Name: purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00
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Wir bestätigen Hannah Fox für Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NIH R01AI030612 zu gewähren.

1. Zellkultur, Virusinfektion und EdC Beschriftung ( Abbildung 1) das folgende Protokoll schließt die Arbeit mit Viren. Entnehmen Sie bitte Ihrer Institution &#39; s Bio-Sicherheit Protokolle für sichere Handhabung von Viren und anderen biologischen Arbeitsstoffen. Dieses Protokoll wurde von der Institutional Review Board von der University of Pittsburgh genehmigt.
<ol><li>Trypsinize eine konfluierende 150 cm 2 Gewebekultur Flasche MRC-5 Zellen un...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+biology+of+alpha+herpesviruses+with+MS-based+proteomics.">Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics.</a> Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).</li><li>Wagner, L. M., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+herpes+simplex+virus+ICP4+with+cellular+complexes+functioning+at+multiple+steps+in+PolII+transcription.">Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription.</a> PloS One. 8, e78242 (2013).</li><li>Taylor, T. J., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+herpes+simplex+virus+replication+compartments:+association+of+cellular+DNA+replication,+repair,+recombination,+and+chromatin+remodeling+proteins+with+ICP8.">Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8.</a> J Virol. 78, 5856-5866 (2004).</li><li>Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+herpes+simplex+virus+infected+cell+protein+27:+association+with+translation+initiation+factors.">Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors.</a> Virology. 330, 487-492 (2004).</li><li>Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+on+Fundamental+Discoveries+in+Virology.">The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology.</a> Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).</li><li>Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+TRIM27+as+a+novel+degradation+target+of+herpes+simplex+virus+1+ICP0.">Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0.</a> J Virol. 89, 220-229 (2015).</li><li>Suk, H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+herpes+simplex+virus+1+virion+protein+16+transactivator+protein+in+infected+cells.">Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells.</a> Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).</li><li>Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+interaction+between+the+herpes+simplex+virus+type+1+exonuclease,+UL12,+and+the+DNA+double-strand+break-sensing+MRN+complex.">Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex.</a> J Virol. 84, 12504-12514 (2010).</li><li>Sampath, P., Deluca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+ICP4,+TATA-binding+protein,+and+RNA+polymerase+II+to+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early,+early,+and+late+promoters+in+virus-infected+cells.">Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells.</a> J Virol. 82, 2339-2349 (2008).</li><li>Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+insulator-like+element+in+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+region+binds+CCCTC-binding+factor+and+displays+enhancer-blocking+and+silencing+activities.">A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities.</a> J Virol. 80, 2358-2368 (2006).</li><li>Cliffe, A. R., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+ICP0+promotes+both+histone+removal+and+acetylation+on+viral+DNA+during+lytic+infection.">Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection.</a> J Virol. 82, 12030-12038 (2008).</li><li>Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VP16-dependent+association+of+chromatin-modifying+coactivators+and+underrepresentation+of+histones+at+immediate-early+gene+promoters+during+herpes+simplex+virus+infection.">VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection.</a> J Virol. 78, 9689-9696 (2004).</li><li>Kent, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+lytic+infection+herpes+simplex+virus+type+1+is+associated+with+histones+bearing+modifications+that+correlate+with+active+transcription.">During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription.</a> J Virol. 78, 10178-10186 (2004).</li><li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection.">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> J Virol. 82, 3530-3537 (2008).</li><li>Catez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+genome+subnuclear+positioning+and+associations+with+host-cell+PML-NBs+and+centromeres+regulate+LAT+locus+transcription+during+latency+in+neurons.">HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons.</a> PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).</li><li>Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts.">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10.">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li><li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+periphery+of+nuclear+domain+10+(ND10)+as+site+of+DNA+virus+deposition.">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li><li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment.">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte, die wenn nicht sorgfältig befolgt deutlich reduzierten Proteinausbeute oder Kontamination mit zellulären DNA führen können. Es ist wichtig, dass stationäre Zellen für alle Experimente verwendet werden, um sicherzustellen, dass zelluläre DNA nicht beschriftet und gereinigt ist. Dies kann durch das Fehlen der zellulären DNA-Polymerasen in der Protein-Probe bestätigt werden, weil HSV-1 nicht zelluläre DNA-Polymerase für die Genom-Synthese nutzen. Während EdC Kennzeichnu...

