Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

De auteurs bedanken Tongalp Tezel, MD, voor raadpleging met betrekking tot sT injectie; Theresa Swayne, PhD, voor raadpleging met betrekking tot de SHG microscopie; en Jimmy Duong uit de ontwerp- en Biostatistiek Resource- alsmede de Biostatistical kern faciliteit van het Irving Institute at Columbia University Medical Center.
Deels gesteund door onderzoek te voorkomen blindheid en door de nationale instituten van gezondheid subsidies NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007 NCI P30 CA013696 en NEI R01EY020495 (DCP). Verwante intellectuele eigendom van de eigenaar van de Columbia University: U.S. afgegeven octrooien neen: 8,466,203 en no: 9,125,856. International patent aangevraagd: PCT/US2015/020276.
Beelden werden verzameld in de Confocal en gespecialiseerd microscopie gedeelde Resource van de Herbert Irving uitgebreide Cancer Center aan de Columbia University, ondersteund door de NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). De confocal microscoop werd gekocht met NIH verlenen van #S10 RR025686.

Alle procedures werden uitgevoerd met behulp van dode foetussen konijn ogen binnen intact outbred konijn hoofden. Alle institutionele en nationale richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd.
1. bereiding van de oplossingen
<ol><li>SMG voorbereiding TXL:<ol>
<li>Bereiden 1 mL 0,2 M concentratie van natriumbicarbonaat oplossing (NaHCO3) oplossing met behulp van 0.0165 g NaHCO3 poeder opgelost in 1 mL gedestilleerd water.</li>
		<li>Los 0.1016 mg po...

Uitgevoerde experimenten hebben aangetoond bewijs ter ondersteuning van het gebruik van de SHG signaal microscopie als een methode voor de evaluatie van collageen dwarsbinding effecten in sclera, verhogen van de toekomstige mogelijkheid van het gebruik van deze techniek als een controle-instrument voor de dwarsbinding behandelingen die gericht collageen eiwitten. Van de nota is een instrument al in klinische gebruik dat potentieel dit signaal SHG kan vangen. Hoewel dit instrument was vooral bedoeld voor imaging huid mens...

