Name: quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)
Uploaded: 2017-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM at JoVE.com

Авторы признают, Гордон и Бетти Мур фонд грантов 4037 и 4038 на Калифорнийский технологический институт для финансирования этой работы.

1. рост и перечисление бактерии Примечание: это применимо к почти любой бактериальный штамм, выращенных в соответствующих средних 36. В нашем примере, мы используем три штамма: Serratia marcescens как общие, легко идентифицируемые лаборатории штамм; и меньше, очен?...

<ol>
	<li>Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Fluorescence+Microscopy+Technique+for+Detecting+Viable+Mycobacterium+avium+ssp.+paratuberculosis+Cells+in+Milk.">Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk.</a> Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).</li><li>Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+total+aerobic+microbial+counts+on+meat+and+in+meat+products+by+means+of+the+direct+epifluorescence+filter+technique.">Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique.</a> Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).</li><li>Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enumeration+of+Salmonella+on+sample+slides+of+poultry+carcass+wash+water+using+image+analysis+with+fluorescent+microscopy.">Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy.</a> Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).</li><li>Durtschi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+bacterial+detection+in+cerebrospinal+fluid+by+fluorescent+staining+on+low-fluorescence+membrane+filters.">Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters.</a> J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).</li><li>Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Automatic+Methods+Based+on+Image+Processing+Techniques+for+Tuberculosis+Detection+from+Microscopic+Sputum+Smear+Images.">A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images.</a> J Med Syst. 40, (2016).</li><li>Riepl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+of+solid-phase+cytometry+and+epifluorescence+microscopy+for+rapid+assessment+of+the+microbiological+quality+of+dialysis+water.">Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water.</a> Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).</li><li>Hwang, C. Y., Cho, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-infected+bacteria+in+oligotrophic+open+waters+of+the+East+Sea,+Korea.">Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea.</a> Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).</li><li>Kepner, R. L., Pratt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorochromes+for+Direct+Enumeration+of+Total+Bacteria+in+Environmental-Samples+-+Past+and+Present.">Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present.</a> Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).</li><li>Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+rapid+direct+viable+count+method+to+deep-sea+sediment+bacteria.">Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria.</a> J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).</li><li>Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+detection+of+putative+life+on+Europa.">Strategies for detection of putative life on Europa.</a> Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).</li><li>Gleeson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosignature+Detection+at+an+Arctic+Analog+to+Europa.">Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa.</a> Astrobiology. 12, 135-150 (2012).</li><li>Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).</li><li>Konstantinidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lander+mission+to+probe+subglacial+water+on+Saturn's+moon+Enceladus+for+life.">A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life.</a> Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).</li><li>McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow+the+Plume:+The+Habitability+of+Enceladus.">Follow the Plume: The Habitability of Enceladus.</a> Astrobiology. 14, 352-355 (2014).</li><li>Hoover, R. B., Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. , (2015).</li><li>Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics:+application+of+genomics+to+uncultured+microorganisms.">Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms.</a> Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).</li><li>Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blue+nucleic+acid+dyes+for+flow+cytometric+enumeration+of+bacteria+in+aquatic+systems.">Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).</li><li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I.">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+fluorescent+gram+staining+and+activity+assessment+of+activated+sludge+bacteria.">Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).</li><li>Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+Of+Acridine-Orange+And+Gram+Stains+For+Detection+Of+Microorganisms+In+Cerebrospinal-Fluid+And+Other+Clinical+Specimens.">Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).</li><li>Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+gram+stain+for+flow+cytometry+and+epifluorescence+microscopy.">A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).</li><li>Saida, H., Ytow, N., Seki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photometric+application+of+the+Gram+stain+method+to+characterize+natural+bacterial+populations+in+aquatic+environments.">Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).</li><li>Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternate+Gram+Staining+Technique+Using+A+Fluorescent+Lectin.">Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin.</a> Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).</li><li>Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Rapid+Technique+For+Counting+Microorganisms+Directly+On+Membrane+Filters.">New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters.</a> Stain Technology. 58, 343-346 (1983).</li><li>Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+staining+and+enumeration+of+small+numbers+of+total+bacteria+in+water+by+solid-phase+laser+cytometry.">Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).</li><li>Yagupsky, P., Nolte, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+aspects+of+septicemia.">Quantitative aspects of septicemia.</a> Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).</li><li>Kang, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+single+bacteria+in+unprocessed+blood+using+Integrated+Comprehensive+Droplet+Digital+Detection.">Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection.</a> Nat Commun. 5, 5427 (2014).</li><li>Hand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).</li><li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).</li><li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).</li><li>Rappaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+characterization+of+the+fission+yeast+cell+cycle+by+monitoring+dry+mass+with+digital+holographic+microscopy.">Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy.</a> J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).</li><li>Jo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+identification+of+individual+bacteria+using+Fourier+transform+light+scattering.">Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering.</a> Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).</li><li>Wallace, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust,+compact+implementation+of+an+off-axis+digital+holographic+microscope.">Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope.</a> Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).</li><li>Lindensmith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Submersible,+Off-Axis+Holographic+Microscope+for+Detection+of+Microbial+Motility+and+Morphology+in+Aqueous+and+Icy+Environments.">A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments.</a> Plos One. 11, e0147700 (2016).</li><li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains.">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li><li>Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+flgM,+a+gene+encoding+the+anti-sigma+28+factor+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).</li><li>Adler, J., Templeton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+environmental+conditions+on+the+motility+of+Escherichia+coli.">The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli.</a> Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).</li><li>Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+wave+propagation+in+Image+J.">Numerical wave propagation in Image J.</a> Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).</li><li>Schnars, U., J&#252;ptner, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+recording+and+numerical+reconstruction+of+holograms.">Digital recording and numerical reconstruction of holograms.</a> Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).</li></ol>

