Name: purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00
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我々 は、この原稿の準備で助けをハンナ フォックスを認めます。この作品は、NIH によって支えられた R01AI030612 を付与します。

1。 細胞培養、ウイルス感染および EdC ラベリング ( 図 1) 次のプロトコル ウイルスの作業が含まれます。あなたの機関を参照してください &#39; ウイルスやその他の生物学的製剤の安全な取り扱いに関する s バイオ安全プロトコル。このプロトコルは、ピッツバーグ大学の制度上の審査委員会によって承認されました。
<ol><li>Trypsinize MRC 5 セルの?...

<ol>
	<li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields virology. , (2013).</li><li>Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+biology+of+alpha+herpesviruses+with+MS-based+proteomics.">Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics.</a> Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).</li><li>Wagner, L. M., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+herpes+simplex+virus+ICP4+with+cellular+complexes+functioning+at+multiple+steps+in+PolII+transcription.">Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription.</a> PloS One. 8, e78242 (2013).</li><li>Taylor, T. J., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+herpes+simplex+virus+replication+compartments:+association+of+cellular+DNA+replication,+repair,+recombination,+and+chromatin+remodeling+proteins+with+ICP8.">Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8.</a> J Virol. 78, 5856-5866 (2004).</li><li>Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+herpes+simplex+virus+infected+cell+protein+27:+association+with+translation+initiation+factors.">Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors.</a> Virology. 330, 487-492 (2004).</li><li>Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+on+Fundamental+Discoveries+in+Virology.">The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology.</a> Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).</li><li>Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+TRIM27+as+a+novel+degradation+target+of+herpes+simplex+virus+1+ICP0.">Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0.</a> J Virol. 89, 220-229 (2015).</li><li>Suk, H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+herpes+simplex+virus+1+virion+protein+16+transactivator+protein+in+infected+cells.">Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells.</a> Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).</li><li>Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+interaction+between+the+herpes+simplex+virus+type+1+exonuclease,+UL12,+and+the+DNA+double-strand+break-sensing+MRN+complex.">Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex.</a> J Virol. 84, 12504-12514 (2010).</li><li>Sampath, P., Deluca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+ICP4,+TATA-binding+protein,+and+RNA+polymerase+II+to+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early,+early,+and+late+promoters+in+virus-infected+cells.">Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells.</a> J Virol. 82, 2339-2349 (2008).</li><li>Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+insulator-like+element+in+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+region+binds+CCCTC-binding+factor+and+displays+enhancer-blocking+and+silencing+activities.">A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities.</a> J Virol. 80, 2358-2368 (2006).</li><li>Cliffe, A. R., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+ICP0+promotes+both+histone+removal+and+acetylation+on+viral+DNA+during+lytic+infection.">Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection.</a> J Virol. 82, 12030-12038 (2008).</li><li>Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VP16-dependent+association+of+chromatin-modifying+coactivators+and+underrepresentation+of+histones+at+immediate-early+gene+promoters+during+herpes+simplex+virus+infection.">VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection.</a> J Virol. 78, 9689-9696 (2004).</li><li>Kent, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+lytic+infection+herpes+simplex+virus+type+1+is+associated+with+histones+bearing+modifications+that+correlate+with+active+transcription.">During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription.</a> J Virol. 78, 10178-10186 (2004).</li><li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection.">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> J Virol. 82, 3530-3537 (2008).</li><li>Catez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+genome+subnuclear+positioning+and+associations+with+host-cell+PML-NBs+and+centromeres+regulate+LAT+locus+transcription+during+latency+in+neurons.">HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons.</a> PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).</li><li>Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts.">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10.">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li><li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+periphery+of+nuclear+domain+10+(ND10)+as+site+of+DNA+virus+deposition.">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li><li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment.">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA.">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li><li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions.">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li><li>Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0.">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li><li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G(1)+into+S+phase+of+the+cell+cycle.">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li><li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes.">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).</li><li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes.">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).</li><li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme.">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li><li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex.">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li><li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions.">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li><li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STRING:+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene.">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li></ol>

このプロトコルには、慎重に、従わない場合に大幅に削減蛋白質収量または細胞の DNA の混入を引き起こすことがある複数の手順が含まれています。定置型電池を使用すべての実験細胞の DNA はないラベル、精製したことを確認することが重要です。これは、HSV-1 はゲノム合成細胞の DNA ポリメラーゼを利用しないので蛋白質のサンプルの細胞の DNA ポリメラーゼの不在によって確認できます?...

