Name: second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia
Uploaded: 2018-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Författarna tackar Tongalp Tezel, MD, för samråd avseende sT injektion; Theresa Swayne, PhD, för samråd avseende SHG mikroskopi; och Jimmy Duong från Design och biostatistik resurs och biostatistisk core facility för Irving Institute på Columbia University Medical Center.
Stöds delvis av forskning för att förhindra blindhet och av nationella institut för hälsa bidrag NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 och NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University äger relaterade immateriella: U.S. utfärdade patent nr: 8,466,203 och inga: 9,125,856. Internationella patentsökt: PCT/US2015/020276.
Bilder samlades i Confocal och specialiserade mikroskopi delad resurs för Herbert Irving omfattande Cancer Center vid Columbia University, stöds av NIH bevilja #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Mikroskopet confocal köptes med NIH bevilja #S10 RR025686.

Alla förfaranden utfördes med avlidna kanin ögon inom intakt utkonkurrerat dö ut kanin huvuden. Alla institutionella och nationella riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur följdes.
1. beredning av lösningar
<ol><li>SMG förberedelse för TXL:<ol>
<li>Laga 1 mL 0,2 M koncentrationen av natriumbikarbonat lösning (NaHCO3) lösning med 0.0165 g NaHCO3 pulver löses i 1 mL destillerat vatten.</li>
		<li>Lös 0.1016 mg pulveriserad natrium n (SMG) i 1 mL destille...

Genomförda experiment har visat bevis som stöder användningen av SHG signal mikroskopi som en metod för utvärdering av kollagen tvärbindning effekter i sklera, höja den framtida möjligheten att använda denna teknik som övervakningsinstrument för cross-linking behandlingar som rikta kollagen proteiner. Notera är ett instrument redan i klinisk användning som potentiellt kan fånga denna SHG-signal. Även detta instrument var främst avsedd för imaging huden mänskliga dermis, har det använts framgångsrikt t...

