Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Forfatterne takke Tongalp Tezel, MD, for høring om sT injektion; Theresa Swayne, ph.d., for konsultation angående SHG mikroskopi; og Jimmy Duong fra Design og Biostatistik ressource og Biostatistisk core facilitet af Irving Institute ved Columbia University Medical Center.
Støttet en del forskning for at forebygge blindhed og nationale institutter for sundhed tilskud NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 og NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University ejer tilknyttede immaterialret: U.S. udstedte patenter no: 8,466,203 og ingen: 9,125,856. International patentanmeldt: PCT/US2015/020276.
Billeder blev indsamlet i Confocal og specialiseret mikroskopi delt ressource af Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, støttet af NIH give #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Konfokal mikroskop blev købt med NIH give #S10 RR025686.

Alle procedurer blev udført ved hjælp af dødt kanin øjnene inden for intakt outbred kanin hoveder. Alle institutionelle og nationale retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr blev fulgt.
1. forberedelse af løsninger
<ol><li>SMG forberedelse til TXL:<ol>
<li>Forberede 1 mL 0,2 M koncentration af natriumbikarbonat løsning (NaHCO3) løsning med 0.0165 g NaHCO3 pulver opløses i 1 mL destilleret vand.</li>
		<li>0.1016 mg pulveriserede natrium hydroxymethylglycinat (SMG)...

Gennemført eksperimenter har vist beviser understøtter brugen af SHG signal mikroskopi som en metode til evaluering af kollagen cross-linking effekter i sclera, hæve fremtidige muligheden af at anvende denne teknik som et overvågningsværktøj for danne tvaerbindinger behandlinger at målrette kollagen proteiner. Af note er et instrument, der allerede i klinisk brug, der potentielt kan fange denne SHG signal. Selv om dette instrument var primært designet til billedbehandling hud menneskelige dermis, har det været a...

