Name: real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Nós estamos gratos ao Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) para fornecer a formação e o plasmídeo de expressão bacteriana do PrP de cervídeos provenientes. SG é suportado pelo programa da cadeira de pesquisa do Canadá. Reconhecemos que o financiamento para esta pesquisa para SG do Genome Canadá, príon Alberta Research Institute e Alberta agricultura e silvicultura através do genoma Alberta e a Universidade de Calgary para apoiar este trabalho. Reconhecemos uma bolsa de pesquisa da Margaret Gunn Foundation para a pesquisa Animal.

1. RT-QuIC usando Material Fecal <ol><li>preparação de cervídeos provenientes de fezes de extratos <ol><li>Make homogenate fecal pela adição de 1 g de material fecal para 10 mL de fezes Extraia buffer (fosfato de sódio de 20 mM, pH 7.1, 130 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1x completam os inibidores de protease, EDTA-free) para dar uma concentração final de 10% (p/v). O buffer de homogeneização pode ser preparado antes da utilização e armazenado a -20 ° C.</li>
		<li>Homogenize pel...

RT-QuIC anteriormente foi empregado para detectar os príons CWD em urina e fezes extractos de infectados oralmente cariacu e veado-mula 38. O sistema mostrado neste manuscrito é um método adaptado do ensaio QuIC-RT. Etapas adicionais foram incorporadas o ensaio de RT-QuIC "clássico" para melhorar a detecção e a sensibilidade do ensaio para príons CWD em material fecal de animais infectados.
A baixa sensibilidade da deteção em extractos de fezes nos levou para o...

