Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Авторы благодарят Tongalp Tezel, MD, для проведения консультаций относительно sT инъекций; Тереза Swayne, PhD, для проведения консультаций относительно SHG микроскопии; и Джимми Duong от дизайна и биостатистики ресурсов и Фондом Biostatistical ядро Ирвинг института в медицинский центр Колумбийского университета.
Поддержаны в части исследования, чтобы предотвратить слепоту и национальных институтов здравоохранения грантов NCRR UL1RR024156, EY019007 Р30 NEI, NCI Р30 CA013696 и NEI R01EY020495 (DCP). Колумбийский университет владеет связанные интеллектуальной собственности: патента США выданы без: 8,466,203 и не: 9,125,856. Международный патент: PCT/US2015/020276.
Изображения были собраны в Confocal и специализированных микроскопии общий ресурс Герберта Ирвинга всеобъемлющем онкологический центр в Колумбийском университете, поддерживаемых NIH Грант #P30 CA013696 (Национальный институт рака). Конфокальный микроскоп был приобретен с низ Грант #S10 RR025686.

Все процедуры были проведены с использованием трупной кролика глаза в рамках главы нетронутыми беспородных кролика. Были соблюдены все институциональные и национальные руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных.
1. Подготовка решений
<ol><li>SMG ...

Проведенные эксперименты показали, подтверждающей использование микроскопии сигнала ГСП в качестве метода для оценки коллагена cross-linking эффекты в склеры, повышение будущие возможности использования этого метода как инструмент контроля для сшивки лечения Это целевых белков коллагена...

