Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00
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Os autores agradecer Tongalp Tezel, MD, para consulta a respeito da injeção de sT; Theresa Swayne, PhD, para consulta sobre microscopia SHG; e Jimmy Duong desde o projeto e recurso de Bioestatística e a facilidade do núcleo Biostatistical do Instituto Irving na Columbia University Medical Center.
Suportado em parte pela pesquisa para evitar cegueira e pelos institutos nacionais de saúde subsídios NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 e NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possui propriedade intelectual relacionada: U.S. emitida patentes n: 8.466.203 e não: 9.125.856. Patente pendente internacional: PCT/US2015/020276.
Imagens foram coletadas no Confocal e especializada microscopia recurso compartilhado do Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, na Universidade de Columbia, suportado pelo NIH conceder #P30 CA013696 (National Cancer Institute). O microscópio confocal foi comprado com NIH conceder #S10 RR025686.

Todos os procedimentos foram realizados usando olhos de coelho cadavérico dentro de cabeças de coelho outbred intacta. Seguiam-se todos e institucional Nacional orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
1. preparação de soluções
<ol><li>Preparação de SMG para TXL:<ol>
<li>Prepare-se 1 mL da concentração de 0,2 M de solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) de solução usando 0,0165 g de NaHCO3 em pó dissolvido em 1 mL de água destilada.</li>
	...

Experimentos realizados mostraram evidências que sustentam o uso da microscopia de sinal SHG como um método para avaliação de efeitos na esclera, levantando a possibilidade futura de utilizar esta técnica como uma ferramenta de monitoramento para cross-linking tratamentos do cross-linking de colágeno que destino proteínas de colágeno. De nota, um instrumento já está em uso clínico que potencialmente pode capturar este sinal SHG. Embora este instrumento foi projetado principalmente para imagiologia derme humana...