Doenças do prião ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Creutzfeldt - Jakob (CJD) em humanos, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, tremor epizoótico dos ovinos e caprinos e desperdiçando crônica doença (CWD) em cervídeos 1,2. EET caracterizam-se pela aparência distintiva espongiforme e perda de neurônios do cérebro. De acordo com a hipótese de "proteína apenas", príons são principalmente compostos de PrPSc ('Sc' para o tremor epizoótico) 3, uma isoforma misfolded da proteína príon celular codificado anfitrião, PrPC. PrPSc resulta da conversão de PrPC em uma conformação enriquecida em ᵦ-folhas 4,5,6 , que pode atuar como uma semente para vincular e converter outras moléculas de PrPC . As moléculas de PrPSc recém-gerado são incorporadas em um crescente polímero 7,,8 que invade oligômeros menores, resultando em maior número de núcleos infecciosos. PrPSc é propenso a agregação e é parcialmente resistente às proteases 9,10.
CWD afeta alces selvagens e de criação (Cervus canadensis), veado (Odocoileus hemionus), cariacu (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e Rena (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. É considerada a mais contagiosa doença de Creutzfeld-Jacob com transmissão horizontal favorecido por cervídeos provenientes interações e persistência ambiental de infecciosidade 14,15. Ao contrário de outras doenças de príon onde PrPSc acumulação e infecciosidade estão confinados ao cérebro, em CWD estas também são encontradas em tecidos periféricos e fluidos corporais, por exemplo, saliva, urina e fezes 16,17, 18.
Imuno-histoquímica é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico CWD detectar a distribuição de PrPSc e espongiforme lesões 19,20. ELISA e em casos mais raros, borrão ocidental também são usados para diagnóstico CWD. Assim, o atual diagnóstico de doença de príon é baseado principalmente na detecção de príons em tecidos post-mortem. Diagnóstico ante mortem por CWD está disponível por tirar as amígdalas ou biópsias de tecido linfoide associado a mucosa reto-anal (RAMALT); no entanto, este procedimento é invasivo e requer a captura dos animais. Assim, o uso de amostras facilmente acessíveis, tais como urina e fezes, seria uma maneira prática para a deteção de príons CWD. No entanto, esses harbor excreções relativamente baixa concentrações dos priões abaixo do limite de detecção dos métodos de diagnóstico atuais. Por conseguinte, uma ferramenta diagnóstica mais sensível e alta taxa de transferência é necessária. Em vitro sistemas de conversão, tais como proteína enrolamento amplificação cíclica do ensaio (PMCA) 21, amiloide semeadura do ensaio e conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC) ensaio 22,23, 24 são ferramentas muito poderosas para explorar a capacidade auto-propagação de PrPSc de imitar em vitro o processo de conversão de príon e, assim, ampliar a presença de quantidades minuciosas de PrPSc para níveis detectáveis 25 ,26. O método de RT-QuIC, no entanto, tira proveito do fato de que o produto de conversão enriquecido em estrutura secundária de β-folha especificamente pode ligar thioflavin T (Th-T). Portanto, o PrP recombinante (rPrP) mediante conversão semeado cresce em amiloides que ligam Th-T e, portanto, podem ser detectados em tempo real através da medição de fluorescência do Th-T expressada em unidades de fluorescência relativo (RFU) ao longo do tempo. Uma vez controlada, a RFU pode ser usada para avaliar atividades de semeadura relativas e parâmetros quantitativos como a fase de retardo. A fase de retardo representa o tempo necessário para atingir o limiar, durante a qual rPrP conversão a fase inicial da reação é abaixo do limite de detecção de fluorescência Th-T (h). O fim da fase de aparente defasagem, concomitante à formação de um núcleo de amiloide suficiente (nucleação/alongamento), ocorre quando a fluorescência de Th-T excede o nível de limiar e torna-se positivo. O crescimento das fibrilas podem ser detectadas em tempo real e a inicial do PrPSc ou semeadura atividade contida na amostra de amiloide é amplificado por segmentação que gera mais sementes. Estas sementes, por sua vez induzem uma rápida fase exponencial de crescimento de fibra amiloide.
Porque este ensaio é capaz de detectar tão baixo quanto 1 fg de PrPSc 24, a alta sensibilidade qualifica esta técnica para conseguir ante mortem ou diagnóstico não-invasivo, detectando PrPSc em vários tecidos periféricos, excreções ou outros tipos de amostra, abrigando os baixos níveis de infecciosidade. RT-QuIC definitivamente fornece vantagens sobre outros ensaios para sua reprodutibilidade, praticidade, rapidez (menos de 50 h) e baixos custos em comparação com os bioensaios. Evita as complexidades técnicas tais como sonication usado em PMCA; Além disso, ela é realizada em uma microplaca de fita-selado que minimiza o risco de contaminação de aerossol de cada poço. O formato multi bem permite a análise de até 96 amostras no mesmo experimento. Para combater o problema recorrente de falsos positivos e conversão espontânea de rPrP nos ensaios de conversão em vitro , a implementação de um limiar (cut-off) em RT-QuIC é muito útil. De fato, baseado nos resultados do controlo negativo (RFU média de amostras negativas + 5 SD 27), uma linha de base é configurada do qual seja possível discriminação entre amostras positivas e negativas. O uso de quatro repetições para cada amostra, portanto, pode ajudar a definir uma amostra como positivo quando pelo menos 50% de repetições a mostrar um sinal positivo, ou seja, cruzar o disco de corte 28. A homologia entre Sementes e substrato não é necessária no RT-QuIC, como por exemplo, em um estudo anterior, hamster rPrP foi encontrado ser um substrato mais sensível em relação ao substrato homólogas em humanos PrPvCJD semeado e tremor epizoótico ovelhas semeado reações 29. hamster-ovelha quimérico rPrP sugeriu-se também para ser um substrato mais adequado do que rPrP humano para detectar CJD variante humana priões 30. Assim, o uso de substratos rPrP de diferentes espécies é muito comum neste ensaio. Este ensaio tem sido aplicado com êxito a várias doenças de príon, como esporádicos DCJ 31,32,33, gendoenças de príon ETIC 34, BSE 35,36,37, 23,de tremor epizoótico36e CWD 38,39,40,41, 42. Estudos utilizando processados líquor, sangue, saliva e urina como sementes em RT-QuIC foram todos bem sucedidas para detectar PrPSc 38,39,40,41, 42. para fomentar a capacidade de deteção em amostras de plasma de sangue que podem conter inibidores da formação de amiloide, Orrú et al. (2011) desenvolveu uma estratégia para remover potenciais inibidores da formação de amiloide penteando PrPSc passo de imunoprecipitação (IP) e RT-QuIC, chamado "reforçada QuIC" ensaio (eQuIC). Além disso, uma etapa de substituição do substrato foi empregada após ~ 24 h de tempo de reação a fim de melhorar a sensibilidade. Em última análise, como baixa como 1 ag de PrPSc era detectável por eQuIC 30.
Fim de extratos de fezes de purificar e remover inibidores possível ensaio nas fezes, amostras fecais coletadas em estágios pré-clínicos e clínicos de elk após infecção oral experimental foram homogeneizadas em tampão contendo detergentes e inibidores de protease. Os extratos de fezes mais foram submetidos a diferentes metodologias para concentrar o PrPSc nas amostras utilizando a precipitação de proteínas através da precipitação do sódio fosfotúngstico ácida (NaPTA). O método de precipitação de NaPTA, primeiramente descrito por Safar e col 43, é usado para concentrar o PrPSc em amostras do teste. A incubação de NaPTA com a amostra resulta em precipitação preferencial do PrPSc ao invés de PrPC. No entanto, o mecanismo molecular é ainda incerto. Esta etapa também ajudou a contendo e impedindo a conversão espontânea de rPrP, que é observado em alguns casos. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC usando rPrP rato (aa 23-231) como substrato e incluindo substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção.
Aqui os resultados demonstram que este método melhorado pode detectar concentrações muito baixas de príons CWD e aumenta a sensibilidade de detecção e especificidade em amostras fecais em comparação com um protocolo sem substituição de precipitação e substrato de NaPTA. Potencialmente, este método pode ser aplicado a outros tecidos e fluidos corporais e pode ser de grande utilidade para vigilância CWD em cervídeos, selvagens e em cativeiro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc seringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UCF901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 ml seringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA75846-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS M Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ML9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tapes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>232702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>7910-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>496626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9410-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial buffers and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugBuster Master Mix</td>
			<td>Nogagen</td>
			<td>71456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technoligies</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards and commercial kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Autoinduction System 1</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71300-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA protein purification systems FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-25.50</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism6</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

