Name: real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

हम प्रशिक्षण और cervid पीआरपी बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए Dr. Caughey (NIH रॉकी पर्वत प्रयोगशालाओं) के लिए आभारी हैं । एसजी कनाडा रिसर्च चेयर प्रोग्राम द्वारा समर्थित है । हम इस अनुसंधान के लिए धन स्वीकार जीनोम कनाडा, अलबर्टा Prion अनुसंधान संस्थान और अलबर्टा कृषि और वानिकी जीनोम अलबर्टा के माध्यम से, और इस काम के समर्थन में कैलगरी विश्वविद्यालय से एसजी । हम पशु अनुसंधान के लिए मार्गरेट साध फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान स्वीकार करते हैं ।

1. भ-त्वरि मल सामग्री का उपयोग कर <ol> <li> की तैयारी cervid मल का अर्क <ol> <li> मल को जोड़कर मल कर homogenate कर के 1 जी की सामग्री के 10 मिलीलीटर में से जोड़ें बफर (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट, पीएच ७.१, १३० मिमी NaCl, ०.०५% 20 के बीच, 1 m...

RT-त्वरि पहले मूत्र और मौखिक रूप से संक्रमित सफेद पूंछ हिरण और खच्चर हिरण के मल अर्क में CWD prions का पता लगाने के लिए कार्यरत था ३८। इस पांडुलिपि में दिखाया प्रणाली RT-त्वरि परख के एक अनुकूलित विधि है ।...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc seringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UCF901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 ml seringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA75846-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS M Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ML9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tapes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>232702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>7910-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>496626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9410-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial buffers and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugBuster Master Mix</td>
			<td>Nogagen</td>
			<td>71456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technoligies</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards and commercial kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Autoinduction System 1</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71300-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA protein purification systems FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-25.50</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism6</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

RT-त्वरि तकनीक है एक संवेदनशील इन विट्रो सेल मुक्त prion प्रवर्धन परख पर आधारित मुख्य रूप से बीज का खुलासा और संयोजक prion प्रोटीन के एकत्रीकरण (पीआरपी) सब्सट्रेट रूपांतरण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में prion बीज का उपयोग कर. RT-त्वरि एक उपंयास उच्च प्रवाह तकनीक है जो वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के अनुरूप है । amyloid फाइब्रिल विकास का पता लगाना डाई Thioflavin टी, जो ᵦ-शीट रिच प्रोटीन के साथ विशिष्ट बातचीत पर fluoresces पर आधारित है । इस प्रकार, amyloid गठन वास्तविक समय में पता लगाया जा सकता है । हम एक विश्वसनीय गैर इनवेसिव स्क्रीनिंग परीक्षण का पता लगाने के लिए विकसित करने की कोशिश की जीर्ण बर्बाद कर रोग (CWD) prions मल निकालने में । यहां, हम विशेष रूप से आरटी-त्वरि तकनीक अनुकूलित किया है CWD संक्रमित cervids के मल में पीआरपीअनुसूचित जाति बोने की गतिविधि प्रकट करते हैं । शुरू में, हम तैयार मल निष्कर्षों के बोने की गतिविधि RT-त्वरि में अपेक्षाकृत कम था, संभवत: मल सामग्री में संभावित परख अवरोधकों के कारण. मल निष्कर्षों के बोने की गतिविधि में सुधार और संभावित परख अवरोधकों को हटाने के लिए, हम एक बफर में मल के नमूनों homogenized डिटर्जेंट और चिढ़ाने अवरोधकों युक्त । हम भी विभिंन तरीकों से नमूनों को प्रस्तुत करने सोडियम phosphotungstic एसिड का उपयोग प्रोटीन वर्षण के आधार परअनुसूचित जाति , और केंद्रापसारक बल पर ध्यान केंद्रित । अंत में, मल अर्क अनुकूलित RT-त्वरि द्वारा परीक्षण किया गया था जो प्रोटोकॉल में सब्सट्रेट प्रतिस्थापन शामिल करने के लिए पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार. इस प्रकार, हम पूर्व के मल में CWD prion सीडिंग गतिविधि के प्रति संवेदनशील का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की नैदानिक और आरटी द्वारा नैदानिक cervids-त्वरि, जो गैर इनवेसिव CWD निदान के लिए एक व्यावहारिक उपकरण हो सकता है.

10% (डब्ल्यू/वी) पर तैयार CWD मल अर्क बीज RT-त्वरि प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे, अभी तक पता लगाने की संवेदनशीलता कम था 27. मल homogenization के लिए एक विशिष्ट बफर का उपयोग करने के बजाय हिरण rPrP जो और अधि...

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Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

यहां, हम एक सरल, तेज और कुशल prion प्रवर्धन तकनीक, वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण (RT-त्वरि) विधि का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

मल सामग्री में CWD Prions का पता लगाने के लिए वास्तविक समय तड़पनेवाला-प्रेरित रूपांतरण परख

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions प्रोटीन misfolding चक्रीय प्रवर्धन

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia में microRNAs की सामान्य सीएनएस में वास्तविक समय पीसीआर द्वारा और Neuroinflammation दौरान जांच

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

टी सेल की वास्तविक समय लाइव इमेजिंग परिसर गठन संकेतन

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग रीयल टाइम में एक तीव्र माउस निमोनिया मॉडल में न्यूमोकोकल विषैलापन कारकों के प्रभाव के बाद

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

उच्च throughput मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी पीसीआर परख प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण के लिए

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

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चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं के लिए एक वास्तविक समय शक्ति परख ठोस और हेमेटोलॉजिकल कैंसर कोशिकाओं को लक्षित

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