Name: ultrathin porated elastic hydrogels as a biomimetic basement membrane for dual cell culture
Uploaded: 2017-12-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить профессор Пол ван кисточкой и профессор Чинедум Osuji за их продуманные диалоги и материаловедения опыт. Финансирование для этой работы было предоставлено Дубинский новая инициатива премии и национальных институтов здравоохранения NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

Пожалуйста, прочитайте безопасности продукта (MSDS) всех материалов предварительного использовать и использовать меры предосторожности на всех раз.
1. синтез оксид цинка иглы
<ol>
	<li>Подготовка 250 мл 0,04 М Zn (№3)2* 6 H2O решения, добавив 2.9749 g Нитрат цинка в 250 мл в...

<ol>
	<li>Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+laminins.">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li><li>Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+pores+in+human+bronchial+epithelium:+a+conduit+for+infiltrating+cells.">Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells.</a> Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).</li><li>Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+composite+model+of+the+human+postcapillary+venule+for+investigation+of+microvascular+leukocyte+recruitment.">A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment.</a> FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).</li><li>Mul, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+migration+of+neutrophils+across+monolayers+of+endothelial+and+epithelial+cells.">Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells.</a> J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).</li><li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells:+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro.">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Lab Invest. 84, 736-752 (2004).</li><li>Birkness, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+tissue+culture+bilayer+model+to+examine+early+events+in+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Infect Immun. 67, 653-658 (1999).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+attenuate+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+permeability+under+septic+conditions.">Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions.</a> PLoS One. 8, 55311 (2013).</li><li>Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+biomimicry+for+the+creation+of+investigational+and+therapeutic+devices.">Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices.</a> Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).</li><li>Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+to+investigate+the+impact+of+ECM+chemistry+and+mechanics+on+smooth+muscle+cells.">The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).</li><li>West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-patterned+hydrogels:+Customized+cell+microenvironments.">Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments.</a> Nat Mater. 10, 727-729 (2011).</li><li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration.">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J Control Release. 109, 139-148 (2005).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Taite, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogel+substrates:+probing+leukocyte+receptor-ligand+interactions+in+parallel+plate+flow+chamber+studies.">Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies.</a> Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).</li><li>Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically-+and+mechanically-tunable+porated+polyethylene+glycol+gels+for+leukocyte+integrin+independent+and+dependent+chemotaxis.">Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis.</a> Technology. 02, 133-143 (2014).</li><li>DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+immobilized+gradients+of+bFGF+on+hydrogel+scaffolds+for+directed+cell+migration.">Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration.</a> Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).</li><li>Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic,+ultrathin+and+elastic+hydrogels+regulate+human+neutrophil+extravasation+across+endothelial-pericyte+bilayers.">Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers.</a> PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).</li><li>Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(Ethylene+Glycol+Hydrogel+Scaffolds+Containing+Cell-Adhesive+and+Protease-Sensitive+Peptides+Support+Microvessel+Formation+by+Endothelial+Progenitor+Cells.">Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).</li><li>Schwartz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+strategy+for+mimicking+the+extracellular+matrix+provides+new+insight+about+tumor+cell+migration.">A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration.</a> Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes:+structure,+assembly+and+role+in+tumour+angiogenesis.">Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).</li><li>Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Poly(ethylene+glycol)-based+Tumor+Angiogenesis+Model+to+Study+the+Influence+of+Vascular+Cells+on+Lung+Tumor+Cell+Behavior.">A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior.</a> Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).</li><li>Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+the+translocation+of+Mycobacterium+tuberculosis+across+a+bilayer+of+epithelial+and+endothelial+cells+as+a+model+of+the+alveolar+wall+is+a+consequence+of+transport+within+mononuclear+phagocytes+and+invasion+of+alveolar+epithelial+cells.">The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells.</a> Infect Immun. 70, 140-146 (2002).</li></ol>

Протокол, подробно здесь позволило нам создать перестраиваемый PEG Гидрогель в качестве лески biomimetic BM. В частности, различной молекулярной массой PEG, пептид спряжение стратегии и оксид цинка микрокристаллическая структур или концентрации, упругости, биохимическими свойствами и пористо...