Viren haben eine begrenzte Kapazität zur Durchführung von wesentlichen Funktionen und hängt daher Host Faktoren, kritische Aspekte einer Infektion wie virale Genexpression, Replikation, Reparatur, Rekombination und Transport zu erleichtern. Die Aktivitäten dieser Host Faktoren werden oft durch Viral kodierten Proteine ergänzt. Darüber hinaus müssen Viren Erkennung und Störungen durch zelluläre Reaktionen auf virale Infektion vermeiden. Virus-Wirt Interaktionen bestimmen daher das Ergebnis einer Infektion. Von größter Bedeutung ist das Verständnis wie Viren verändern die zelluläre Umgebung anpassen der zelluläre Maschinerie um virale Prozesse zu vereinfachen. Von besonderes Interesse ist die Ermittlung viraler Genome während des ansteckenden Zyklus welche Faktoren und Prozesse einwirken.
Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) ist eine doppelte DNA-Virus gestrandet, die einen wesentlichen Teil der menschlichen Bevölkerung infiziert. Innerhalb der ersten Stunde der Infektion tritt das virale Genom den Zellkern, wo erfolgt eine geordnete Kaskade der viralen Genexpression in Abstimmung mit der viralen DNA (vDNA) Replikation1. Im Zellkern Genome epigenetische Regulierung unterliegen, Reparatur und Rekombination zu unterziehen und in Capsids, verpackt sind, so dass die ersten Nachkommen Virionen innerhalb von weniger als sechs Stunden produziert werden. Die umfassende Auswertung des Virusgenoms verbundenen Proteine im Laufe der Infektion bilden die Grundlage um die molekularen Details der Prozesse zu untersuchen, die auf virale Genom, und bieten einen Einblick in die viralen und zellulären Faktoren engagieren sich in verschiedenen Stadien der Infektion.
Bisherige Methoden zur Untersuchung von Host Faktoren bei der Virusinfektion sind Affinitätsreinigung von viralen Proteinen für die Analyse der damit verbundenen zellulären Proteinen2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. diese Tests wurden für die Identifizierung von zellulären Faktoren maßgeblich Host antivirale Reaktionen sowie virale Chromatin Modifikation, Genexpression, und DNA zu reparieren. Allerdings ist es schwierig, festzustellen, ob Interaktionen richten sich nach der Vereinigung mit vDNA und Proteomics nur Einblick in die Interaktionen, die in Abhängigkeit von den spezifischen viralen Faktor auftreten. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde verwendet, um ermitteln, wo bestimmte virale und zelluläre Proteine binden an viralen Genomen10,11,12,13,14 , 15 und Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) kombiniert mit Immunocytochemistry ermöglichte die Visualisierung von zellulären Faktoren, die mit vDNA16,17,18, colocalize 19 , 20. diese Assays für die räumliche und zeitliche Analyse zu ermöglichen. Einschränkungen enthalten jedoch die Notwendigkeit hochspezifische Antikörper, begrenzte Empfindlichkeit und die Notwendigkeit einer vorherigen Einblick in Virus-Wirt-Interaktionen. Daher entwickelten wir eine Methode basiert auf iPOND (Isolierung von Proteinen auf die entstehenden DNA)21 und AniPOND (beschleunigte native iPOND)22 selektiv beschriften und reinigen vDNA aus infizierten Zellen für die unvoreingenommene Identifizierung des viralen Genoms damit verbundenen Proteine durch Massenspektrometrie. iPOND hat für die Untersuchung der zellulären Replikation Gabel Dynamik beigetragen.
Für die selektive Reinigung von viraler Genome von infizierten Zellen repliziert vDNA Ethynyl geändert Nukleoside, 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxycytidine (EdC) (Abbildung 1), gefolgt von kovalenten trägt Konjugation, Biotin-Azid über Klicken Sie Chemie, Einzelschritt Reinigung des viralen Genomen und damit verbundenen Proteine auf Streptavidin beschichteten Perlen (Abb. 2 b) zu erleichtern. Wichtig ist, sind Infektionen in stationären Zellen durchgeführt die nicht in der zellulären DNA-Replikation tätig sind, ermöglichen spezifische Kennzeichnung des vDNA. Des weiteren HSV-1 Infektion verursacht Zellzyklus Festnahme und hemmt zelluläre DNA-Replikation23,24. Virus können prelabeled vor der Infektion für die Analyse von Proteinen verbunden mit eingehenden viraler Genome (Abbildung 1A) oder beschriftet während der DNA-Replikation für die Analyse von Proteinen, die neugebildete vDNA (Abbildung 1 b) zugeordnet werden 25. Darüber hinaus Puls Chase Analyse verwendet werden, zu untersuchen, die Art der Proteine virale Replikation Gabeln (Abbildung 1)26zugeordnet. Darüber hinaus kann Ethynyl geändert vDNA kovalent an ein Fluorophor für räumliche Untersuchung von Proteindynamik (Abb. 2A und Abbildung 3) konjugiert werden. Bildgebung ermöglicht die direkte Visualisierung des vDNA ist ein kostenloses Ansatz für die Validierung des vDNA-Protein-Interaktionen und lässt sich anpassen, virale Genome während Infektion zu verfolgen. Wir erwarten, dass diese Ansätze weiter geändert werden, könnten um jeden Aspekt der herpesviral Infektion, einschließlich Latenz und Reaktivierung, zu studieren und andere DNA-Viren zu studieren. Darüber hinaus könnte Etikettierung mit 5-Ethynyl Uridin (EU) für die Analyse der viralen RNA-Genome ermöglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1930">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">MRC-5 cells</td>
			<td style="width:197px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CCL-171</td>
			<td style="width:1215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">26140-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">12800-082</td>
			<td>substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&#160; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">600 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">166508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">HSV-1 stock</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Sephadex G-25&#160; column (PD-10 Desalting Column)</td>
			<td style="width:197px;">GE Healthcare</td>
			<td align="right" style="width:101px;">17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">5&#180;-Ethynyl-2&#180;-deoxycytidine (EdC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T511307</td>
			<td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2&#180;-deoxycytidine (deoxyC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D3897</td>
			<td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:197px;">Bellco glass</td>
			<td style="width:101px;">7731-22000</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">PBS, pH 7.2 (10x)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">C489</td>
			<td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">(+) Sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A4034</td>
			<td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biotin azide</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">B10184</td>
			<td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &#176;C for up to 1 year&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Click Reaction Mix</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:101px;">11697498001</td>
			<td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &#176;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">freezing buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &#956;L 50x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td>
			<td style="width:197px;">Sonics</td>
			<td style="width:101px;">VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:197px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:101px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:101px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Mini-Tube Rotator</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">260750F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2X Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&#160; &#176;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cap locks for 1.5 mL tube</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">NC9679153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Standard western blotting reagents</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">LC6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">12-well tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:101px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Coverslips</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-545-100</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:197px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:101px;">15710</td>
			<td>dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">BP1605</td>
			<td>prepare 3% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787</td>
			<td>prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:197px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:101px;">C10337</td>
			<td>prepare according to manufactorer&#39;s protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">H1399</td>
			<td>prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-ICP8 primary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab20194</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab19311</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">a11005</td>
			<td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Immu-mount</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2x SDS-bicarb solution</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:101px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">3 M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit assay tubes</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fluorescence microscope equipped with imaging software</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Heat blocks</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>65 &#176;C and 95 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