Miopia progressiva é postulada para ser tratável através de não enzimáticos scleral cross-linking (fotoquímicos e/ou química), que faz sentido, dado que o bloqueio do cross-linking enzimática colágeno pode aumentar a privação de forma experimental (FD)-induzido miopia,1. ElSheikh e Phillips2 recentemente discutido a viabilidade e o potencial do uso padrão irradiação ultravioleta-A (UVA)-riboflavina mediada fotoquímica do cross-linking (também conhecido como o protocolo de Dresden), abreviado aqui como (riboflavina CXL) para estabilização posterior scleral travar o alongamento axial na miopia. Esse método fotoquímico utilizou com sucesso no tratamento de desestabilização da superfície do globo anterior (ou seja, a córnea abaulamento) vista em keratectasia do keratoconus e do borne-LASIK. No entanto, aplicação do presente protocolo CXL para a esclera é dificultada por questões relacionadas com dificuldades em acessar a esclera posterior com uma fonte de luz ultravioleta (UV), bem como a necessidade de modificar uma muito maior tecido área de superfície. Que sendo dito, a abordagem CXL tem sido usada para travar o alongamento axial na forma visualmente privado coelhos (por tarsorrhaphy), apesar de várias regiões da esclera posterior necessário várias zonas distintas de irradiação em que estudo3. Por outro lado, a injeção de um agente estabilizador químico (ou seja, agente do cross-linking) através do espaço de sT poderia representar uma forma mais simples para modificar a esclera posterior, evitando a necessidade de introdução de uma fonte de luz UV. Esta técnica de injeção é conhecida como uma maneira útil de induzir anestesia ocular durante procedimentos oftalmológicos, como cirurgia de catarata a4,5,6. Wollensak7 tem descrito anteriormente, o uso de uma injeção de sT usando gliceraldeído (cross-linking agente químico similar em conceito para o formaldeído liberando agentes (FARs) descritos neste estudo) endurecer a esclera coelho e Genipina tem foram mostrados para limitar o comprimento axial em FD cobaias8,9. Estes investigadores demonstraram uma clara vantagem de usar um agente químico solúvel sobre a técnica CXL fotoquímica. Assim, scleral cross-linking usando um agente químico injetável de algum tipo, incluindo FARs (i.e., TXL)10, poderia fornecer um método de tratamento viável para deter a progressão do alongamento scleral visto na miopia.
Os protocolos aqui apresentados, usamos uma solução química do cross-linking de hidroximetilglicinato de sódio (SMG), entregada através da injeção de sT para a esclera dos olhos de coelho cadavérico. Temos implementado protocolos semelhantes anteriormente para reticulação química tópica na córnea. Nomeadamente os estudos anteriormente relatados, concentração dependente do cross-linking efeitos pode ser obtida usando SMG, com uma gama de efeito bem acima de abrangência realizáveis com fotoquímico CXL, conforme determinado pela análise de desnaturação térmica11 .
Aqui descrevemos os protocolos para avaliar o efeito do cross-linking de SMG entregada via sT injeções ao tecido scleral, desnaturação térmica utilizando Calorimetria Diferencial de varredura (DSC) e a segunda harmônica geração microscopia (SHGM).
Utilizando Calorimetria exploratória diferencial (DSC), também conhecido como análise térmica, uma transição de desnaturação térmica é medida, que para tecido scleral é predominantemente guiado pelas propriedades dos colagénios fibrillar, desde que eles constituem a maioria em massa da proteína. Este método avalia a estabilidade da estrutura molecular do colágeno e os laços reticulados que estabilizar as fibrilhas de colagénio, a estrutura principal proteína terciária. Durante o aquecimento no DSC, uma temperatura crítica de transição é alcançada que resulta na desnaturação da molécula de colágeno, resultando no desenrolar da tripla hélice, um processo que forma o que é comumente conhecido como gelatina. Esta desnaturação térmica rompe ligações de hidrogênio ao longo da molécula de colágeno e pode ser deslocada para temperaturas mais altas através de métodos do cross-linking induzido12,13. Este método tem sido usado por muitas décadas, particularmente na indústria de biomateriais e para processos que incluem a fabricação de couro. No entanto, este método requer a extração do tecido esclera e, portanto, só pode ser útil como uma técnica ex vivo .
Microscopia de harmônica de segunda geração (SHGM) baseia-se as propriedades ópticas não-lineares de materiais específicos, com ambientes molecular não-centrossimétricas. Em tais materiais, luz intensa, por exemplo luz produzida por lasers, gera sinais SHG, no qual a luz incidente é duplicada em frequência. Materiais biológicos que são conhecidos para criar sinais SHG são microtúbulos, colágeno e miosina do músculo. Por exemplo, colágeno animado com uma luz infravermelha do comprimento de onda de 860 nm irá emitir um sinal SHG na faixa visível com comprimento de onda de 430 nm. Segunda geração de harmônica (SHG) imagem de sinal é um método promissor para avaliar terapêutico colágeno cross-linking. Tem sido conhecido há mais de 30 anos que fibrilhas de colagénio nos tecidos emitem SHG sinais14. No entanto, só recentemente podem imagens de alta resolução ser obtidas15 em uma variedade de tecidos, incluindo o tendão16, pele, cartilagem17, vasos sanguíneos,18e em gel de colágeno19.
Baseado neste conhecimento, este estudo avalia as alterações de sinal SHG induzidas na esclera através de SMG quimicamente induzida do cross-linking de colágeno. Os resultados indicam que a modificação de SMG da esclera aumenta os sinais SHG produzidos a partir de feixes de fibras de colágeno tecido (a maior ordem quaternária estrutura composta de fibrilas de colágeno) e também produz uma mudança estrutural morfológica em colágeno rede de fibra, refletida na fibra bundle "endireitar".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1441">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:245px;">MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td>
			<td style="width:289px;">EMD Millipore, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:796px;">Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium hydroxymethylglycinate&#160;</td>
			<td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Injection needle with luer-lock syringe</td>
			<td>BD Eclipse, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit head</td>
			<td>La Granja poultry</td>
			<td>Outbred</td>
			<td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tono-pen&#160;</td>
			<td>Reichter Technologies Depew, NY</td>
			<td></td>
			<td>IOP measurements - protocol step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DSC 6000 Autosampler</td>
			<td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pyris software&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Ver 11.0</td>
			<td>&#160;protocol step 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">GenTeal&#160;</td>
			<td>Alcon, Fort Worth, TX&#160;</td>
			<td>B000URVDQ8</td>
			<td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Chameleon Vision II&#160;</td>
			<td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AttoFluor cell chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">25-mm round coverslips, #1.5</td>
			<td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td>
			<td>GG-25-1.5</td>
			<td>protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>protocol step 8.1.4.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">A1R-MP laser scanning system</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ver 4.3</td>
			<td>refered to as &#34;software&#34; in the text - protocol step 8.1.9</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fiji/ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#160;protocol step 9.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:289px;">Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microsoft Excel&#160;</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td>
			<td>Ver 14</td>
			<td>protocol step 9.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