ウイルスは、重要な機能を遂行し、したがって感染症ウイルス遺伝子発現、レプリケーション、修理、再結合、輸送などの重要な側面を促進する宿主因子に依存する限られた能力を持っています。これらの宿主因子の活動がエンコードされたウイルス蛋白質によって補強されること。さらに、ウイルスはウイルス感染に対する細胞応答の検出と干渉を避ける必要があります。したがって、ウイルス ホスト相互作用は、感染症の結果を左右します。最も重要のウイルスがウイルスのプロセスを容易にする細胞の機械に合わせて携帯電話の環境を変更する方法を理解されています。特別な関心の感染サイクルを通してウイルスのゲノムに関する法律のどの要因とプロセスで識別します。
単純ヘルペス ウイルス タイプ 1 (HSV-1) は、二本鎖 DNA ウイルスは人間の人口のかなりの割合が感染します。感染の最初の 1 時間内でウイルスのゲノムはウイルスの遺伝子発現の順序付けされたカスケードがウイルス DNA (vDNA) レプリケーション1との連携ですさまじい核を入力します。核のゲノムはエピジェネティック制御は予告、修復と組換えを受けるし、6 時間未満内最初の子孫ウイルス粒子を生産するように、カプシドに包まれます。感染症のコース全体を通じて関連付けられているウイルスのゲノム蛋白質の包括的な評価、ウイルス ゲノムに関する法律、どのウイルスおよび細胞の要因を理解するためのプロセスの分子の詳細を調べるに土台を築く感染症のさまざまな段階に関与しています。
ウイルス感染に関与する宿主因子の調査のための以前の方法は、関連する細胞蛋白質2,3,4、5の分析のためのウイルス蛋白質の親和性の浄化,6,7,8,9. これらの試金は抗ウイルスのホストの応答としてウイルス性クロマチンの修飾、遺伝子発現に関与する細胞因子の同定のため尽力されているし、DNA 修復します。ただし、vDNA との関連付けに依存する相互作用プロテオミクスのみ特定ウイルス因子の関数として発生する相互作用への洞察力を提供するかどうかを確認することは困難です。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、特定のウイルスおよび細胞の蛋白質がウイルスのゲノム10、11,12,13,14にバインドを識別するために使用されています,15と蛍光そのままの交配 (魚) 併用免疫細胞化学は vDNA16,17,18,と colocalize の細胞の要因の可視化が有効になっています。19,20します。 これらの試時空間解析を可能にします。ただし、制限は、特異性の高い抗体、限られた感度とウイルスの宿主に以前の洞察力のための必要性の必要性を含めます。そこで iPOND (初期の DNA に蛋白質の分離)21に基づく方法と感染ウイルスのゲノムの公平な識別のため細胞の選択的にラベルを付けから vDNA を浄化する aniPOND (加速ネイティブ iPOND)22質量分析法によるタンパク質関連。iPOND は、細胞複製フォーク力学の調査のために尽力されています。
感染細胞からのウイルスのゲノムの選択的浄化、5-エチニル-2´-デオキシウリジン (EdU) または 5-エチニル-2´-デオキシシチジン (EdC) (図 1)、共有結合に続いて変更エチニル ヌクレオシドとラベルは vDNA を複製します。経由でビオチン アジ化する共役は、ウイルス ゲノムおよびストレプトアビジン コーティング ビーズ (図 2 b) に関連付けられているタンパク質の 1 つのステップ精製を容易にするために化学をクリックします。重要なは、感染症は、vDNA の特殊にラベリングを有効にする細胞の DNA 複製に従事しない定置型電池で実行されます。さらに、HSV-1 感染により、細胞周期の停止と細胞の DNA 複製23,24を抑制します。ウイルスを受信ウイルス ゲノム (図 1 a) に関連付けられている蛋白質の分析のための感染前に prelabeled または新たに合成された vDNA (図 1 b) に関連付けられている蛋白質の分析のための DNA 複製時にラベルすることができます。25します。 さらに、パルス チェイス分析はウイルス複製フォーク (図 1)26に関連付けられているタンパク質の性質を調査する使用できます。また、エチニル変更 vDNA は、空間におけるタンパク質ダイナミクス (図 2 aおよび図 3) の蛍光体にした共役系します。イメージングは、vDNA の直接可視化は、vDNA 蛋白質の相互作用を検証するための無料のアプローチで、感染でウイルスのゲノムをトラックに適応することができます。ヤマメ感染、遅延、再活性化などのあらゆる側面を研究し、他の DNA ウイルスを研究、これらのアプローチがさらに変更することができると期待しています。また、5 エチニル ウリジンとラベリング (EU) により、RNA のウイルスのゲノムの分析のため。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1930">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">MRC-5 cells</td>
			<td style="width:197px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CCL-171</td>
			<td style="width:1215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">26140-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">12800-082</td>
			<td>substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&#160; (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">600 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">166508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:419px;">HSV-1 stock</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>stocks with titers greater than 1x109 PFU/mL work best</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Sephadex G-25&#160; column (PD-10 Desalting Column)</td>
			<td style="width:197px;">GE Healthcare</td>
			<td align="right" style="width:101px;">17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">5&#180;-Ethynyl-2&#180;-deoxycytidine (EdC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T511307</td>
			<td>Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2&#180;-deoxycytidine (deoxyC)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D3897</td>
			<td>Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:197px;">Bellco glass</td>
			<td style="width:101px;">7731-22000</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">PBS, pH 7.2 (10x)</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">C489</td>
			<td>Prepare 100 mM stock and store at 4 &#176;C for up to 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">(+) Sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A4034</td>
			<td>Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biotin azide</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">B10184</td>
			<td>Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 &#176;C for up to 1 year&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Click Reaction Mix</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:101px;">11697498001</td>
			<td>Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 &#176;C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">freezing buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 &#956;L 50x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B1</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Buffer B3</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe</td>
			<td style="width:197px;">Sonics</td>
			<td style="width:101px;">VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:197px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:101px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:101px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Mini-Tube Rotator</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">260750F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2X Laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4&#160; &#176;C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">cap locks for 1.5 mL tube</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">NC9679153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Standard western blotting reagents</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">NOVEX Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">LC6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">12-well tissue culture dish</td>
			<td style="width:197px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:101px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Coverslips</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-545-100</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">12-552-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:197px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:101px;">15710</td>
			<td>dilute to 3.7% in 1x PBS before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:197px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">BP1605</td>
			<td>prepare 3% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787</td>
			<td>prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">Click reaction cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:197px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:101px;">C10337</td>
			<td>prepare according to manufactorer&#39;s protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">H1399</td>
			<td>prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-ICP8 primary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab20194</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">mouse anti-UL42 primary antibody (2H4)</td>
			<td style="width:197px;">Abcam</td>
			<td style="width:101px;">ab19311</td>
			<td>Use a 1:200 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:197px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">a11005</td>
			<td>Use a 1:500 dilution in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Immu-mount</td>
			<td style="width:197px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">2x SDS-bicarb solution</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qiaquick PCR purification kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:101px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">3 M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qubit assay tubes</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Fluorescence microscope equipped with imaging software</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Microcentrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Heat blocks</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>65 &#176;C and 95 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of viral dna for the identification of associated viral and cellular proteins