Progressieve myopie is gepostuleerd aan behandelbare door niet-enzymatische scleral dwarsbinding (fotochemische en/of chemische), wat logisch is gezien het feit dat het blokkeren van enzymatische cross-linking van collageen experimentele vorm ontbering (FD verhogen kan)-geïnduceerde bijziendheid1. Sheikh en Phillips2 onlangs gesproken over de haalbaarheid en de mogelijkheden voor het gebruik van standaard UV-A straling (UVA)-riboflavine gemedieerde fotochemische dwarsbinding (ook bekend als de Dresden-protocol), afgekort hier als (riboflavine CXL) voor achterste scleral stabilisatie axiale rek in bijziendheid halt toe te roepen. Deze fotochemische methode is met succes gebruikt voor de behandeling van destabilisatie van het anterieure globe-oppervlak gezien in keratoconus en post-LASIK keratectasia (d.w.z., het uitpuilende hoornvlies). Toepassing van dit protocol CXL voor de sclera wordt echter belemmerd door kwesties met betrekking tot moeilijkheden bij de toegang tot de achterste sclera met een ultraviolette lichtbron (UV), evenals de noodzaak om te wijzigen van een veel grotere weefsel oppervlakte. Dat gezegd zijnde, de CXL-aanpak is gebruikt om te stoppen axiale rek in visueel vorm beroofd konijnen (door tarsorrhaphy), hoewel meerdere regio's van posterieure sclera meerdere afzonderlijke bestraling zones in die studie3 vereist. Daarentegen kan de injectie van een chemische stabilisator en (dat wil zeggen, cross-linking agent) via de sT-ruimte een eenvoudiger manier om te wijzigen de posterieure sclera, het vermijden van de noodzaak voor de invoering van een UV-lichtbron vertegenwoordigen. Deze injectietechniek is bekend als een nuttige manier inducerende oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig procedures zoals cataract chirurgie4,5,6. Wollensak7 eerder heeft beschreven van het gebruik van een injectie van de sT met behulp van glyceraldehyde (een chemische cross-linking agent gelijkaardig in concept aan de formaldehyde die het vrijgeven van agenten (FARs) beschreven in deze studie) aan het verharden van de sclera konijn en de genipin heeft is aangetoond dat het beperken van axiale lengte in FD cavia's8,9. Deze onderzoekers hebben aangetoond dat een duidelijk voordeel van het gebruik van een chemisch agens die oplosbaar over de fotochemische CXL-techniek. Dus scleral dwarsbinding met behulp van een injecteerbare chemisch agens van een soort, met inbegrip van de FARs (d.w.z., TXL)10, kon bieden een haalbaar behandelingsmethode de progressie van scleral rek gezien in bijziendheid halt toe te roepen.
In de protocollen die hier gepresenteerd, gebruiken we een chemische cross-linking oplossing van natrium hydroxymethylglycinate (SMG), geleverd via sT injectie aan de sclera van dode foetussen konijn ogen. Wij hebben uitgevoerd soortgelijke protocollen eerder voor actuele chemische dwarsbinding in het hoornvlies. Met name in die eerder gemeld studies, kan concentratie afhankelijke dwarsbinding effecten worden verkregen met behulp van SMG, met een effect bereik verspreid over ruim boven die haalbaar zijn met fotochemische CXL zoals bepaald door de thermische denaturatie analyse11 .
We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van de cross-linking effect van SMG geleverd via sT injecties aan scleral weefsel, thermische denaturatie met behulp van differentiële Scanning Calorimetrie (DSC) en tweede harmonische generatie microscopie (SHGM).
Met behulp van differentiële scanning calorimetrie (DSC), ook bekend als thermische analyse, wordt een thermische denaturatie overgang gemeten, die voor scleral weefsel wordt hoofdzakelijk laten leiden door de eigenschappen van de fibrillar collagens, want zij de meerderheid van de bulk vormen van eiwit. Deze methode evalueert de stabiliteit van collageen moleculaire structuur en de kruiselings gekoppelde obligaties die de collageen fibrillen, de belangrijkste tertiaire eiwitstructuur stabiliseren. Tijdens de verwarming in de DSC, wordt de temperatuur van een kritische overgang bereikt die tot denaturatie van het molecuul van collageen leidt, wat resulteert in het uncoiling van de triple helix, een proces dat vormt wat is algemeen bekend als gelatine. Deze thermische denaturatie verstoort waterstofbruggen langs de collageen-molecuul en aan hogere temperaturen door geïnduceerde cross-linking methoden12,13kan worden verschoven. Deze methode is gebruikt voor vele decennia, met name in de industrie biomaterialen en processen met leder te maken. Echter, deze methode vereist extractie van de sclera weefsel en dus kan alleen nuttig zijn als een ex vivo -techniek.
Tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM) is gebaseerd op de niet-lineaire optische eigenschappen van bepaalde materialen, met niet-centrosymmetric moleculaire omgevingen. In dergelijke materialen, intens licht, bijvoorbeeld licht geproduceerd door lasers, genereert SHG signalen, waarin het invallende licht wordt verdubbeld in frequentie. Biologische stoffen waarvan bekend is dat het maken van de SHG signalen zijn collageen, microtubuli en spier myosin. Collageen enthousiast met een infrarood licht van 860 nm golflengte zal bijvoorbeeld een signaal van de SHG in het zichtbare bereik met 430 nm golflengte uitzenden. Tweede harmonische generatie (SHG) signaal imaging is een veelbelovende methode voor de beoordeling van de therapeutische collageen dwarsbinding. Het is gekend voor meer dan 30 jaar dat collageen fibrillen in weefsels SHG signalen14 uitstoten. Echter kon pas onlangs hoge resolutiebeelden worden verkregen15 in een verscheidenheid van weefsel, met inbegrip van de pees16, kraakbeen17, huid en bloedvaten18, en in collageen gels19.
Deze studie is gebaseerd op deze kennis, en evalueert de SHG signaal veranderingen in de sclera via SMG chemisch geïnduceerde cross-linking van collageen. De resultaten wijzen erop dat SMG wijziging van de sclera de signalen van de SHG geproduceerd uit weefsel collageen vezelbundels (de hogere orde quaternaire structuur bestaat uit collageen fibrillen verhoogt) en ook een structurele morfologische veranderingen in de collageen produceert glasvezelnetwerk, weerspiegeld in de vezel bundel "straighten."

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1441">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:245px;">MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td>
			<td style="width:289px;">EMD Millipore, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:796px;">Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium hydroxymethylglycinate&#160;</td>
			<td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Injection needle with luer-lock syringe</td>
			<td>BD Eclipse, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit head</td>
			<td>La Granja poultry</td>
			<td>Outbred</td>
			<td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tono-pen&#160;</td>
			<td>Reichter Technologies Depew, NY</td>
			<td></td>
			<td>IOP measurements - protocol step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DSC 6000 Autosampler</td>
			<td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pyris software&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Ver 11.0</td>
			<td>&#160;protocol step 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">GenTeal&#160;</td>
			<td>Alcon, Fort Worth, TX&#160;</td>
			<td>B000URVDQ8</td>
			<td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Chameleon Vision II&#160;</td>
			<td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AttoFluor cell chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">25-mm round coverslips, #1.5</td>
			<td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td>
			<td>GG-25-1.5</td>
			<td>protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>protocol step 8.1.4.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">A1R-MP laser scanning system</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ver 4.3</td>
			<td>refered to as &#34;software&#34; in the text - protocol step 8.1.9</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fiji/ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#160;protocol step 9.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:289px;">Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microsoft Excel&#160;</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td>
			<td>Ver 14</td>
			<td>protocol step 9.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

