Name: workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources at JoVE.com

Nous remercions Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin et Jean-Marie Sabalyrolles pour leur contribution à la conception du système robotique assistée par fermentation et Martine Pradal, Nicolas Bouvier et Pascale Brial pour leur soutien technique. Le financement de ce projet a été fourni par le Ministère de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

1. la fermentation et l’échantillonnage
<ol><li>
Préparation des supports et des fermenteurs Remarque : Toutes les fermentations sont effectuées en parallèle, à l’aide de la même souche et dans le même chimiquement définies milieu synthétique (SM, composition fournie dans le tableau 1), qui comprend un mélange d’ammonium et d’acides aminés comme sources d’azote15. Pour chaque fermentation, un composé unique d’azote est fourni exclusiv...

<ol>
	<li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast:+developments+and+impacts.">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li><li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression.">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li><li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis.">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li><li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints.">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li><li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments.">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).</li><li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems.">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li><li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis.">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li><li>Quek, L. -. E., Dietmair, S., Kr&#246;mer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture.">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li><li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+amino+acids+during+beer+production:+The+concept+of+a+critical+time+value.">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li><li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li><li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid,+nucleotide,+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li><li>Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).</li><li>Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid+and+nucleotide+biosynthesis+in+yeast.">Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).</li><li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production:+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism.">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li><li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+detection+of+assimilable+nitrogen+deficiencies+during+alcoholic+fermentation+in+oenological+conditions.">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li><li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network.">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li><li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoCor:+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments.">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li></ol>

Quantification de la séparation de composés par l’intermédiaire de réseaux métaboliques à l’aide d’expériences de traceur isotopique est une approche prometteuse pour comprendre le fonctionnement du métabolisme microbien. Cette méthode, alors qu’il est appliqué avec succès avec un ou deux substrats marqués, ne peut être appliquée actuellement pour étudier le métabolisme de diverses sources à l’aide de plusieurs isotopes élémentaires étiquetées (c.-à-d., plus de deux substrats). En...

