Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Gli autori ringraziano Tongalp Tezel, MD, per la consultazione per quanto riguarda sT iniezione; Theresa Swayne, PhD, di consultazione in proposito SHG microscopia; e Jimmy Duong dal Design e Biostatistica risorsa e la funzione di memoria di biostatistica dell'Irving Institute presso la Columbia University Medical Center.
Supportato in parte dalla ricerca per prevenire la cecità e da istituti nazionali di salute sovvenzioni NCRR UL1RR024156, nia P30 EY019007, NCI P30 CA013696 e NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possiede proprietà intellettuale correlati: US rilasciati brevetti no: 8.466.203 e no: 9.125.856. In attesa di brevetto internazionale: PCT/US2015/020276.
Immagini sono state raccolte nel confocale e specializzata di microscopia Shared Resource di Herbert Irving Comprehensive Cancer Center presso la Columbia University, supportato da NIH concedere #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Il microscopio confocale è stato acquistato con NIH concedere #S10 RR025686.

Tutte le procedure sono state effettuate utilizzando gli occhi dei conigli cadaverico all'interno di teste di coniglio nazionali intatto. Sono state seguite tutti istituzionale e nazionale le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparazione di SMG per TXL:<ol>
<li>Preparare 1 mL di concentrazione di 0,2 M di soluzione di bicarbonato di sodio soluzione (NaHCO3) utilizzando 0,0165 g di NaHCO3 polvere disciolta in 1 mL...

Esperimenti condotti hanno dimostrato la prova sostiene l'uso di microscopia SHG segnale come un metodo per la valutazione di cross-linking effetti sclera, sollevando la possibilità futura di usare questa tecnica come strumento di monitoraggio per trattamenti di cross-linking del collagene che destinazione proteine del collagene. Della nota, uno strumento è già in uso clinico che potenzialmente in grado di catturare questo segnale SHG. Anche se questo strumento è stato progettato principalmente per imaging derma di p...