Métodos para fortalecer o tecido com a introdução de ligações químicas (não enzimáticos do cross-linking) nas proteínas estruturais (colagénios fibrillar) para terapia incluem Cross-linking fotoquímicos e tecido do cross-linking métodos (TXL). Tais métodos para induzir alterações de propriedade mecânica do tecido estão sendo empregados para a córnea em afinamento corneano (mecanicamente enfraquecido) doenças como ceratocone, bem como a esclera em miopia progressiva, onde afinamento e enfraquecimento da posterior esclera ocorre e provavelmente contribui para o alongamento axial. As proteínas alvo primário para tal reforço de tecido são fibrillar colágenos, que constituem a grande maioria das proteínas de peso seco na córnea e esclera. Fortuitamente, fibrillar colágenos são a principal fonte de segunda geração harmônica sinais no espaço extracelular de tecido. Portanto, modificações das proteínas de colágeno, tais como aqueles induzida através do cross-linking terapias, potencialmente poderiam ser detectadas e quantificadas através da utilização de microscopia de segunda geração harmônica (SHGM). Acompanhamento SHGM sinaliza através do uso de um laser acoplado com uma luz infravermelha da excitação do sistema de microscopia de varredura fonte é um método de imagem moderno emocionante que está desfrutando de uma utilização generalizada em ciências biomédicas. Assim, o presente estudo foi realizado para avaliar o uso da microscopia SHGM, como um meio para medir induzida do cross-linking efeitos em ex vivo esclera de coelho, após uma injeção de uma substância química do cross-linking agente no espaço do subespiga (sT), uma injeção ou seja abordagem prática padrão para causando anestesia ocular durante os procedimentos de clínicos oftalmológicos. O produto químico agente do cross-linking, hidroximetilglicinato de sódio (SMG), é de uma classe de cosméticos conservantes conhecidos como formaldeído, liberando agentes (FARs). Scleral alterações após reação com SMG resultaram em aumentos no SHG sinais e correlacionadas com mudanças na temperatura de desnaturação térmica, um método padrão para avaliar induzido tecido efeitos do cross-linking.

Temperatura de desnaturação térmica (Tm) como um método de ensaio para avaliar TXL cross-linking efeito: Um total de 16 pares de olhos de coelho foram utilizados nesses experimentos para o procedimento TXL. Como uma parte inicial deste estudo, avaliou-se a localização do efeito do cross-linking induzido por uma única injeção de agente do cross-linking de SMG através do espaço de sT na cabeça coelho cadavérico. Este tipo de experimento tem relevância para o t...

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Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

Este protocolo descreve técnicas para a avaliação química do cross-linking de esclera coelho usando a imagem latente de geração segundo harmônico e diferencial de calorimetria de varredura.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

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