Progressiv närsynthet är postulerade för att vara behandlingsbar genom icke-enzymatisk skleral cross-linking (fotokemiska eller kemisk), vilket är logiskt med tanke på att blockera kollagen enzymatisk cross-linking kan öka experimentell form deprivation (FD)-inducerad myopi1. ElSheikh och Phillips2 nyligen diskuterade möjligheterna och potentialen för att använda standard-ultraviolett-A bestrålning (UVA)-riboflavin medierad fotokemiska cross-linking (även känd som Dresden protokollet), förkortat här som (riboflavin CXL) för bakre skleral stabilisering att stoppa axiell töjning i myopi. Fotokemisk metoden har med framgång använts för behandling av destabilisering av den främre globe ytan (dvs, svällande hornhinnan) sett i keratokonus och post-LASIK keratectasia. Dock hindras tillämpningen av denna CXL protokoll för sklera av problem relaterade till svårigheter att få tillgång till bakre sklera med en ultraviolett (UV) ljuskälla, liksom behovet av att ändra en mycket större vävnad yta. Som sagt, metoden CXL har använts för att stoppa axiell töjning i visuellt form berövas kaniner (av tarsorrhaphy), även om flera regioner på bakre sklera krävs flera separata bestrålning zoner i denna studie3. Injektion av en kemisk stabiliserande agent (dvs, bryggbindningen agent) via sT utrymmet kan däremot utgöra ett enklare sätt att ändra bakre sklera, undvika behovet av att införa en UV-ljuskälla. Denna injektionsteknik är känd som ett användbart sätt att inducera okulär anestesi under oftalmologiska förfaranden såsom katarakt kirurgi4,5,6. Wollensak7 har beskrivit tidigare användning av sT injektion använder glyceraldehyd (en kemisk bryggbindningen agent liknande koncept till formaldehyd släppa agenter (FARs) beskrivs i denna studie) stelna den kanin sklera och genipin har visat att begränsa axiell längd i FD marsvin8,9. Dessa utredare har visat en klar fördel med att använda en löslig kemisk agent över den fotokemiska CXL-tekniken. Således, skleral cross-linking använder en injicerbara kemisk agent av någon typ, inklusive FARs (dvsTXL)10, skulle kunna bli en genomförbar metod att stoppa utvecklingen av skleral töjning sett i myopi.
I de protokoll som presenteras här, använder vi en kemisk tvärbindande lösning av natrium n (SMG), levereras via sT injektion till sklera av avlidna kanin ögon. Vi har implementerat liknande protokoll tidigare för aktuella kemiska cross-linking i hornhinnan. Särskilt i de tidigare rapporterade studierna, kunde koncentrationsberoende cross-linking effekter erhållas med SMG, med en effekt spänner över som kan uppnås med fotokemiska CXL som bestäms av termiska denaturering analys11 .
Här beskriver vi protokoll för att bedöma den korslänkande effekten av SMG levereras via sT injektioner skleral vävnad, termisk denaturering med Differential Scanning Calorimetry (DSC) och andra harmoniska Generation mikroskopi (SHGM).
Med hjälp av differential scanning calorimetry (DSC), även känd som termisk analys, mäts en termisk denaturering övergång, som för skleral vävnad är huvudsakligen styrs av egenskaperna för de fibrillar kollagen, eftersom de utgör bulk majoriteten av protein. Denna metoden utvärderar stabiliteten i kollagen molekylstruktur och tvärbunden obligationer som stabilisera de kollagen fibrillerna, den huvudsakliga tertiära proteinstrukturen. Under värme i DSC uppnås en kritisk övergång temperatur som resulterar i denaturering av kollagenmolekylen, vilket resulterar i uncoiling av den Trippel helix, en process som bildar vad är allmänt känd som gelatin. Denna termiska denaturering stör Väteförbindelser längs kollagenmolekylen och kan skiftas till högre temperaturer genom inducerad tvärbindande metoder12,13. Denna metod har använts för många årtionden, särskilt inom biomaterial och processer som innehåller läder-making. Men denna metod kräver utvinning av sklera vävnad och kan därför bara vara användbar som ett ex vivo -teknik.
Andra-harmoniska generation mikroskopi (SHGM) bygger på de icke-linjära optiska egenskaperna av visst material, med icke-centrosymmetric molekylära miljöer. I sådant material, intensivt ljus, till exempel ljus produceras av lasrar, genererar SHG signaler, där det infallande ljuset fördubblas i frekvens. Biologiska material som är kända för att skapa SHG signaler är kollagen, mikrotubuli och muskel myosin. Till exempel avger kollagen glada med ett infrarött ljus av 860 nm våglängd en SHG signal i det synliga området med 430 nm våglängd. Andra harmoniska generation (SHG) signal bildbehandling är en lovande metod för att utvärdera terapeutiska collagen cross-linking. Det har varit känt i mer än 30 år att kollagen fibriller i vävnader avger SHG signaler14. Dock kunde endast nyligen högupplösta bilder fås15 i en mängd olika vävnader, inklusive senan16, hud, brosk17, blodkärl18, och i kollagen geler19.
Baserat på denna kunskap, utvärderar denna studie de SHG signalförändringar inducerade i sklera genom SMG kemiskt inducerad cross-linking av kollagen. Resultaten indikerar att SMG modifiering av sklera ökar de SHG signaler som produceras från vävnad kollagen fiberpackar (högre ordning Kvartära strukturen består av kollagen fibriller) och producerar även en morphologic strukturomvandling i kollagen fibernät, återspeglas i fiber bundle ”uträtning”.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1441">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:245px;">MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V</td>
			<td style="width:289px;">EMD Millipore, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:796px;">Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sodium hydroxymethylglycinate&#160;</td>
			<td>Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Injection needle with luer-lock syringe</td>
			<td>BD Eclipse, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit head</td>
			<td>La Granja poultry</td>
			<td>Outbred</td>
			<td>Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tono-pen&#160;</td>
			<td>Reichter Technologies Depew, NY</td>
			<td></td>
			<td>IOP measurements - protocol step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DSC 6000 Autosampler</td>
			<td>Perkin-Elmer Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pyris software&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Ver 11.0</td>
			<td>&#160;protocol step 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">GenTeal&#160;</td>
			<td>Alcon, Fort Worth, TX&#160;</td>
			<td>B000URVDQ8</td>
			<td>Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Chameleon Vision II&#160;</td>
			<td>Coherent, Santa Clara,CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AttoFluor cell chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">25-mm round coverslips, #1.5</td>
			<td>Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA</td>
			<td>GG-25-1.5</td>
			<td>protocol step 8.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>protocol step 8.1.4.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Non-descanned (NDD) GaAsP detector</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">A1R-MP laser scanning system</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ver 4.3</td>
			<td>refered to as &#34;software&#34; in the text - protocol step 8.1.9</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fiji/ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#160;protocol step 9.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:289px;">Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microsoft Excel&#160;</td>
			<td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td>
			<td>Ver 14</td>
			<td>protocol step 9.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

second harmonic generation signals in rabbit sclera as a tool for evaluation of therapeutic tissue cross-linking (txl) for myopia