Miopia progressiva è postulata per essere curabile attraverso reticolazione scleral non enzimatici (fotochimica e/o chimica), che ha un senso dato che bloccando la reticolazione del collagene enzimatica può aumentare la privazione di forma sperimentale (FD)-indotta miopia1. ElSheikh e Phillips2 recentemente discusso la fattibilità e il potenziale di utilizzo standard irradiazione ultravioletta-A (UVA)-riboflavina mediata reticolazione fotochimica (noto anche come il protocollo di Dresda), abbreviato qui come (riboflavina CXL) per stabilizzazione scleral posteriore fermare allungamento assiale nella miopia. Questo metodo fotochimico è stato utilizzato con successo per il trattamento di destabilizzazione della superficie anteriore del globo (cioè, la cornea sporgente) vista in keratectasia cheratocono e alberino-LASIK. Tuttavia, applicazione del presente protocollo CXL per la sclera è ostacolata da questioni legate alla difficoltà di accesso alla sclera posteriore con una sorgente di luce ultravioletta (UV), come pure la necessità di modificare una molto tessuto superficie maggiore. Che essendo detto, l'approccio CXL è stato utilizzato per fermare allungamento assiale visivamente modulo privato conigli (da tarsorrhaphy), anche se le regioni multiple di sclera posteriore richiesto più zone di irradiazione separati in quello Studio3. Al contrario, l'iniezione di un agente chimico di stabilizzazione (cioè, agente reticolante) tramite lo spazio di sT potrebbe rappresentare un modo più semplice per modificare la sclera posteriore, evitando la necessità di introdurre una fonte di luce UV. Questa tecnica di iniezione è ben nota come un modo utile di indurre anestesia oculare durante le procedure oftalmologiche ad esempio cataratta chirurgia4,5,6. WOLLENSAK7 ha descritto in precedenza l'uso di un'iniezione di sT utilizzando gliceraldeide (un cross-linking agente chimico simile nel concetto alla formaldeide distaccanti (FARs) descritti in questo studio) per irrigidire il coniglio sclera e Genipina ha dimostrato di limitare la lunghezza assiale in FD cavie8,9. Questi ricercatori hanno dimostrato un chiaro vantaggio dell'utilizzo di un agente chimico solubile rispetto la tecnica CXL fotochimica. Così, scleral reticolazione utilizzando un agente chimico iniettabile di qualche tipo, tra cui la FARs (cioè, TXL)10, potrebbe fornire un metodo di trattamento fattibile per arrestare la progressione dell'allungamento scleral visto nella miopia.
Nei protocolli presentati qui, usiamo una soluzione reticolazione chimica di sodio hydroxymethylglycinate (SMG), consegnata tramite iniezione sT allo sclera degli occhi di coniglio cadaverico. Abbiamo implementato protocolli simili precedentemente per la reticolazione chimica d'attualità nella cornea. In particolare in quegli studi precedentemente segnalati, concentrazione-dipendente di cross-linking effetti poteva essere ottenuta utilizzando SMG, con un intervallo di effetto che si estende ben superiore a quella ottenibile con CXL fotochimica, come determinato mediante analisi di denaturazione termica11 .
Qui descriviamo protocolli per valutare l'effetto di cross-linking di SMG consegnati tramite iniezioni di sT al tessuto sclerale, denaturazione termica mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC) e la seconda armonica generazione microscopia (SHGM).
Mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC), noto anche come analisi termica, una transizione di denaturazione termica è misurata, che per il tessuto sclerale è prevalentemente guidato dalle proprietà di collageni fibrillari, poiché essi costituiscono la maggioranza di massa della proteina. Questo metodo consente di valutare la stabilità della struttura molecolare del collagene e i legami cross-linked che stabilizzano le fibrille di collagene, la struttura principale e terziaria della proteina. Durante il riscaldamento nel DSC, si raggiunge una temperatura di transizione critica che provoca la denaturazione della molecola del collagene, con conseguente srotolamento della tripla elica, un processo che forma ciò che è comunemente noto come gelatina. La denaturazione termica interrompe legami idrogeno lungo la molecola di collagene e può essere spostata a temperature più elevate attraverso indotta cross-linking metodi12,13. Questo metodo è stato utilizzato per molti decenni, in particolare nel settore dei biomateriali e per i processi che includono cuoio-fare. Tuttavia, questo metodo richiede l'estrazione del tessuto sclera e pertanto può essere solo utile come tecnica di ex vivo .
Microscopia di generazione di seconda armonica (SHGM) si basa sulle proprietà ottiche non lineari di materiali particolari, con ambienti molecolare non-centrosimmetrici. In tale materiale, luce intensa, ad esempio luce prodotta dai laser, genera segnali SHG, in cui la luce incidente è raddoppiata in frequenza. Materiali biologici che sono noti per creare segnali SHG sono collagene, microtubuli e miosina muscolare. Ad esempio, collagene eccitato con una luce infrarossa di lunghezza d'onda di 860 nm emette un segnale SHG nel campo visibile con lunghezza d'onda di 430 nm. Seconda generazione armonica (SHG) segnale imaging è un promettente metodo per valutare la reticolazione del collagene terapeutico. Esso è stato conosciuto per più di 30 anni che le fibrille di collagene nei tessuti emettono SHG segnali14. Tuttavia, solo recentemente immagini ad alta risoluzione si otteneva15 in una varietà di tessuti, compreso il tendine16, pelle, cartilagine17, vasi sanguigni18e in collagene gel19.
Basati su questa conoscenza, questo studio valuta i cambiamenti del segnale SHG indotti nella sclera attraverso SMG chimicamente indotta cross-linking del collagene. I risultati indicano che SMG modifica dello sclera aumenta i segnali SHG prodotti da fasci di fibre collagene del tessuto (il più alto ordine struttura quaternaria composta da fibrille collagene) e produce anche un cambiamento morfologico strutturale del collagene rete in fibra ottica, riflessa in fibra bundle "raddrizzare".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1441">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:245px;">MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td>
			<td style="width:289px;">EMD Millipore, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:796px;">Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium hydroxymethylglycinate&#160;</td>
			<td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Injection needle with luer-lock syringe</td>
			<td>BD Eclipse, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit head</td>
			<td>La Granja poultry</td>
			<td>Outbred</td>
			<td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tono-pen&#160;</td>
			<td>Reichter Technologies Depew, NY</td>
			<td></td>
			<td>IOP measurements - protocol step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DSC 6000 Autosampler</td>
			<td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pyris software&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Ver 11.0</td>
			<td>&#160;protocol step 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">GenTeal&#160;</td>
			<td>Alcon, Fort Worth, TX&#160;</td>
			<td>B000URVDQ8</td>
			<td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Chameleon Vision II&#160;</td>
			<td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AttoFluor cell chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">25-mm round coverslips, #1.5</td>
			<td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td>
			<td>GG-25-1.5</td>
			<td>protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>protocol step 8.1.4.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">A1R-MP laser scanning system</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ver 4.3</td>
			<td>refered to as &#34;software&#34; in the text - protocol step 8.1.9</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fiji/ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#160;protocol step 9.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:289px;">Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microsoft Excel&#160;</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td>
			<td>Ver 14</td>
			<td>protocol step 9.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