Прогрессирующая близорукость постулируется считаются излечимыми посредством неферментативного склеры сшивки (фотохимического и/или химических веществ), который имеет смысл, учитывая, что блокирование коллаген ферментативные cross-linking может увеличить экспериментальные формы лишения (FD)-индуцированной близорукость1. Инфекционную и Филлипс2 недавно обсуждали возможности и потенциал использования стандартной УФ А излучения (UVA)-рибофлавин опосредованной фотохимического сшивки (также известный как Дрезден протокол), сокращенно здесь как (рибофлавин CXL) для задней склеры стабилизации прекратить осевое растяжение в близорукости. Этот фотохимического метод успешно используется для лечения дестабилизации поверхности передней глобус (то есть, выпуклые роговицы), видели в keratectasia кератоконуса и пост LASIK. Однако применение этой CXL протокола для склеры препятствуют проблемы, связанные с трудностями в получении доступа к задней склеры с источником ультрафиолетового (УФ) света, а также необходимость изменения гораздо больше ткани площадью поверхности. Что сказал, CXL подход был использован чтобы остановить осевое растяжение в визуально форме лишено кроликов (Тарзорафия), хотя несколько областей задняя склеры требуется несколько отдельных облучения зон в этом исследовании3. Напротив инъекции химического стабилизирующим агента (то есть, сшивки агент) через sT пространства может представлять простой способ изменить задняя склеры, избегая необходимости введения источник ультрафиолетового света. Эта техника инъекции хорошо известен как полезный способ заставить глазной анестезии при офтальмологических процедуры, такие как Катаракта хирургии4,5,6. Wollensak7 описал ранее использование sT инъекции с помощью Глицеральдегид (химической сшивки агент схожая по концепции с формальдегидом, выпуская агентов (фарс), описанные в данном исследовании) застывать кролик склеры и genipin имеет был показан для ограничения осевой длина в FD морских свинок8,9. Эти исследователи продемонстрировали явное преимущество использования растворимых химического агента над фотохимического CXL технику. Таким образом, склеры сшивки с помощью инъекции химического агента некоторого типа, в том числе фарс (т.е., TXL)10, может предоставить метод лечения возможно остановить прогрессирование склеры удлинения, видели в близорукости.
В протоколах, представленные здесь мы используем химической сшивки раствор натрия hydroxymethylglycinate (SMG), через sT инъекции склеры глаз трупной кролика. Мы внедрили аналогичные протоколы ранее для актуальных химической сшивки в роговице. Особенно в этих исследованиях сообщалось ранее концентрация зависимых cross-linking эффекты могут быть получены с помощью SMG, с диапазоном эффект, охватывающих значительно выше, достижимые с фотохимическими CXL определяется тепловой денатурации анализа11 .
Здесь мы описываем протоколы для оценки сшивки эффект SMG, доставлено через sT инъекции склеры ткани, тепловой денатурации с помощью сканирования дифференциальной калориметрии (ДСК) и второй гармоники поколения микроскопии (SHGM).
С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), также известный как термический анализ, тепловой денатурации переход измеряется, который для склеры ткани является преимущественно, руководствуясь свойства фибриллярного коллагены, поскольку они составляют большинство массовых белка. Этот метод оценивает стабильность молекулярной структуре коллагена и сшитого облигации, которые стабилизировать фибрилл коллагена, структуры основных высших белков. Во время нагревания в DSC, критического переходного периода температура достигнута, приводит к денатурации коллагена молекулы, что приводит к разматывающее тройной спирали, процесс, который формирует то, что широко известен как желатин. Этот тепловой денатурации разрушает водородные вдоль молекулы коллагена и может быть перенесен в более высоких температурах посредством индуцированного сшивки методы12,13. Этот метод был использован для многих десятилетий, особенно в индустрии биоматериалов и для процессов, которые включают кожа решений. Однако этот метод требует извлечения склера ткани и поэтому может быть только полезным ex vivo технику.
Микроскопия генерации второй гармоники (SHGM) на основе нелинейных оптических свойств конкретных материалов, с не Центросимметричная молекулярных сред. Например в таких материалах, интенсивный свет, свет производства лазеров, генерирует сигналы ГСП, в которых падающего света в два раза частотой. Биологические материалы, которые известны для создания SHG сигналы являются коллаген, микротрубочки и миозина мышц. Например коллаген, возбужденных с инфракрасным излучением 860 нм длины волны будет излучать сигнал ГСП в видимом диапазоне с 430 Нм длины волны. Второй гармоники поколения (SHG) сигнал изображений является перспективным методом для оценки терапевтических коллагена сшивание. Более 30 лет было известно, что фибрилл коллагена в тканях излучают SHG сигналы14. Однако только недавно изображения с высоким разрешением можно15 в различных тканях, включая сухожилия16, кожи, хряща17,18кровеносных сосудов и коллагеновые гели19.
Основываясь на этом знании, данное исследование оценивает изменения сигнала ГСП, индуцированной в склеру через SMG химически индуцированных сшивания коллагена. Результаты показывают, что SMG модификация склеры увеличивает сигналы ГСП, производится из ткани коллагена расслоений (выше порядок Четвертичная структура состоит из фибрилл коллагена), а также производит структурных морфологических изменений в коллагена оптической сети, отражено в волоконно расслоение «выпрямление».

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1441">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:245px;">MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td>
			<td style="width:289px;">EMD Millipore, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:796px;">Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium hydroxymethylglycinate&#160;</td>
			<td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Injection needle with luer-lock syringe</td>
			<td>BD Eclipse, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit head</td>
			<td>La Granja poultry</td>
			<td>Outbred</td>
			<td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tono-pen&#160;</td>
			<td>Reichter Technologies Depew, NY</td>
			<td></td>
			<td>IOP measurements - protocol step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DSC 6000 Autosampler</td>
			<td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pyris software&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Ver 11.0</td>
			<td>&#160;protocol step 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">GenTeal&#160;</td>
			<td>Alcon, Fort Worth, TX&#160;</td>
			<td>B000URVDQ8</td>
			<td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Chameleon Vision II&#160;</td>
			<td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AttoFluor cell chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">25-mm round coverslips, #1.5</td>
			<td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td>
			<td>GG-25-1.5</td>
			<td>protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>protocol step 8.1.4.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">A1R-MP laser scanning system</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ver 4.3</td>
			<td>refered to as &#34;software&#34; in the text - protocol step 8.1.9</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fiji/ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#160;protocol step 9.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:289px;">Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microsoft Excel&#160;</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td>
			<td>Ver 14</td>
			<td>protocol step 9.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