Численное реконструкция голограммы: численные реконструкции голограмм, используется метод угловой спектра (АНМ). Это включает в себя свертка голограмма с функция Грина для Вывинтить. Комплекс волновому изображения в частности фокальной плоскости можно рассчитать, используя ...

Определение точной бактериальных отсчетов в очень разбавленных пробах крайне важно во многих приложениях: несколько примеров являются воды и продовольствия качества анализа1,2,3; обнаружение возбудителей в крови, спинномозговой жидкости или мокроты4,5; Производство фармацевтической продукции, в том числе стерильной воды6; и анализ экологического сообщества в олиготрофном средах, например в открытом океане и отложений7,8,9. Растет также интерес к обнаружению возможных сохранившиеся микробной жизни на ледяных лун Юпитера и Сатурна, особенно Europa10,11 и Энцелада12,13, 14, которые, как известно, имеют подземных жидких океанов. Потому что ни одна миссия с Викинг в 1978 году пытался найти сохранившиеся жизнь на другой планете, был ограниченным развитием технологий и инструментов для идентификации бактерий и подсчета голосов во время космических миссий15.
Традиционные методы плита графа найти только culturable клетки, которые могут представлять меньшинство видов экологической штаммов, иногда &#60; 1%16. Пластины требуют дни или недели инкубации для максимального успеха, в зависимости от штамма. Микроскопия помощью эпифлуоресцентного основном заменены плиты счетчики как золотой стандарт для быстрого и точного микробной перечисления. Нуклеиновые кислоты маркировки флуоресцентных красителей, например 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI), SYBR зеленый или оранжевый акридин привязанные к нуклеиновые кислоты являются типичными красители, используемые17,18,19 , хотя многие исследования используют люминесцентные Индикаторы грамм подписали20,-21,-22,-23,-24. С помощью этих методов без шаги предварительной концентрации приводит к пределов обнаружения (LOD ' ы) ~ 105 клеток / мл. Улучшения в Лоде можно с помощью фильтрации. Жидкий образец, вакуум фильтруются на мембраны, обычно поликарбоната и идеально черный для уменьшения фона. Низкий фон красителей, таких как пятна ДНК, упомянутые выше могут быть применены непосредственно к фильтр25. Для точного подсчета глаз, ~ 105 клетки необходимы для фильтра, что означает, что для образцов более разбавленного чем клетки5 ~ 10 мл, пользователей.вследствие тома должны быть собраны и фильтруют. Лазерное сканирование устройства были разработаны для того, чтобы систематически исследовать все регионы фильтра и таким образом уменьшить количество клеток, необходимых для подсчета, толкания пределы обнаружения до ~ 102 клеток / мл26. Однако они не доступны в большинстве лабораторий и требуют сложного оборудования, а также программного обеспечения которые позволяют эксперт подтверждение, что наблюдается частиц, бактерий и не мусор.
Для справки, взрослых с сепсисом обычно начинают симптомами на &#60; 100 клеток/мл крови и младенцев в &#60; 10 кл/мл. Ничьей крови от взрослого занимает 10 мл, а от младенца, 1 мл. Методы на основе ПЦР ингибируется наличием микрофлоры человека и непатогенные ДНК и ПЦР ингибирующих компонентами крови27,28. Несмотря на целый ряд новых методов культур остаются золотой стандарт для диагностики инфекций кровотока, особенно в сельских районах или развивающихся стран. Для обнаружения жизни на других планетах термодинамические вычисления можно оценить бюджет энергии для жизни и, таким образом, ожидаемый возможных биомассы. 1 - 100 клеток/мл, как ожидается, будут термодинамически разумные Europa29. Это можно легко увидеть из этих чисел обнаружения очень небольшое количество клеток в больших количествах водный раствор является важной нерешенной проблемой.