Comprendre comment opère de métabolisme microbien est une question clé pour la conception de stratégies efficaces pour améliorer les procédés de fermentation et de moduler la production de composés par fermentation. Progrès de la génomique et de la génomique fonctionnelle dans ces deux dernières décennies a largement contribué à étendre la connaissance de la topologie des réseaux métaboliques de nombreux micro-organismes. Accès à ces informations a conduit à l’élaboration d’approches qui visent pour un aperçu complet de la fonction cellulaire1. Ces méthodes reposent souvent sur une interprétation basée sur des modèles de paramètres mesurables. Ces données expérimentales comprennent, d’une part, le taux d’absorption et de la production métabolite et, d’autre part, des renseignements quantitatifs intracellulaires qui sont obtenus à partir de traceur isotopique expériences. Ces données fournissent des renseignements essentiels pour la déduction de l’activité in vivo des voies différentes dans un réseau métabolique défini2,3,4. Actuellement, les techniques analytiques disponibles uniquement permettent la détection précise de l’étiquetage des modèles de molécules lors de l’utilisation d’un isotope de l’élément unique et, éventuellement, lors de l’étiquetage conjointement avec deux éléments isotopiques. En outre, dans la plupart des conditions de croissance, la source de carbone se compose uniquement d’un ou de deux composés. Par conséquent, les approches fondées sur les traceurs isotopiques-C 13de substrats carbonés ont été largement et avec succès appliquées pour développer une compréhension complète du carbone réseau métabolique opérations5,6,7 ,,8.
En revanche, dans de nombreux environnements naturels et industriels, la ressource d’azote disponible qui prend en charge la croissance microbienne est souvent composée d’une large gamme de molécules. Par exemple, au cours de la fermentation de la bière ou vin, azote est fournie comme un mélange de 18 acides aminés et d’ammonium à concentrations variables9. Cet éventail de composés azotés qui sont accessibles pour l’anabolisme rend ces conditions de milieux complexes considérablement différentes de celles utilisées pour les études physiologiques, comme ces derniers sont réalisés à l’aide d’une unique source d’azote, généralement d’ammonium.
Dans l’ensemble, intériorisé azote composés peuvent être directement incorporés dans les protéines ou catabolisés. La structure du réseau du métabolisme de l’azote dans beaucoup de micro-organismes, y compris la levure Saccharomyces cerevisiae, est très complexe selon la diversité des substrats. Schématiquement, ce système repose sur la combinaison du noyau central du métabolisme de l’azote qui catalyse l’interconversion de glutamine, glutamate et10,α-cétoglutarate11, avec les transaminases et DÉSAMINASES. Grâce à ce réseau, groupes amines d’ammonium ou d’autres acides aminés sont regroupés et acides α-cétoniques libérés. Ces intermédiaires sont également synthétisée par le carbone central du métabolisme (CCM)12,13. Ce grand nombre de réactions ramifiées et intermédiaires, intervenant dans le catabolisme des sources d’azote exogène et l’anabolisme de l’acide aminé, remplit les exigences anaboliques des cellules. L’activité à travers ces différentes routes interconnectées se traduit également par l’excrétion des métabolites. En particulier, les acides α-cétoniques sont redirigés par la voie d’Ehrlich pour produire des alcools supérieurs et leur acétate ester dérivés14, qui contribuent de façon essentielle aux profils sensoriels des produits. Par la suite, le fonctionne du métabolisme de l’azote joue un rôle clé dans la production de biomasse et de la formation de molécules volatiles (arôme).
Les réactions, les enzymes et les gènes impliqués dans le métabolisme de l’azote sont largement décrits dans la littérature. Toutefois, la question de la répartition des multiples sources d’azote dans l’ensemble un réseau métabolique n’a pas encore été abordée. Il y a deux raisons principales qui expliquent ce manque d’information. Tout d’abord, compte tenu de la complexité importante du réseau du métabolisme d’azote, une grande quantité de données quantitatives est nécessaire pour une compréhension complète de son fonctionnement qui n’était pas disponible jusqu’ici. Deuxième, nombreuses contraintes expérimentales et les limitations des méthodes d’analyse ont empêché la mise en œuvre des approches qui ont déjà été utilisées pour l’élucidation de la fonction CCM.
Pour résoudre ces problèmes, nous avons choisi de développer une approche au niveau du système qui repose sur le rapprochement des données d’une série d’expériences de traceur isotopique. Le workflow comporte : -Un ensemble de fermentations effectué dans les mêmes conditions environnementales, alors qu’une autre source de nutriments sélectionnée (substrat) est étiquetée chaque fois. -Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) pour une détermination précise, à différentes étapes de la fermentation, de la concentration résiduelle de substrat marqué et la concentration et l’enrichissement isotopique de composés dérivés de le catabolisme de la molécule marquée, y compris les dérivés de la biomasse. -Un calcul du solde pour chaque masse et isotopique consommé molécule marquée et une analyse intégrée de l’objet dataset afin d’obtenir une vision globale de la gestion de multiples sources d’éléments nutritifs par les microorganismes grâce à la détermination des ratios de flux .
Pour appliquer cette méthode, il faut au comportement reproductible du micro-organisme/souche entre les cultures. En outre, les échantillons provenant de cultures différentes doivent être prises pendant le déroulement de la fermentation bien définis même. Dans les travaux expérimentaux rapporté dans ce manuscrit, un système assistée par robot est utilisé pour le suivi en ligne des fermentations pour tenir compte de ces contraintes.
En outre, il est essentiel de choisir une série de substrats marqués (composé, nature et position de l’étiquette) qui est appropriée régler le problème scientifique de l’étude. Ici, arginine, glutamine et 15N-étiqueté d’ammonium ont été sélectionnés comme les trois sources principales d’azote trouvés dans du jus de raisin. Cela a permis d’évaluer le modèle de redistribution d’azote de composés consommés à l’acide aminé. L’étude visait aussi à enquêter sur le sort de l’épine dorsale de carbone des acides aminés consommés et leur contribution à la production de molécules volatiles. Pour atteindre cet objectif, uniformément 13C marqué leucine, isoleucine, thréonine et valine ont été inclus dans l’étude comme les acides aminés dérivés de grands intermédiaires de la voie de Ehrlich.
Dans l’ensemble, nous avons étudié quantitativement comment levure gère une ressource complexe d’azote en redistribuant les sources d’azote exogène pour satisfaire ses exigences anabolisants pendant toute la fermentation tout en éliminant en outre l’excès de précurseurs de carbone comme molécules volatiles. La procédure expérimentale présentée dans cet article peut être appliquée afin d’étudier les autres sources d’éléments nutritifs multiples utilisés par tout autre micro-organisme. Il semble être une approche appropriée pour l’analyse de l’impact du bagage génétique ou des conditions environnementales sur le comportement métabolique des micro-organismes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>141341.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Fructose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>142728.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Malic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt (II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine, hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergost&#233;rol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101074F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C5-L-Valine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2249-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-L-Leucine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2262-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-Ammonium chloride</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALPHA-15N-L-Glutamine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-1016-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-15N4-L-Arginine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-396-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl propanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylpropanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>246085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl butanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>306886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8.08541.