A técnica de RT-QuIC é um sensível em vitro príon celular livre amplificação ensaio baseado principalmente no semeado enrolamento e agregação de substrato de proteína (PrP) recombinante do prião usando sementes de príon como um modelo para a conversão. RT-QuIC é uma nova técnica de alta produtividade, que é análoga à reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). Deteção de crescimento de amiloide fibrila baseia-se o corante Thioflavin T, que fluoresce a mediante interação específica com proteínas ricas ᵦ-folha. Assim, a formação de amiloide pode ser detectada em tempo real. Procurou-se desenvolver um teste de rastreio não-invasiva confiável para detectar os príons de doença (CWD) desperdiçando crônica no extrato fecal. Aqui, nós adaptamos especificamente a técnica de RT-QuIC revelará o PrPSc semeadura atividade nas fezes de CWD infectado cervídeos. Inicialmente, a atividade de propagação dos extratos fecais que estamos preparados foi relativamente baixa em RT-QuIC, possivelmente devido a potenciais inibidores de ensaio no material fecal. Para melhorar a atividade de preparação de extratos de fezes e remover potenciais inibidores de ensaio, nós homogeneizado as amostras fecais em um buffer que contém detergentes e inibidores de protease. Também apresentámos as amostras de diferentes metodologias para concentrar o PrPSc com base na precipitação de proteínas usando ácido fosfotúngstico de sódio e força centrífuga. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC que incluiu a substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção. Assim, estabelecemos um protocolo para a deteção sensível de príons CWD semeadura atividade nas fezes de cervídeos pré-clínicos e clínicos por RT-QuIC, que pode ser uma ferramenta prática para o diagnóstico não-invasivo de CWD.

Os extratos fecais CWD preparados em 10% (p/v) foram capazes de reação de RT-QuIC de sementes, ainda a sensibilidade da deteção era baixa 27. Usar uma reserva específica para homogeneização fecal foi um passo fundamental para evitar a fluorescência de fundo elevado em RT-QuIC reações concomitantes ao uso de substrato de rato rPrP ao invés de veado rPrP que permitiu para obter mais específico resulta 27. A adição de NaPTA precip...

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Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

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Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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