Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Forfatterne takker Tongalp Tezel, MD, for konsultasjon om sT injeksjon; Theresa Swayne, PhD, for konsultasjon om SHG mikroskopi; og Jimmy Duong fra Design og biostatistikk ressurs og funksjonen Biostatistical kjernen av Irving Institute ved Columbia University Medical Center.
Støttes delvis ved forskning for å hindre blindhet og nasjonale institutter for helse tilskudd NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 og NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University eier relaterte immaterielle: amerikanske utstedte patenter no: 8,466,203 og ingen: 9,125,856. International patentanmeldt: PCT/US2015/020276.
Bildene ble samlet i Confocal og spesialisert mikroskopi delt ressurs av Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, støttet av NIH gi #P30 CA013696 (National Cancer Institute). AC confocal mikroskop ble kjøpt med NIH gi #S10 RR025686.

Alle prosedyrer som ble utført med cadaveric kaninøyne innen intakt outbred kanin hoder. Alle Institutional og nasjonale retningslinjer og bruk av forsøksdyr ble fulgt.
1. forberedelse av løsninger
<ol><li>SMG forberedelse til TXL:<ol>
<li>Forberede 1 mL av 0,2 M konsentrasjon av natrium bikarbonat løsning (NaHCO3) løsning med 0.0165 g NaHCO3 pulver oppløst i 1 mL destillert vann.</li>
		<li>Oppløse 0.1016 mg av pulverisert natrium hydroxymethylglycinate (SMG) i 1 mL desti...

Utført eksperimenter har vist bevis som støtter bruk av SHG signal mikroskopi som en metode for evaluering av kollagen cross-linking effekter i sclera, øke fremtidige muligheten til å bruke denne teknikken som avlytting verktøyet for cross-linking behandlinger som mål kollagen proteiner. Av notatet er et instrument allerede i klinisk bruk som potensielt kan fange SHG signalet. Selv om dette instrumentet ble hovedsakelig utformet for imaging huden menneskelige dermis, er det brukt med hell bilde hornhinnen og sclera...