Progressive nærsynethed er postuleret for at være behandlelige gennem ikke-enzymatiske scleral cross-linking (fotokemisk og kemiske), hvilket giver mening at blokere kollagen enzymatisk cross-linking kan øge eksperimenterende form afsavn (FD)-induceret Nærsynethed1. ElSheikh og Phillips2 for nylig drøftet gennemførlighed og potentiale til at anvende standard ultraviolet-en bestråling (UVA)-riboflavin medieret fotokemisk cross-linking (også kendt som Dresden-protokollen), forkortet her som (riboflavin CXL) for posterior scleral stabilisering at standse aksial brudforlængelse i nærsynethed. Denne fotokemiske metode har held været anvendt til behandling af destabilisering af anterior globe overfladen (dvs., de svulmende hornhinden) set i keratoconus og post-LASIK keratectasia. Dog hæmmes CXL protokollens for sclera af problemer i forbindelse med vanskeligheder i at få adgang til den bageste sclera med en ultraviolet (UV) lyskilde, samt behovet for at ændre en meget større væv areal. At bliver sagt, CXL tilgang har været brugt til at standse aksial brudforlængelse i visuel form berøvet kaniner (af tarsorrhaphy), selv om flere områder af posterior sclera krævede flere separate bestråling zoner i denne undersøgelse3. Derimod kunne injektion af en kemisk stabilisator (dvs, tværbindingsmidler agent) via sT plads repræsentere en enklere måde at ændre den posteriore sclera, undgå behovet for at indføre en UV-lyskilde. Denne injektionsteknik er kendt som en nyttig måde at inducere okulær anæstesi under oftalmologisk procedurer såsom grå stær kirurgi4,5,6. Wollensak7 har beskrevet tidligere har brug for en St. injektion ved hjælp af glyceraldehyd (en kemisk tværbindingsmidler agent samme i konceptet til formaldehyd frigive agenter (FARs) beskrevet i denne undersøgelse) at stivne kanin sclera og genipin har vist sig at begrænse aksial længde i FD marsvin8,9. Disse forskere har påvist en klar fordel ved at anvende en opløselig kemisk agens over den fotokemiske CXL teknik. Således scleral cross-linking bruger en injicerbar kemisk agens af nogle typer, herunder FARs (dvs., TXL)10, kunne give en mulig behandlingsmetode til at standse progressionen af scleral brudforlængelse set i nærsynethed.
I protokollerne præsenteres her, bruger vi en kemiske tværbindingsmidler opløsning af natrium hydroxymethylglycinat (SMG), leveret via sT injektion til sclera af dødt kanin øjne. Vi har gennemført lignende protokoller tidligere for aktuel kemiske cross-linking i hornhinden. Især i de tidligere rapporterede undersøgelser, kunne koncentration afhængige cross-linking virkninger være opnået ved hjælp af SMG, med en effekt sortiment spænder godt ovenfor der kan opnås med fotokemisk CXL, som bestemmes af termisk denaturering analyse11 .
Her beskriver vi protokoller for at vurdere den tværbindingsmidler virkning af SMG leveret via sT injektioner til scleral væv, termisk denaturering bruger Differential Scanning kalorimetri (DSC), og anden harmonisk Generation mikroskopi (SHGM).
Ved hjælp af differential scanning kalorimetri (DSC), også kendt som termisk analyse, er en termisk denaturering overgang målt, som for scleral væv er hovedsageligt styret af egenskaberne for de fibrillar collagens, da de udgør hovedparten flertal af protein. Denne metode evaluerer stabiliteten af kollagen molekylære struktur og de krydsrefererede obligationer, at stabilisere kollagen fibriller, principal tertiære protein struktur. Under varme i DSC, er en kritisk overgang temperatur opnået der resulterer i denaturering af kollagen molekyle, hvilket resulterer i uncoiling af triple helix, en proces, der danner hvad er almindeligt kendt som gelatine. Dette termiske denaturering forstyrrer hydrogenbindinger langs kollagen molekyle og kan flyttes til højere temperaturer gennem induceret tværbindingsmidler metoder12,13. Denne metode har været brugt i mange årtier, især i biomaterialer-industri og for processer, der omfatter læder-making. Men denne metode kræver udvinding af sclera væv og kan derfor kun være nyttige som en ex vivo -teknik.
Anden-harmonisk generation mikroskopi (SHGM) er baseret på de ikke-lineære optiske egenskaber af særlige materialer med ikke-centrosymmetric molekylære miljøer. I sådanne materialer, intense lys, for eksempel lys produceret af lasere, genererer SHG signaler, som den indfaldende lys er fordoblet i frekvens. Biologiske materialer, der er kendt for at skabe SHG signaler er kollagen, mikrotubuli og muskel myosin. For eksempel, vil kollagen spændt med et infrarødt lys af 860 nm bølgelængde udsender en SHG signal i det synlige spektrum med 430 nm bølgelængde. Anden harmonisk generation (SHG) signal imaging er en lovende metode til evaluering af terapeutisk kollagen cross-linking. Det har været kendt i mere end 30 år, kollagen fibriller i væv udsender SHG signaler14. Dog kunne først for nylig billeder i høj opløsning opnås15 i en række forskellige væv, herunder senen16, hud, brusk17, blodkar18, og i kollagen geler19.
Baseret på denne viden, vurderer denne undersøgelse SHG signal ændringer induceret i sclera gennem SMG kemisk induceret cross-linking af kollagen. Resultaterne viser, at SMG ændring af sclera øger SHG signaler fremstillet af væv kollagen fiber bundter (højere orden kvaternære struktur består af kollagen fibriller) og producerer også en morfologiske strukturændringer i kollagen fibernet, afspejles i fiber bundle "glatning."

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1441">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:245px;">MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td>
			<td style="width:289px;">EMD Millipore, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:796px;">Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium hydroxymethylglycinate&#160;</td>
			<td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Injection needle with luer-lock syringe</td>
			<td>BD Eclipse, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit head</td>
			<td>La Granja poultry</td>
			<td>Outbred</td>
			<td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tono-pen&#160;</td>
			<td>Reichter Technologies Depew, NY</td>
			<td></td>
			<td>IOP measurements - protocol step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DSC 6000 Autosampler</td>
			<td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pyris software&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Ver 11.0</td>
			<td>&#160;protocol step 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">GenTeal&#160;</td>
			<td>Alcon, Fort Worth, TX&#160;</td>
			<td>B000URVDQ8</td>
			<td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Chameleon Vision II&#160;</td>
			<td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AttoFluor cell chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">25-mm round coverslips, #1.5</td>
			<td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td>
			<td>GG-25-1.5</td>
			<td>protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>protocol step 8.1.4.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">A1R-MP laser scanning system</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ver 4.3</td>
			<td>refered to as &#34;software&#34; in the text - protocol step 8.1.9</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fiji/ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#160;protocol step 9.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:289px;">Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microsoft Excel&#160;</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td>
			<td>Ver 14</td>
			<td>protocol step 9.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