Metoder för att stärka vävnaden genom att införa kemiska bindningar (icke-enzymatiska cross-linking) strukturella proteiner (fibrillar kollagen) för terapi inkluderar fotokemiska cross-linking och vävnad cross-linking (TXL) metoder. Sådana metoder för att inducera mekaniska vävnad egenskapsändringar är att vara anställd på hornhinnan i korneal förtunning (mekaniskt försvagat) störningar såsom keratokonus samt sklera i progressiv närsynthet, där gallring och försvagningen av bakre sklera uppstår och sannolikt bidrar till axiell töjning. De primära målproteiner för sådan vävnad förstärkning är fibrillar kollagen som utgör den stora majoriteten av torr vikt proteiner i hornhinnan och sklera. Slump, är fibrillar kollagen den huvudsakliga källan av andra harmoniska generation signaler i den vävnad extracellulära. Därför kunde potentiellt ändringar av kollagen proteiner, såsom de inducerade genom cross-linking terapier, upptäckas och quantitated med hjälp av andra harmoniska generation mikroskopi (SHGM). Övervakning SHGM signaler med hjälp av en laser scanning mikroskopi system tillsammans med en infraröd magnetisering ljus källa är en spännande modern bildgivande metod som njuter av utbredd användning inom biomedicinsk vetenskap. Således föreliggande studie genomfördes för att utvärdera användningen av SHGM mikroskopi som ett sätt att mäta inducerade tvärbindande effekter i ex vivo kanin sklera, efter en injektion av en kemikalie bryggbindningen agent i den sub-Tenons rymden (sT), en injektion tillvägagångssätt det är standardförfarande för att orsaka okulära anestesi under oftalmologiska kliniska rutiner. Den kemiska bryggbindningen agent, är natrium n (SMG), en klass av kosmetiska konserveringsmedel känd som formaldehyd släppa agenter (FARs). Skleral förändringar efter reaktion med SMG resulterade i ökningar SHG signaler och korrelerade med förändringar i termisk denaturering temperatur, en standardmetod för att utvärdera inducerad vävnad cross-linking effekter.

Termiska denaturering temperatur (Tm) som en analys metod att utvärdera TXL cross-linking effekt: Sammanlagt 16 par kanin ögon användes i dessa experiment för TXL förfarandet. Som en första del av denna studie utvärderades localizationen av korslänkande effekt induceras av en enda injektion av SMG bryggbindningen agent via sT utrymme i avlidna kanin huvudet. Denna typ av experiment har relevans för klinisk behandling av patienter, eftersom injektioner i mer än e...

Watch this Scientific Journal Video about Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia at JoVE.com

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

Andra harmoniska Generation signaler i kanin sklera som ett verktyg för utvärdering av terapeutiska vävnad Cross-linking (TXL) för närsynthet

Det här protokollet beskriver tekniker för utvärdering av kemiska cross-linking av kanin sklera använder andra harmoniska generation bildhantering och differential scanning calorimetry.

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

Generering av omfattande Thoracic onkologi Databas - Verktyg för translationell forskning

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Osteopathic Otillbörlig behandling som ett användbart Tilläggsverktyg för lunginflammation

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Nästa generations tissue microarray (ngTMA) Protokoll för Biomarker Studies

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Ögonbottenfotografering som ett praktiskt verktyg för att studera Mikrovaskulära Svaren till Cardiovascular Disease Risk Factors i epidemiologiska studier

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Terapeutisk effektivitet kosttillskott för hantering av dålig andedräkt hos hundar

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Utvärdering av effektiviteten hos de<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP som ett terapeutiskt verktyg för behandling av cancer i urinblåsan i en Orthotopic musmodell

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

MRI-guided dmPFC-rTMS as a Treatment for Treatment-resistant Major Depressive Disorder

MR-guidad dmPFC-rTMS som en behandling för behandlingsresistent egentlig depression

Here we outline the protocol for magnetic resonance imaging (MRI) guided repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the dorsal medial ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Skleral Tvärbindning Använda Riboflavin och ultraviolett-strålning för förebyggande av Axial närsynthet i en kaninmodell

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Characterization efter en ny Disaggregation metod för Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...