Внеклеточные матрицы (ECM) составляют леса белка, которые крепления клеток и служить в качестве барьеров между типами отдельных клеток и являются важным компонентом комплекса тканей и органов. В отличие от интерстициальных соединительной ткани базальной мембраны (БМ) — это специализированный тип ECM, который действует как барьер для разделения отсеков ткани друг от друга. СЭЗ толщиной примерно 100 мкм и поэтому позволяют прямые и косвенные связи между ячейками с обеих сторон. Двумя распространенными примерами СЭЗ являются сосудистые СЭЗ, нашли в микрососудистой стене между pericytes и эндотелиальных клеток и сократимость БМС, которые находятся между эндотелия и эпителиальных клеток. СЭЗ играют важную роль в регулировании функции клеток, клеток полярности и миграции, в здоровье и болезни. 1 состав, жесткость, архитектуры и пористость СЭЗ варьируется систем органов для содействия различных физиологических функций. К примеру BM поры имеют решающее значение для поддержания связи ячеек, растворимых молекул диффузии и для миграции иммунных клеток воспаления или бактерий во время инфекции. В дыхательных путях поры охватывают полную толщину BM, диаметром от 0,75 до 3,86 мкм2
Тонкий характер BM гарантирует, что, хотя типы клеток физически отделены друг от друга, межклеточные связи через опосредованной паракринными и контакт сигнализации сохраняется. Таким образом для изучения болезней человека в пробирке, исследователи полагались на пористых проницаемых Поддержка вставки бислоев клеточной культуры. 3 эти модели были критически важное значение для понимания сотовой связи, который играет определенную роль в здоровье и болезни. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 проницаемых Поддержка вставки удовлетворить основные требования для понимания, как ячеек сигнализации регулирует физиологические процессы, такие как набора лейкоцитов и бактериальных проникновения; Однако, вставки имеют значительные ограничения и не имитировать человека BM. Permeable Поддержка вставки не хватает как механических, так и биохимических перестройки, и упрощенным пористая структура не имитировать волокнистая структура, которая создает нерегулярных поры Типичные СЭЗ. Таким образом существует растущая потребность перестраиваемый систем, которые можно воссоздать родной BM свойств, которые влияют клеточных процессов.
На основе полимерной подложки являются идеальными кандидатами для развития biomimetic СЭЗ для изучения клеточных бислоев в контексте, который более тесно имитирует в естественных условиях окружающей среды. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 полимеры механически перестраиваемый и может быть химически изменена для включения biomimetic терпеноидные фрагменты. 11 , 12 , 13 биоинертный полимер полиэтиленгликоля (PEG) может использоваться для создания биомиметических СЭЗ, и недавняя работа подробный синтез механически перестраиваемый PEG аргинин глицин аспарагиновой кислоты (РГД) гели с пористой сетями, которые поддерживают рост клеток и хемотаксис воспалительных клеток. 14 Хотя опубликованные на базе PEG субстратов предусмотрено более реалистичной модели человека ECM чем проницаемых поддерживает, многие из этих моделей являются чрезвычайно толстый, с глубиной приблизительно 775 мкм, что ограничивает возможность создания бислой культур с ячеек Контакты. 14
Здесь мы представляем собой протокол для создания BM имитировать PEG на полимерной основе, которая преодолевает многие из ограничений текущей ячейки бислой культуры технологий. Мы разработали метод шаблонов, который включает в себя оксид цинка, широко используемым материалом для производства микрокристаллической продукции, в полимерной во время синтеза и сшивки, которая впоследствии и выборочно удалить из результате массовых полимер. Этот процесс создает случайный пористых сеть, подражая извилистый и взаимосвязанных поры сети человека СЭЗ. Кроме того пористость может быть изменено путем изменения размера и формы окись цинка микрокристаллов через изменение реакции стехиометрии во время производства иглы. Методика, разработанная здесь создает ультратонких гидрогеля, который имитирует толщина человеческого BM. Наконец, механики, пористость и биохимический состав этих конструкций BM-как легко может быть изменен для создания микроокружения, наиболее Аналогично, видели в естественных условиях.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:737px;" width="738">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1M Hydrogel Chloride (HCl)</td>
			<td style="width:117px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">HX0603-75 2.5L</td>
			<td style="width:167px;">Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">1X PBS</td>
			<td style="width:117px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14040-133 500 mL</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2&#8226;6H2O)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">228737-500g</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:117px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">278408-500g</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:335px;">Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+&#8226;2H2O)</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC45180010 1 kg</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Methanol (CH3OH)</td>
			<td style="width:117px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9070-05 4L</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS</td>
			<td style="width:117px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td>Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:117px;">CVS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PLD-B280B</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Round bottom flask</td>
			<td style="width:117px;">ChemGlass</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Thermometer</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stir bar</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Plain precleaned microscope slides 3&#34;x1&#34;x1&#34; mm thick</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">420-004T</td>
			<td>Spray with ethanol and let dry prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass pasteur pipets</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">1 mL rubber bulbs</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plastic 100 mm petri dishes</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Silicone isolators</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.8 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) punches</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6 well plates</td>
			<td style="width:117px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">657 160</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Filter Paper</td>
			<td style="width:117px;">Whatman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8519</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stirrer-hot plate</td>
			<td style="width:117px;">VWR Dya-Dual</td>
			<td style="width:119px;">12620-970</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:335px;">2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">24650-42-8</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)</td>
			<td style="width:117px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:335px;">Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)</td>
			<td style="width:117px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">81280-1kg</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">RGDS</td>
			<td style="width:117px;">Life Tein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">180190</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Blak-Ray long wave UV lamp</td>
			<td style="width:117px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">Model B 100AP</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:117px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1615-5500</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrathin porated elastic hydrogels as a biomimetic basement membrane for dual cell culture