Metoder til at styrke væv ved at indføre kemiske bindinger (ikke-enzymatiske cross-linking) i strukturelle proteiner (fibrillar collagens) for terapi omfatter fotokemisk cross-linking og væv cross-linking (TXL) metoder. Sådanne metoder for at fremkalde mekaniske væv egenskabsændringer er ansat til hornhinden i cornea udtynding (mekanisk svækket) lidelser såsom keratoconus samt sclera i progressiv nærsynethed, hvor tyndere og svækkelsen af bageste sclera opstår og sandsynligvis bidrager til aksial brudforlængelse. Primære target proteiner for en sådan styrkelse af væv er fibrillar collagens, som udgør det store flertal af tørvægt proteiner i hornhinden og sclera. Tilfældigvis er fibrillar collagens den vigtigste kilde til anden harmonisk generation signaler i væv ekstracellulære rum. Derfor, ændringer af kollagen proteiner, som dem fremkaldt via cross-linking terapier, kunne potentielt være opdaget og quantitated ved hjælp af anden harmonisk generation mikroskopi (SHGM). Overvågning SHGM signaler ved hjælp af en laser scanning mikroskopi system kombineret med en infrarød excitations lys kilde er en spændende moderne billedbehandling metode, der nyder udbredt skik i de biomedicinske videnskaber. Således, den nuværende undersøgelse blev foretaget for at evaluere brugen af SHGM mikroskopi, som et middel til at måle inducerede tværbindingsmidler effekter i ex vivo kanin sclera, efter en indsprøjtning af et kemikalie cross-linking agent i sub-Tenons plads (sT), en injektion tilgang er standardpraksis for forårsager okulær anæstesi under oftalmologisk kliniske procedurer. De kemiske cross-linking agent, er natrium hydroxymethylglycinat (SMG), fra en klasse af kosmetiske konserveringsmidler kendt som formaldehyd frigive agenter (FARs). Scleral ændringer efter reaktion med SMG resulterede i en stigning i SHG signaler og korreleret med skiftehold i termisk denaturering temperatur, en standard metode til evaluering af induceret væv cross-linking effekter.

Termisk denaturering temperatur (Tm) som en analyse metode til at evaluere TXL cross-linking effekt: Ialt 16 par af kanin øjnene blev brugt i disse eksperimenter TXL procedure. Som et første led i denne undersøgelse, blev lokalisering af tværbindingsmidler effekt induceret af en enkelt injektion af SMG tværbindingsmidler agent via sT plads i dødt kanin hoved evalueret. Denne type af eksperiment har relevans for den kliniske behandling af patienter, da injektioner i ...

Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Anden harmonisk Generation signaler i kanin Sclera som et redskab til evaluering af terapeutisk væv Cross-linking (TXL) for nærsynethed

Denne protokol beskriver teknikker til evaluering af kemiske cross-linking af kanin sclera ved hjælp af andet harmonisk generation imaging og differential scanning kalorimetri.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Osteopatisk Manipulerende Behandling som et nyttigt Adjuverende værktøj til lungebetændelse

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

En næste-generations Tissue Microarray (ngTMA) Protokollen til biomarkør Studies

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundusfotografi som et praktisk værktøj til at studere Mikrovaskulære Responses hjertekarsygdomme Risikofaktorer epidemiologiske undersøgelser

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Terapeutisk Effektiviteten af ​​et kosttilskud for Forvaltning af halitosis i Hunde

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluering af effekten af<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP som et terapeutisk værktøj til behandling af blærekræft i en ortotopisk murin model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

MRI-guided dmPFC-rTMS as a Treatment for Treatment-resistant Major Depressive Disorder

MR-guided dmPFC-rTMS som en behandling for behandling-resistent depression

Here we outline the protocol for magnetic resonance imaging (MRI) guided repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the dorsal medial ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Scleral Cross-linking Brug riboflavin og Ultraviolet-A stråling til forebyggelse af Axial Nærsynethed i en kanin Model

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Karakterisering efter en ny Disaggregering Metode til Skin Micro-udtagne transplantater Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool i Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...