Методы укрепления тканей путем введения химических связей (неферментативного cross-linking) в структурных белков (фибриллярного коллагены) для терапии включают фотохимического cross-linking и ткани, сшивки (TXL) методы. Такие методы для стимулирования изменения свойств механических тканей используются для роговицы роговицы истончение (механически ослаблены) расстройств, как кератоконус склеры в прогрессирующей близорукости, где истончение и ослабление кзади Склера возникает и скорее всего способствует осевое растяжение. Основная цель белки для укрепления таких тканей являются фибриллярного коллагены, которые составляют подавляющее большинство белков сухого веса в роговицы и склеры. Случайно фибриллярного коллагены являются главным источником второй гармонических поколения сигналов в пространстве внеклеточной ткани. Таким образом изменения коллагеновых белков, таких как те, индуцированной через cross-linking терапии, потенциально может быть обнаружен и предел использования второй гармоники поколения микроскопии (SHGM). Мониторинг SHGM сигналов с помощью лазерного сканирования системы микроскопии в сочетании с инфракрасного света возбуждения, что источник интересных современных изображений метод, который наслаждается широкое использование в биомедицинских наук. Таким образом, настоящее исследование было проведено для того, чтобы оценить использование SHGM микроскопии, как средство для измерения индуцированной сшивки эффекты в ex vivo кролик склеры, после инъекции химического cross-linking агент в суб Tenon пространство (sT), инъекции подход это стандартная практика для нанесения глазной анестезии при офтальмологических клинических процедур. Химической сшивки агент, натрия hydroxymethylglycinate (SMG), — от класса косметические консерванты, известный как формальдегид, выпуская агентов («фарс»). Склеры изменения после реакции с SMG привела к увеличению SHG сигналов и коррелирует с изменениями в температуре тепловой денатурации, стандартный метод для оценки индуцированной ткани cross-linking эффекты.

Тепловой денатурации температуры (Tm) как метод анализа для оценки TXL cross-linking эффект: В общей сложности 16 пар кролика глаза были использованы в этих экспериментах TXL процедуры. В первой части этого исследования оценивалась локализации сшивки эффект вызванных о?...

Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Второй гармонических поколения сигналов в кролика склеры как инструмент для оценки терапевтических ткани сшивки (TXL) для близорукости

Этот протокол описывает методы оценки химической сшивки кролик склеры, используя второй гармоники поколения изображений и дифференциальной сканирующей калориметрии.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

Поколение комплексного грудной База данных Онкология - Инструмент для трансляционных исследований

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Остеопатическая Манипулятивные Лечение как полезными дополнительные инструмент для пневмонии

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Следующее поколение тканей микрочипов (ngTMA) Протокол биомаркера исследований

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundus фотография как удобный инструмент для изучения микрососудистых Ответы на сердечно-сосудистые заболевания Факторы риска в эпидемиологических исследованиях

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Терапевтическая эффективность диетической добавки по управлению Halitosis в Собаки

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Оценка эффективности<em&gt; Н. пилори</em&gt; Белок HP-NAP как лечебное средство для лечения рака мочевого пузыря в Ортотопическая мышиной модели

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

MRI-guided dmPFC-rTMS as a Treatment for Treatment-resistant Major Depressive Disorder

МРТ наведением dmPFC-МТР для лечения резистентных к терапии большого депрессивного расстройства

Here we outline the protocol for magnetic resonance imaging (MRI) guided repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the dorsal medial ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Склеры Сшивка Использование рибофлавина и ультрафиолетовый-A излучения для профилактики близорукости Осевая в кролика модели

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как<em&gt; In Vitro</em&gt; Инструмент скрининга в исследованиях слуха

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...