Metodi per rinforzare il tessuto introducendo legami chimici (cross-linking non enzimatica) in proteine strutturali (collageni fibrillari) per la terapia includono cross-linking fotochimico e cross-linking metodi (TXL) del tessuto. Tali metodi per indurre i cambiamenti di proprietà meccaniche del tessuto sono essere impiegati per la cornea nei disordini di assottigliamento corneale (meccanicamente indebolito) come cheratocono, nonché la sclera in miopia progressiva, dove diradamento e indebolimento del posteriore sclera si verifica e probabilmente contribuisce all'allungamento assiale. Le proteine bersaglio primario per tale rafforzamento del tessuto sono collageni fibrillari che costituiscono la grande maggioranza delle proteine di peso a secco nella cornea e sclera. Fortuitamente, collageni fibrillari sono la principale fonte di seconda generazione armonica segnali nello spazio extracellulare dei tessuti. Pertanto, modificazioni delle proteine del collagene, quali quelli indotti tramite cross-linking terapie, potenzialmente potrebbero essere rilevate e quantificate attraverso l'uso di microscopia di seconda generazione di armoniche (SHGM). Monitoraggio SHGM segnali attraverso l'uso di un sistema di microscopia accoppiato con un'eccitazione a infrarossi luce di scansione laser di origine è un metodo di imaging moderno emozionante che sta godendo l'uso diffuso nelle scienze biomediche. Così, lo studio presente è stato intrapreso per valutare l'uso di microscopia SHGM come un mezzo per misurare indotta cross-linking effetti ex vivo la sclera di coniglio, segue un'iniezione di una sostanza chimica agente reticolante nello spazio di sub-Tenon (sT), un iniezione di approccio che è pratica standard per causare anestesia oculare durante le procedure cliniche oftalmologiche. La chimica agente reticolante, sodio hydroxymethylglycinate (SMG), è da una classe di conservanti cosmetici conosciuto come formaldeide distaccanti (FARs). Cambiamenti scleral dopo reazione con SMG provocato gli aumenti in SHG segnali e correlati con i cambiamenti nella temperatura di denaturazione termica, un metodo standard per valutare indotta cross-linking effetti del tessuto.

Temperatura di denaturazione termica (Tm) come un metodo di dosaggio per valutare TXL cross-linking effetto: Un totale di 16 paia di occhi di coniglio sono stati utilizzati in questi esperimenti per la procedura TXL. Come una parte iniziale di questo studio, è stata valutata la localizzazione di cross-linking effetto indotto tramite una singola iniezione di agente reticolante SMG via sT spazio alla testa di coniglio cadaverico. Questo tipo di esperimento ha rilevanza per...

Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Seconda generazione di armoniche segnali coniglio sclera come strumento per la valutazione del tessuto terapeutico reticolazione (TXL) per la miopia

Questo protocollo descrive le tecniche per la valutazione di reticolazione chimica dello sclera coniglio mediante generazione di seconda armonica imaging e Calorimetria a scansione differenziale.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

Generazione di Comprehensive Database Oncologia Toracica - Strumento per la ricerca traslazionale

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Ricerca

Medicina

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Trattamento manipolativo osteopatico come strumento aggiuntiva Utile per polmonite

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Una nuova generazione Tissue Microarray (ngTMA) Protocollo per Biomarker Studi

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundus Fotografia come un comodo strumento per studiare le risposte microvascolari a malattie cardiovascolari Fattori di rischio in studi epidemiologici

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Efficacia terapeutica di un supplemento dietetico per la gestione di alitosi in Cani

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Valutazione dell&#39;efficacia della<em&gt; H. pylori</em&gt; Proteine ​​HP-NAP come strumento terapeutico per il trattamento del cancro della vescica in un ortotopico Modello murino

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

MRI-guided dmPFC-rTMS as a Treatment for Treatment-resistant Major Depressive Disorder

MRI-guidata dmPFC-rTMS come Trattamento di trattamento resistente Disturbo Depressivo Maggiore

Here we outline the protocol for magnetic resonance imaging (MRI) guided repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the dorsal medial ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Sclerale reticolazione Utilizzando riboflavina e raggi ultravioletti-A di radiazione per la prevenzione della miopia assiale in un modello di coniglio

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Caratterizzazione dopo un metodo nuovo disaggregazione per Skin Micro-innesti Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...