Methoden ter versterking van weefsel door de invoering van chemische bindingen (niet-enzymatische dwarsbinding) tot structurele proteïnen (fibrillar collagens) voor therapie omvatten fotochemische dwarsbinding en weefsel (TXL) methoden dwarsbinding. Dergelijke methoden voor mechanische weefsel eigenschapswijzigingen inducerende gebruikt om het hoornvlies in hoornvlies dunner (mechanisch verzwakt) aandoeningen zoals keratoconus evenals de sclera in progressieve myopie, waar vermagering en verzwakking van de posterior Sclera optreedt en waarschijnlijk draagt bij aan de axiale rek. De eiwitten van de primaire doelgroep voor de versterking van dergelijke weefsel zijn fibrillar collagens, die de grote meerderheid van drooggewicht eiwitten in de cornea en sclera vormen. Toevalligerwijs, zijn fibrillar collagens de belangrijkste bron van tweede-harmonische generatie signalen in de extracellulaire ruimte van weefsel. Daarom, wijzigingen van de collageen-eiwitten, zoals degenen geïnduceerd door dwarsbinding therapieën, konden potentieel worden gedetecteerd en quantitated met behulp van tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM). Bewaking SHGM signalen door het gebruik van een laser scanning microscopie systeem in combinatie met een infrarood excitatie licht bron is een spannende moderne beeldvorming methode dat is genieten van wijdverbreide gebruik in de Biomedische Wetenschappen. Dus de huidige studie werd uitgevoerd om te evalueren van het gebruik van SHGM microscopie als een middel voor het meten van geïnduceerde cross-linking effecten in ex vivo konijn sclera, na een injectie van een chemische stof dwarsbinding agent in de sub-Tenon ruimte (sT), een injectie aanpak dat is gebruikelijk voor het veroorzaken van oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig klinische procedures. De chemische stof dwarsbinding agent, is natrium hydroxymethylglycinate (SMG), van een klasse van cosmetische conserveermiddelen formaldehyde vrijgeven van agenten (FARs) genoemd. Scleral wijzigingen na reactie met SMG resulteerde in stijgingen van de SHG signalen en gecorreleerd met verschuivingen in thermische denaturatie temperatuur, een standaardmethode voor het evalueren van geïnduceerde weefsel dwarsbinding effecten.

Thermische denaturatie temperatuur (Tm) als een test method to evaluate methode TXL dwarsbinding effect: Een totaal van 16 paren van konijn ogen werden gebruikt in deze experimenten voor de TXL-procedure. Als een eerste deel van deze studie, werd de lokalisatie van cross-linking effect geïnduceerd door een enkele injectie van de cross-linking agent SMG via sT ruimte in het hoofd van dode foetussen konijn geëvalueerd. Dit type experiment sinds relevantie voor de klinisch...

Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Tweede harmonische generatie signalen in konijn Sclera als een instrument voor de beoordeling van de therapeutische weefsel dwarsbinding (TXL) voor bijziendheid

Dit protocol beschrijft technieken voor de beoordeling van de chemische cross-linking van het konijn sclera met behulp van tweede-harmonische generatie beeldvorming en differentiële scanning calorimetrie.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

Generatie van Integrale Thoracale Oncologie Database - Tool voor Translationeel Onderzoek

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Osteopathische manipulatieve behandeling als een nuttig hulpmiddel voor Adjunctive Longontsteking

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Een volgende generatie Tissue microarray (ngTMA) Protocol voor Biomarker Studies

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundus fotografie als een handig hulpmiddel om microvasculaire Reacties op hart-en vaatziekten Risicofactoren in epidemiologische studies Studie

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Therapeutische effectiviteit van een voedingssupplement voor Management van halitose bij honden

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluatie van de werkzaamheid van de<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP als een therapeutisch hulpmiddel voor de behandeling van blaaskanker in een orthotope Murine Model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

MRI-guided dmPFC-rTMS as a Treatment for Treatment-resistant Major Depressive Disorder

MRI-geleide dmPFC-rTMS als een behandeling voor de behandeling-resistente Depressieve stoornis

Here we outline the protocol for magnetic resonance imaging (MRI) guided repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the dorsal medial ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Scleral Cross-linking Met behulp van riboflavine en UV-A straling voor de preventie van Axial Bijziendheid in een konijn Model

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...