Базальной мембраны является критически важным компонентом клеточной бислоев, которые могут меняться в жесткости, композиция, архитектуры и пористость. В vitro исследования эндотелия эпителиальных бислоев традиционно полагались на проницаемых поддержка моделей, которые позволили культуре бислой, но проницаемых поддерживает ограничены в их способности копировать разнообразия человеческого подвале мембран. В противоположность этому гидрогеля модели, требующие химического синтеза высоко настраиваемый и позволяют изменения жесткости материала и биохимический состав через включение biomimetic пептидов и белков. Однако традиционных гидрогелевых модели ограничены в функциональности, потому что им не хватает поры для ячеек контактов и функциональных в vitro исследования миграции. Кроме того из-за толщины традиционных гидрогели, включение поры, которые охватывают всю толщину гидрогели был сложным. В настоящем исследовании мы используем poly-(ethylene-glycol) (PEG) гидрогелей и метод шаблонов Роман окись цинка для устранения предыдущих недостатков biomimetic гидрогелей. В результате мы представляем ультратонких, базальной мембраны, как гидрогель, который позволяет культуры вырожденная сотовой бислоев на настраиваемый леску с переменной поры архитектуры, механические свойства и биохимический состав.

ПЭГ-РГД гидрогели были сформированы сэндвич раствор полимера между двумя слоями жертвенных оксид цинка и создание шаблонов поры оксида цинка иглами. Жертвенный оксид цинка компоненты затем были удалены с соляной кислотой, генерации ультратонких гидрогели КОЛЫШЕК с ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture at JoVE.com

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

Текущие модели культуре бислой не позволяют для функциональных в vitro исследования, которые имитируют в vivo микросреды. С помощью полиэтиленгликоля и метод шаблонов оксид цинка, этот протокол описывает развитие ультратонких biomimetic базальной мембраны с перестраиваемой жесткость, пористость и биохимический состав, который тесно имитирует в естественных условиях внеклеточные матрицы.

