for DHM. Den komplekse wavefront av bildet til en bestemt fokalplanet kan beregnes ved hjelp av Fourier Convolution teoremet som følger:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq2.jpg">(1)
Hvor <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56343/5...

Fastsettelse av nøyaktig bakteriell teller i svært fortynne prøver er avgjørende i mange programmer: noen eksempler er vann og mat kvalitet analyse1,2,3; påvisning av patogener i blodet, Cerebrospinalvæske eller sputum4,5; produksjon av farmasøytiske produkter, inkludert sterilt vann6; og miljømessige samfunnet analyse i næringsfattig miljøer som det åpne havet og sedimenter7,8,9. Det er også økende interesse for påvisning av mulig bevarte mikrobiell livet på isete månene til Jupiter og Saturn, spesielt Europa10,11 og Enceladus12,13, 14, som er kjent for å ha undergrunnen flytende hav. Fordi ingen misjon siden Viking i 1978 har forsøkt å finne bevarte livet på en annen planet, har det vært begrenset utvikling av teknologier og instrumenter for bakteriell identifikasjon og opptelling under plass oppdrag15.
Tradisjonelle metoder for plate teller finner bare culturable celler, som kan representere et mindretall av artene i miljømessige belastninger, noen ganger &#60; 1%16. Plater krever dager eller uker med inkubering for maksimal suksess, avhengig av belastningen. Epifluorescence mikroskopi har i stor grad erstattet plate teller som gullstandarden for rask og nøyaktig mikrobiell opplisting. Nucleic acid-typen fluorescerende fargestoffer som 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR Green eller Akridin oransje som binder til nukleinsyrer er typisk fargestoffer brukes17,18,19 , selv om mange studier bruke fluorescerende indikatorer på Gram signere20,21,22,23,24. Ved hjelp av disse metodene uten pre konsentrasjon trinn fører til grensene for påvisning (LoDs) ~ 105 celler per mL. Forbedringer i LoD er mulig å bruke filtrering. En flytende prøven er vakuum-filtrert på en membran, vanligvis polykarbonat og ideelt svart å redusere bakgrunnen. Lav-bakgrunn fargestoffer som DNA flekker nevnt ovenfor kan brukes direkte på filteret25. For nøyaktig telling av øyet, ~ 105 celler kreves per filter, noe som betyr at for prøver mer fortynne enn ~ 105 celler per mL, signifikant utvalg volumer må samles og filtrert. Laser-skanning enheter er utviklet for å systematisk utforske alle regioner av filteret og dermed redusere antall celler kreves for opptelling, skyve grensene for gjenkjenning ned ~ 102 celler per mL26. Men dette er ikke tilgjengelig i de fleste laboratorier, og krever avansert maskinvare samt programvare som tillater ekspert bekreftelse på at observert partikler er bakterier og ikke rusk.
For referanse, voksne med sepsis begynner vanligvis viser symptomer på &#60; 100 celler/mL blod og spedbarn på &#60; 10 celler/mL. Uavgjort blod fra en voksen tar 10 mL, og fra et spedbarn, 1 mL. PCR-baserte metoder er hemmet av tilstedeværelsen av menneskelige og ikke-patogene flora DNA og PCR-hemmende komponenter i blod27,28. Til tross for en rekke nye teknikker fortsatt kulturer gullstandarden for diagnostisering av blodbanen infeksjoner, spesielt i mer landlige områder eller utviklingsland. Deteksjon av liv på andre planeter, kan termodynamisk beregninger beregne energi budsjettet for livet og dermed forventet mulig biomasse. 1 - 100 celler/mL forventes å være thermodynamically rimelig Europa29. Det kan lett sees fra disse tallene at påvisning av svært små tall i celler i store mengder vandig løsning er et viktig uløste problemet.
Dette papiret, vi viser deteksjon av Serratia marcescens og Shewanella oneidensis (vill-type og ikke-motile mutant) i konsentrasjoner av 105, 104, 103og 100 celler/mL bruker en off-aksen Digital holografiske mikroskopet (DHM). Den viktigste fordelen med DHM over tradisjonelle * lys er samtidige avbilding av en tykk eksempel volum med høy oppløsning-i denne implementeringen, prøve chamber var 0,8 mm tykk. Disse sample chambers ble konstruert av soft-litografi av polydimethylsiloxane (PDMS) fra en presisjons-maskinert aluminium mugg med en toleranse for ± 50 µm. Dette representerer en omtrent 100 ganger forbedring i dybden av feltet over høyeffekts * lys. DHM gir også kvantitativ informasjon, slik at for målinger av optisk banelengde (produkt brytningsindeks og tykkelse). DHM og lignende teknikker har blitt brukt for overvåking bakteriell og gjær celle syklus og beregning av bakteriell tørr masse30,31,32; spredning forskjeller kan også brukes til å skille bakteriell stammer33.
Instrumentet vi bruker er spesialbygd for bruk med mikroorganismer, som er publisert tidligere34,35, og design og konstruksjon er viste og diskutert. Vandige løsninger leveres kontinuerlig til en 0,25 µL volum eksempel kammer via sprøytepumpe; infusjonshastigheten bestemmes av kameraet bildefrekvens for å sikre bildebehandling av hele prøven. En statistisk beregning spår antall eksempel volumer som må avbildes for å oppdage et betydelig antall celler i en gitt konsentrasjon.
For celle-gjenkjenning programmer var rekonstruksjon av holograms i amplitude og fase bilder ikke nødvendig; analyse var utført på rå hologrammet. Dette sparer betydelige beregningsressurser og diskplass: et 500 Mb hologram video blir 1-2 Tb når rekonstruert. Men gjør vi diskutere gjenoppbyggingen gjennom dybde av prøven å bekrefte at holograms representerer den ønskede arten. En viktig funksjon i DHM er dens evne til å overvåke både intensiteten og fasen av bildene. Organismer som er nesten gjennomsiktig intensitet (som de fleste biologiske celler) vises tydelig i fase. Det er en etikett-fri teknikk, brukes ingen fargestoffer. Dette er en endvantage for mulig romferder programmer, siden fargestoffer ikke kan overleve betingelsene for en misjon og, enda viktigere, kan ikke antas for å arbeide med utenomjordisk organismer, som ikke kan bruke DNA eller RNA for koding. Det er også en fordel for arbeid i ekstreme miljøer som Arktis og Antarktis, hvor fargestoffer kan være vanskelig å få til den eksterne plasseringen og kan svekkes ved lagring. Rekonstruksjon av bilder i fase og amplitude utføres ved hjelp av en åpen kildekode programvarepakke som vi gjort tilgjengelig på GitHub (SJAMPO) eller ImageJ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7710</td>
			<td>Many options for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10053-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon (Corning Life Sciences)</td>
			<td>352002</td>
			<td>Loose-capped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hauser chamber</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td>Luer-Lok tip not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to 1/16&#8221; barbed fitting</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable 1/16&#8221; ID PVC tubing for flow</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>8000-0004</td>
			<td>Sold by length, purchase accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Materials Section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holographic Microscope</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Wallace et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-source software</td>
			<td>Custom</td>
			<td>https://github.com/bmorris3/shampoo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)