このプロトコルの目標は感染した細胞の同定 (HSV-1) DNA 関連ウイルス単純ヘルペス ウイルス 1 型を分離する、細胞タンパク質質量分析法。ウイルスのゲノムと相互作用するタンパク質を担う感染症の結果を決定する上で主要な役割が、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質の網羅的解析は以前は不可能だった。ここで我々 は、感染細胞からの HSV-1 ゲノムの直接浄化を可能にするメソッドを示します。ウイルス DNA を複製する選択的にアルキン官能を含む修正されたヌクレオチドにラベル付けされています。標識 DNA、特に不可逆的なタグ、ビオチン アジ化銅 (I) 経由での共有添付ファイルを介して-アジ化物アルキンの環化付加反応やクリックの反応を触媒。ストレプトアビジン コーティング ビーズにビオチン標識 DNA が浄化され、関連付けられているタンパク質の溶出し質量分析によって識別されます。このメソッドには、選択的ターゲティングと HSV 1 複製フォークまたは複雑な生物的環境から全体のゲノムの分離ができます。さらに、このアプローチの適応は他の DNA ウイルスのゲノムの検査と同様に、ウイルス感染症の様々 な側面の調査のためになります。

クリックケミストリーのセルからの DNA の精製用は iPOND 法21によって初めて達成されました。IPOND の目的は、関連付けられているタンパク質の同定のため細胞複製フォークを浄化することです。我々 は、特に感染時 vDNA 蛋白質の相互作用の研究にこの手法を適応しています。選択分離そして vDNA の個別集団の調査のため同期感染症と組み合わせる EdC...

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Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

このプロトコルの目標は、具体的にはタグし、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質のキャラクタリゼーションのため感染細胞からウイルス DNA を選択的に分離することです。

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

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Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

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Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

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Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製