Progressiv myopi er postulert skal behandles gjennom ikke-enzymatisk Innbukking cross-linking (fotokjemisk og/eller kjemisk), som er fornuftig gitt at blokkerer kollagen enzymatisk cross-linking kan øke eksperimentelle skjemaet deprivasjon (FD)-indusert nærsynthet1. Elsheikh og Phillips2 nylig diskutert gjennomførbarhet og potensialet for å bruke standard UV-A bestråling (UVA)-riboflavin mediert fotokjemisk cross-linking (også kjent som Dresden protocol), forkortet som (riboflavin CXL) for bakre Innbukking stabilisering å stanse aksial forlengelse i myopi. Denne fotokjemisk metoden har blitt brukt til behandling av destabilisering av fremre verden overflaten (dvs., svulmende hornhinnen) sett i keratoconus og stolpe-LASIK keratectasia. Men hindret anvendelsen av denne CXL protokollen for sclera av spørsmål knyttet til vanskeligheter med tilgang til bakre sclera med en ultrafiolett (UV) lys kilde, samt behovet for å endre en mye større vev areal. Som blir sagt, CXL tilnærmingen er brukt til å stoppe aksial forlengelse i visuelt skjemaet fratatt kanin (av tarsorrhaphy), selv om flere områder av bakre sclera kreves flere separate bestråling soner i at studien3. Derimot kan injeksjon av en stabiliserende kjemiske middel (dvs., cross-linking agent) via sT plassen representere en enklere måte endre bakre sclera, unngå behovet for å innføre en UV lyskilde. Denne injeksjon teknikken er kjent som en nyttig måte å indusere okulær anestesi under ophthalmologic prosedyrer som cataract kirurgi4,5,6. Wollensak7 har beskrevet tidligere bruk av sT injeksjon med glyceraldehyde (en kjemisk cross-linking agent lignende i konsept til formaldehyd slippe agenter (FARs) beskrevet i denne studien) til stive kanin sclera og genipin vist seg å begrense aksial lengde i FD marsvin8,9. Disse etterforskere har vist en klar fordel av benytter en løselig kjemiske middel over fotokjemisk CXL teknikken. Dermed Innbukking cross-linking bruker en injiserbare kjemiske middel av noen type, inkludert FARs (dvs., TXL)10, kan gi en mulig behandlingsmetode å stoppe utviklingen av Innbukking forlengelse sett i myopi.
I protokollene som presenteres her, bruker vi en kjemisk cross-linking løsning av natrium hydroxymethylglycinate (SMG), levert via sT injeksjon til sclera cadaveric kanin øyne. Vi har implementert lignende protokollene tidligere for aktuell kjemiske cross-linking i hornhinnen. Spesielt i de tidligere rapportert studiene, kan konsentrasjon avhengige cross-linking effekter oppnås ved hjelp av SMG, med en effekt rekkevidde som spenner over som oppnåelig med fotokjemisk CXL som termisk rødsprit analyse11 .
Her beskriver vi for å vurdere cross-linking effekten av SMG levert via sT injeksjoner til Innbukking vev, termisk rødsprit differensial skanning Calorimetry (DSC) og andre harmonisk generasjon mikroskopi (SHGM).
Ved hjelp av differensial skanning calorimetry (DSC), også kjent som termisk analyse, er en termisk rødsprit overgang målt, som for Innbukking vev er hovedsakelig guidet av egenskapene til de fibrillar collagens, siden de utgjør flertallet bulk protein. Denne metoden evaluerer stabiliteten av kollagen molekylær struktur og krysskoblet obligasjoner som stabiliserer kollagen fibrils, den fremste tertiære protein-strukturen. Under oppvarming i DSC, er en kritisk overgang temperatur oppnådd som resulterer i denaturering av kollagen molekylet, noe som resulterer i uncoiling av trippel helix, en prosess som det er kjent som gelatin. Dette termiske rødsprit forstyrrer hydrogenbindinger langs kollagen molekylet og kan bli forskjøvet til høyere temperaturer gjennom indusert cross-linking metoder12,13. Denne metoden er brukt i mange tiår, spesielt i industrien for biologisk materiale og prosesser som inkluderer skinn-making. Men denne metoden krever utvinning av sclera vev og derfor kan bare være nyttig som en ex vivo teknikk.
Andre-harmoniske generasjon mikroskopi (SHGM) er basert på den ikke-lineære optiske egenskapene av bestemt materiale, med ikke-centrosymmetric molekylær miljøer. Slike materialene intens lys, for eksempel lys produsert av lasere, genererer SHG signaler, der det innfallende lyset er doblet i frekvens. Biologisk materiale som kan opprette SHG signaler er kollagen, piskehale som henger og muskel myosin. For eksempel vil kollagen spent med et infrarødt lys av 860 nm bølgelengde avgi en SHG signalet i det synlige området med 430 nm bølgelengde. Andre harmonisk generasjon (SHG) signal imaging er en lovende metode for å vurdere terapeutiske kollagen cross-linking. Det har vært kjent i over 30 år at kollagen fibrils vev avgir SHG signaler14. Men kan bare nylig Høyoppløslige bilder hentes15 ulike vev, inkludert sene16, hud, brusk17, blodkar18, og kollagen gels19.
Basert på denne kunnskapen, evaluerer denne studien SHG signal endringene indusert i sklera gjennom SMG kjemisk indusert cross-linking av kollagen. Resultatene tyder på at SMG endring av sclera øker SHG signalene produsert fra vev kollagen fiber bunter (høyere orden kvartær strukturen består av kollagen fibrils) og produserer også en strukturell morfologiske endring i kollagen nettverk, gjenspeiles i fiber bunt "rette."

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1441">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:245px;">MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td>
			<td style="width:289px;">EMD Millipore, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:796px;">Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium hydroxymethylglycinate&#160;</td>
			<td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Injection needle with luer-lock syringe</td>
			<td>BD Eclipse, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit head</td>
			<td>La Granja poultry</td>
			<td>Outbred</td>
			<td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tono-pen&#160;</td>
			<td>Reichter Technologies Depew, NY</td>
			<td></td>
			<td>IOP measurements - protocol step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DSC 6000 Autosampler</td>
			<td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pyris software&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Ver 11.0</td>
			<td>&#160;protocol step 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">GenTeal&#160;</td>
			<td>Alcon, Fort Worth, TX&#160;</td>
			<td>B000URVDQ8</td>
			<td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Chameleon Vision II&#160;</td>
			<td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AttoFluor cell chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">25-mm round coverslips, #1.5</td>
			<td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td>
			<td>GG-25-1.5</td>
			<td>protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>protocol step 8.1.4.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">A1R-MP laser scanning system</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ver 4.3</td>
			<td>refered to as &#34;software&#34; in the text - protocol step 8.1.9</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fiji/ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#160;protocol step 9.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:289px;">Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microsoft Excel&#160;</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td>
			<td>Ver 14</td>
			<td>protocol step 9.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