Ультратонких включить эластичное гидрогели как Biomimetic базальной мембраны для двойного клеточные культуры

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

The overall goal of this protocol is to describe a polyethylene glycol and zinc oxide templating method to create a porous, ultra-thin, biomimetic basement membrane that supports dual cell culture, and has tuneable mechanical and chemical properties. The main advantage of this technique is that we can create hydrogels that are ultra-thin, porated, mechanically and biochemically tuneable. They allow support of either single or dual cell culture.This method can help answer key questions in the tissue engineering field, including how dual cell cultures react to, and interact with, microenvironments that mimic human basement membranes. The implications of this technique extend toward a wide variety of biological systems and tissues, ultimately allowing more biomimetic research with enhanced translation for human disease. Add 250 milliliters of zinc nitrate to a flask and begin stirring the reaction.Then, add 150 milliliters of sodium hydroxide solution. A white precipitate will form briefly and then disappear as the two solutions continue to mix. Stir the mixture for two hours uncovered.Heat the flask to 55 to 60 degrees celsius and continue stirring for 24 hours. Turn off the heat and allow solution to cool to room temperature while stirring. Filter the solution though a Buchner funnel with an 11 micron pore size and allow it to dry overnight, uncovered.When the filter paper is no longer wet from the poured solution and a white powder has formed over the funnel holes, the particles are fully dried. After checking the needle leg morphology of zinc oxide needles, as described in the text protocol, clean three inch by one inch plain microscope slides with 70 percent ethanol and a disposable wipe. Hold the glass slide with tweezers and use a glass pipet with a pipet bulb to coat the slides with five drops of zinc acetate forming a thin layer dispersed on the slide.Allow excess solution to drip back into the stock solution. Then, place the slide into a preheated Petri dish on a hot plate with the zinc acetate coated side facing up for 15 minutes. Remove the slide with tweezers and allow it to cool to room temperature.The slide will appear to be coated with white streaks. Remove any excess zinc that is remaining on the slides, using a disposable wipe to remove permanent white streaks. The surface should be uniform.Suspend 20 milligrams of zinc oxide needles in 270 microliters of ten percent FBS/PBS solution. Vortex to mix for approximately 15 seconds. Briefly spin the solution in a bench top mini centrifuge to bring any zinc oxide aggregates to the base of the tube.Following centrifugation, collect 250 microliters from the top of the zinc oxide solution to ensure that aggregates remain at the bottom of the tube. Combine the collected zinc oxide solution with PEG diacrylate and PEG-RGD to create a PEG solution with approximately 2.5 millimolar RGD. Then vortex to mix for approximately 15 seconds.Next, add two microliters of acetophenone and vinyl pyrrolidone photoinitiator and vortex briefly to mix. Add 20 microliters of the polymer solution along the center of the zinc oxide coated slides. Slowly lower a second slide on top, with the zinc oxide coating facing down so that the PEG solution is between two zinc oxide coated layers.Try to prevent the formation of any air bubbles. Move the slides laterally along their axis to allow any bubbles to escape and to spread the solution into a thin layer. Create a slight overhang with the top slide to ensure that the slides can be pulled apart in their later steps.Finally, cross link the slides under a 365 nanometer UV lamp for 15 minutes. Apply pressure to the overhanging slide and manually pull the two slides apart at a slow pace in order to avoid cracking the slides. Allow the gels to dry for at least five minutes or overnight.Once the gels are dry, place the slide in a sterile 25 milliliter glass Petri dish and gently pour the one molar HCL solution onto the slide using only enough to cover the slide. Gently rock the Petri dish. The gel should begin to lift off the slide as the HCL dissolves the sacrificial zinc coating and needles.Once the gel is free from the slide, pour the HCL back into the stock solution. Rinse the gel by gently pouring approximately 25 milliliters of 1x PBS into the Petri dish until the slide and gel are submerged. Carefully pour off PBS into a waste container.Then, gently pour approximately 25 milliliters of 1x PBS into the Petri dish until the gel is floating in the solution. Use tweezers to carefully slide the silicone isolator under the gel and lift the gel onto it. Transfer the isolator and the gel into a six well dish filled with sterile 1x PBS.Prepare A549 cells as detailed in the text protocol. While cells