Das Ziel dieses Protokolls ist um zu isolieren, Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) DNA aus infizierten Zellen für die Identifizierung von verbundenen viralen und zelluläre Proteinen durch Massenspektrometrie. Obwohl die Proteine, die Interaktion mit viraler Genome Hauptrollen in den Ausgang der Infektion spielen, war eine umfassende Analyse des Virusgenoms verbundenen Proteine nicht früher möglich. Hier zeigen wir eine Methode, die die direkte Reinigung von HSV-1 Genomen von infizierten Zellen ermöglicht. Virale DNA Replikation wird selektiv mit NUK gekennzeichnet, die eine Alkinen funktionelle Gruppe enthalten. Beschrifteten DNA wird ausdrücklich und unwiderruflich beschriftet über die kovalente Befestigung der Biotin-Azid über ein Kupfer (I)-Azid-Alkinen Cycloaddition oder Klick Reaktion katalysiert. Biotin-markierten DNA wird auf Streptavidin beschichteten Perlen gereinigt und damit verbundenen Proteine sind eluiert und durch Massenspektrometrie identifiziert. Diese Methode ermöglicht die selektive Ausrichtung und Isolierung von HSV-1-Replikation Gabeln oder ganzer Genome von komplexen biologischen Umgebungen. Darüber hinaus ermöglicht die Anpassung dieses Ansatzes zur Untersuchung der verschiedenen Aspekte der herpesviral Infektion, sowie die Prüfung der Genome von anderen DNA-Viren.

Die Verwendung von Klick-Chemie zur Reinigung von DNA aus Zellen wurde zuerst durch die iPOND Methode21erreicht. IPOND soll zellulären Replikation Gabeln für die Identifizierung von assoziierten Proteinen zu reinigen. Wir haben diese Technik, um speziell vDNA-Protein-Interaktionen während der Infektion studieren angepasst. Manipulation des Ansatzes für die virale Genome mit EdC (Abbildung 1), kombiniert mit synchronisierten Infekti...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

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Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

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Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

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Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

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Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

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