В этой статье, мы демонстрируем обнаружения Serratia marcescens и Shewanella oneidensis (одичал тип и не подвижные мутант) в концентрациях 105, 104, 103и 100 клеток/мл, используя вне оси Голографический микроскоп (DHM). Ключевым преимуществом DHM над традиционными световой микроскопии является одновременные снимки объем толстые пробы с высоким разрешением — в этой реализации, камеры образец был толщиной 0,8 мм. Эти образцы камеры были построены софт литография полидиметилсилоксан (PDMS) с высокой точностью алюминиевых плесень с допуском ± 50 мкм. Это представляет приблизительно 100-кратного улучшение в глубине поля над мощной световой микроскопии. DHM также обеспечивает количественную фазу информацию, позволяя для измерения длины оптического пути (продукт преломления и толщина). DHM и подобные методы были использованы для контроля бактерий и дрожжей клеточного цикла и расчет бактериальной сухой массы30,,3132; рассеяние различия может даже использоваться для различения бактериальных штаммов33.
Инструмент, который мы используем на заказ специально для использования с микроорганизмами, как ранее опубликованные34,35, и его дизайн и строительство продемонстрировали и обсуждены. Водные растворы поставляются непрерывно объем 0,25 мкл пример камеру через шприцевый насос; скорость потока определяется частота кадров камеру для обеспечения визуализации объема всей выборки. Статистическое вычисление предсказывает количество образцов томов, которые должны отражаться для того, чтобы обнаружить значительное количество ячеек в данной концентрации.
Для клеток обнаружения приложений реконструкция голограмм в амплитуду и фазу изображения не требуется; анализ проводился на сырье голограммы. Это экономит значительные вычислительные ресурсы и дисковое пространство: 500 МБ голограммы видео будет 1-2 ТБ при реконструкции. Однако мы обсуждаем реконструкции через глубины выборки для подтверждения, что голограмм представляют желаемый вид. Важной особенностью DHM является его способность контролировать интенсивность и фазу изображения. Организмов, которые являются почти прозрачной в интенсивности (например, большинство биологических клеток) появляются четко в фазе. Как это лейбл бесплатно техника, не красители используются. Этопреимущество для возможных космического полета приложений, так как красители могут не пережить условия миссии и — что еще более важно — нельзя работать с внеземных организмов, которые не могут использовать для кодирования ДНК или РНК. Это также преимущество для работы в экстремальных условиях Арктики и Антарктики, где красители могут быть трудно довести до удаленного местоположения и может ухудшиться после хранения. Реконструкция изображений в амплитуде и фазе выполняется с помощью пакета с открытым исходным кодом, который мы сделали доступны на GitHub (шампунь) или ImageJ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7710</td>
			<td>Many options for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10053-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon (Corning Life Sciences)</td>
			<td>352002</td>
			<td>Loose-capped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hauser chamber</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td>Luer-Lok tip not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to 1/16&#8221; barbed fitting</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable 1/16&#8221; ID PVC tubing for flow</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>8000-0004</td>
			<td>Sold by length, purchase accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Materials Section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holographic Microscope</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Wallace et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-source software</td>
			<td>Custom</td>
			<td>https://github.com/bmorris3/shampoo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)