are spinning down, add a small drop of complete Dulbecco's Modified Eagle Medium to each well of a six well plate. Use tweezers to transfer the silicone isolators with the gels, into a new six well plate such that the gel is resting on the drop of media.Now that the gels are spread into a thin layer, check to ensure that there are no large holes visible to the eye. Add the resuspended cell suspension drop-wise to the center of the gel, trying to maintain a meniscus in the punched out area of the silicone membrane. After allowing the cells to adhere for four hours, add 0.5 milliliters of Dulbecco's Modified Eagle Complete Medium to the well.Incubate overnight at 37 degrees Celsius to allow for complete adhesion. The following day, prepare huvecs for cell seeding as described in the text protocol. Then, add a small drop of Complete Medium 199 to each well in a new six well plate.Place a new silicone isolator in the well with a drop of media in the center of the silicone. Using tweezers, carefully flip the silicone isolators supporting the peg gel with A459 cells onto the isolator in the new six well plate. Add the huvec suspension to the center of the flipped gel drop-wise to maintain a meniscus on the gel within the punched out area of the silicone membrane.After allowing the cells to adhere for two hours, gently add two milliliters of M199 Complete Media to each well. Use a manual pipet to carefully remove the media from the gels, and add approximately 500 microliters of four percent PFA to the center of the gel where the cells are seeded. After the PFA sits for 30 minutes at room temperature, carefully remove the PFA and add approximately 500 microliters of two percent BSA in PBS to each gel.Following one hour incubation at room temperature, carefully remove the BSA. Add 500 microliters of prepared primary antibodies at a dilution of one to 100 in two percent BSA in PBS to each gel. Apply the secondary antibodies and phalloidin as detailed in the text protocol.Then, using tweezers and silicone isolators, transfer one gel to a glass slide. Mount the gel using a DAPI mounting medium. Finally, seal the samples with nail polish and acquire the images.Endothelial cells are able to form confluent monolayers on PEG hydrogels as demonstrated by fluorescent staining for PECAM-1 in red and DAPI in blue. Similarly, fluorescent staining for A549 in red demonstrates that epithelial cells also form confluent monolayers. Furthermore, endothelial cells can form intact cadherin junctions on PEG hydrogels as demonstrated by fluorescent staining for VE-cadherin in green and DAPI in blue.Staining for E-cadherin in green reveals the epithelial cells also form intact cadherin junctions. Following this technique, other methods like migration assays or permeability assays can be performed to understand how dual cell cultures and different microenvironments maintain or attenuate barrier function. After watching this video, you should have a good understanding on how to create ultra-thin PEG gels and modulate their porosity in addition to their mechanical and chemical properties in order to mimic the basement membrane.This technique will pave the way for researchers in the fields of biomaterials and biomedical engineering to explore and decouple mechanical, biochemical, and cell-mediated pathways that contribute to human disease. Though the system is widely applicable to biological applications, it can be applied to any system where cell-cell signaling and mechanical or biochemical extracellular cues can play a role.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Трехмерная Биомиметический Технология: Роман Biorubber Создает Определено микро- и макроуровне архитектур в коллагене гидрогелей

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Синтез РГД-функционализированного гидрогелей в качестве инструмента для терапевтических применений

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Свет-опосредованной Формирование и структурирование гидрогелей для клеточных культур

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Синтез гидрогелей с противообрастающей недвижимостью в качестве мембран для очистки воды

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Культура человека плюрипотентных стволовых клеток на поливинилового спирта Co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости Xeno свободных условиях

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Гиалуроновой кислоты на основе гидрогелей для 3-мерного культуры клеток пациента производные глиобластомы

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Изготовление биомиметического нано-матрицы с нанотрубок Janus Base и фибронектина для агезии стволовых клеток

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Инъекционные супрамолекулярные полимерно-наночастицы гидрогели для клеточных и лекарственных средств

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...