Nøyaktig oppdage og teller sparsom bakteriell prøver har mange programmer i mat, drikke og behandling av farmasøytisk industri, medisinsk diagnostikk og for livet gjenkjenning av robot oppdrag til andre planetene og månene i solsystemet. Foreløpig telles sparsom bakteriell prøver av kultur plating eller epifluorescence mikroskopi. Kultur plater krever lang incubation ganger (dager til uker), og epifluorescence mikroskopi krever omfattende flekker og konsentrasjonen av prøven. Her viser vi hvordan du bruker off-aksen digital holografiske mikroskopi (DHM) til å nummerere bakterier i svært fortynne kulturer (100-104 celler/mL). Først diskuteres byggingen av den egendefinerte DHM, sammen med detaljerte instruksjoner på å bygge en rimelig instrument. Prinsippene for holography diskuteres og en statistisk modell brukes til å anslå hvor lenge videoer bør være å oppdage celler, basert på optisk ytelse karakteristikkene av instrumentet og konsentrasjonen av bakteriell løsningen (tabell 2) . Video gjenkjenning av celler på 105, 104, 103og 100 celler/mL demonstreres i sanntid ved hjelp av rekonstruert un hologrammer. Rekonstruksjon av amplitude og fase bilder er demonstrert ved hjelp av en åpen kildekode programvarepakke.

Resultatene bør angi muligheten til å oppdage levende og døde bakterier på svært lave nivåer av DHM. Hvor mange bakterier telles bør være konsekvent med resultatene ved hjelp av Petroff-Hauser telling kammer og plate teller. Standard statistiske metoder gir informasjon om nøyaktigheten av ulike gjenkjenningsmetoder i ulike bakteriell konsentrasjoner.
Figur 1 viser Petroff-Hausser teller kam...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM at JoVE.com

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holografiske mikroskopi (DHM) er en volumetriske teknikk som lar tenkelig prøver 50-100 X tykkere enn brightfield mikroskopi på sammenlignbare oppløsning, med fokusering utført etterbehandling. DHM brukes her til å identifisere, teller, og spore mikroorganismer på svært lav tetthet og sammenlignet med optisk densitet målinger, plate antall og direkte teller.

Kvantifisere mikroorganismer i lave konsentrasjoner bruker Digital holografiske mikroskopi (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Induksjon av adhesjonsmolekylhemmer avhengige signaler ved hjelp Lav-intensitet ultralyd

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantifisere mekaniske egenskaper endotel Glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design og bygging av kunstige Ekstracellulær Matrix (aECM) Proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt; For Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

En guide til Strukturert Illumination TIRF Mikros i høy hastighet med flere farger

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Sirkulasjons mikroRNA Kvantifisering Bruke DNA-bindende Dye kjemi og Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Rod-baserte Fabrikasjon av Tilpass Soft Robot Pneumatiske gripeinnretninger for Delikat Tissue Manipulasjon

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Samsvarende lys- og elektronmikroskopi Bruke Quantum Dot Nanopartikler

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...