Точного обнаружения и подсчета разреженные бактериальные образцы имеет много приложений в продуктов питания, напитков и фармацевтической промышленности, в медицинской диагностике, а также для обнаружения жизни роботов миссиями на другие планеты и спутники солнечной системы. В настоящее время разреженные бактериальные образцы учитываются по культуре обшивка или эпифлуоресцентного микроскопии. Плиты культуры требуют долго инкубационный раз (дней до нескольких недель), и микроскопия помощью эпифлуоресцентного требует обширных окрашивание и концентрации образца. Здесь мы продемонстрируем использование вне оси цифровой голографической микроскопии (DHM) для перечисления бактерий в очень разбавленных культур (100-104 клеток/мл). Во-первых строительство пользовательских DHM обсуждается, а также подробные инструкции по созданию инструмента лоу кост. Обсуждены принципы голографии, и статистическую модель используется для оценки, как долго видео должно быть обнаружить клетки, основанный на оптические характеристики инструмента и концентрация бактерий раствора (Таблица 2) . Видео выявление клеток на 105, 104, 103и 100 клеток/мл свидетельствует в реальном времени с помощью ООН реконструированный голограммы. Реконструкция амплитуды и фазы изображений показано с помощью пакета с открытым исходным кодом.

Результаты следует указать способность обнаружить живых и мертвых бактерий на очень низких уровнях DHM. Количество бактерий, учитываются должны согласовываться с результатами, полученными с помощью Petroff-Хаузер Счетной палаты и пластины отсчеты. Стандартные статистич?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM at JoVE.com

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Голографической цифровой микроскопии (DHM) является объемный метод, который позволяет после обработки изображений образцов, выполненных толще, чем brightfield микроскопии в сопоставимых резолюции, с упором на 50-100 X. DHM используется здесь для выявления, учета и отслеживания микроорганизмов на очень низкой плотности и по сравнению с измерения оптической плотности, плита count и прямых игр.

Количественного определения микроорганизмов при низких концентрациях, с использованием голографической цифровой микроскопии (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Разделение Бусы и клетки в Многоканальные Устройства микрожидкостных Использование Диэлектрофорез и ламинарного потока

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-световой микроскопии этап Изготовление для Коррелированные Свет / Электронная микроскопия

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Индукция Адгезия зависит от сигналов с низкой интенсивности ультразвука

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Проектирование и строительство искусственного внеклеточного матрикса (aECM) Белки<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Для кожи тканевой инженерии

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Руководство по Structured Illumination TIRF микроскопией на высокой скорости с несколькими цветами

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Циркулирующие микроРНК Количественное Использование ДНК-связывающих Dye Химия и дроплет Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Род основе Изготовление настраиваемыми Soft роботизированных захватных Пневматические устройства для деликатной ткани манипулированию

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Коррелятивное свето- и электронной микроскопии с помощью Quantum Dot Наночастицы

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...