Metoder for å styrke vev ved å innføre kjemisk obligasjoner (ikke-enzymatisk cross-linking) i strukturelle proteiner (fibrillar collagens) for terapi inkluderer fotokjemisk cross-linking og vev cross-linking (TXL) metoder. Slike metoder for å indusere mekanisk vev endringer er blir ansatt å hornhinnen i hornhinnen tynning (mekanisk svekket) lidelser som keratokonus samt sclera i progressiv myopi, tynt og svekkelsen av bakre sclera oppstår og trolig bidrar til aksial forlengelse. De primære målet proteinene for slike vev styrke er fibrillar collagens som utgjør majoriteten av tørrvekt proteiner i hornhinnen og sclera. Tilfeldig, er fibrillar collagens den viktigste kilden til andre harmonisk generasjon signaler i vev ekstracellulære plass. Derfor kan modifikasjoner av kollagen proteiner, slik som indusert gjennom cross-linking terapier, potensielt oppdages og quantitated ved hjelp av andre harmonisk generasjon mikroskopi (SHGM). Overvåking SHGM signaler ved hjelp av en laser skanning mikroskopi systemet kombinert med excitation infrarødt lys er en spennende moderne bildebehandling metode som nyter utstrakt bruk i biomedisinsk vitenskapene. Derfor studien ble gjennomført for å vurdere bruken av SHGM mikroskopi som et middel til å måle indusert cross-linking effekter i ex vivo kanin sclera, etter injeksjon av en kjemisk cross-linking agent i sub-Tenon plass (sT), en injeksjon tilnærming som er vanlig praksis for forårsaker okulær anestesi under ophthalmologic kliniske prosedyrer. Kjemisk cross-linking agent, er natrium hydroxymethylglycinate (SMG), en klasse av kosmetiske konserveringsmidler kjent som formaldehyd slippe agenter (FARs). Innbukking endringer etter reaksjon med SMG resulterte i en økning i SHG signaler og korrelert med endringer i termisk rødsprit temperatur, en standardmetode for å vurdere indusert vev cross-linking effekter.

Termisk rødsprit temperatur (Tm) som en analysen metode for å vurdere TXL cross-linking effekt: Totalt 16 par kaninøyne ble brukt i disse eksperimentene TXL fremgangsmåten. Som en første del av denne studien, ble lokalisering av cross-linking effekten indusert av en enkelt injeksjon SMG cross-linking agent via sT plass i cadaveric kanin hodet evaluert. Denne typen eksperiment har relevans til klinisk behandling av pasienter, siden injeksjoner i flere steder kan være...

Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Andre harmonisk generasjon signaler i kanin Sclera som et verktøy for evaluering av terapeutiske vev Cross-linking (TXL) for nærsynthet

Denne protokollen beskriver teknikker for å vurdere kjemiske cross-linking av kanin sclera bruker andre harmonisk generasjon bildebehandling og differensial skanning calorimetry.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Osteopatisk manipulerende behandling som et nyttig Adjunctive verktøy for lungebetennelse

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

En Neste generasjons Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll for biomarkør studier

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundusfotografering som et praktisk verktøy for å studere mikrovaskulær Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors i epidemiologiske studier

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Terapeutiske effekten av et kosttilskudd for styring av halitosis i Dogs

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Vurdering av effektiviteten av<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP som et terapeutisk verktøy for behandling av blærekreft i en ortotopiske Murine Model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

MRI-guided dmPFC-rTMS as a Treatment for Treatment-resistant Major Depressive Disorder

MR-veiledet dmPFC-rTMS som behandling for behandlingsresistent depresjon

Here we outline the protocol for magnetic resonance imaging (MRI) guided repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the dorsal medial ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Skleral Cross-linking Bruke Riboflavin og ultrafiolett-A stråling for forebygging av Axial nærsynthet i et Rabbit Modell

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Karakterisering etter en ny Disaggregering metode for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; I Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...