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl hexanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>148962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl octanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl decanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W243205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl dodecanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl succinate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W237701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W217514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W364401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methyl butyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>287725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>290580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>294829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>133051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>128570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>77861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>94425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>193070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W310212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>153745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W279900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W236403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentor 1L</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1357</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable vacuum filtration system</td>
			<td>Dominique Deutscher</td>
			<td>029311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenters (250 ml)</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1352</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentation locks</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1356</td>
			<td>Fermetation locks handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoYeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoPeptone</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605697</td>
			<td>Multisizer 3 Coulter Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Jouan</td>
			<td></td>
			<td>GR412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Robotic system</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td>PF0X-MA</td>
			<td>Automatic instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Software</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td></td>
			<td>Robot monitor software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RobView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house developed calculation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My SQL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>International source database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50088009</td>
			<td>String Drive 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchBlotter platform rocker</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>60903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia enzymatic kit</td>
			<td>R-Biopharm AG</td>
			<td>5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer UviLine 9400</td>
			<td>Secomam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - acidics and neutrals</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - basics</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalycilic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochrom 30 AAA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZChrom Elite</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultropac 8 resin Lithium</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6002-47</td>
			<td>Lithium High Resolution Physiological Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Millex GV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGVX13NL</td>
			<td>Millex GV 13mm (pore size 0.22 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter PALL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-4157</td>
			<td>Supor-450 47mm 0.45&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump Millivac Mini</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XF5423050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium smooth weigh dish 70mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>611-1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Mettler</td>
			<td></td>
			<td>Specifications AE163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid dried</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1029310161</td>
			<td>(max. 0.025% H2O) SeccoSolv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combustion oven</td>
			<td>Legallais</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>UP40840A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td>Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate buffer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2038-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial solution of hydrolyzed amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AAS18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass culture tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z653586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>131780500</td>
			<td>99% Extrapure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl chloroformate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinserts for 1.5ml vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SU860066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5890 GC/5973 MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemstation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Chromasolv, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>ChromasolvPlus, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>394963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>33024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-17MS column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>122-4731</td>
			<td>30m*0.25mm*0.15&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate, anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical nitrogen</td>
			<td>Air products</td>
			<td>14629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebron ZB-WAX column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m*0.25mm*0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium BIP</td>
			<td>Air products</td>
			<td>26699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources

Études dans le domaine de la microbiologie s’appuient sur la mise en œuvre d’un large éventail de méthodes. En particulier, le développement de méthodes appropriées contribue substantiellement à fournir une connaissance approfondie du métabolisme des microorganismes qui poussent dans des milieux chimiquement définis contenant l’azote unique et sources de carbone. En revanche, la gestion par le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs, malgré leur large présence dans des environnements naturels ou industriels, demeure pratiquement inexplorée. Cette situation est principalement due au manque de méthodologies appropriées, qui entrave les enquêtes.
Nous rapportons une stratégie expérimentale quantitativement et complètement explorer comment le métabolisme fonctionne lorsqu’un nutriment est fourni comme un mélange de molécules différentes, par exemple, une ressource complexe. Nous décrivons ici son application pour l’évaluation de la répartition des multiples sources d’azote à travers le réseau métabolique de la levure. Le flux de travail combine l’information obtenue au cours d’expériences de traceur isotopique à l’aide de sélectionné 13C - ou des substrats marqués au N 15. Tout d’abord, il se compose des fermentations parallèles et reproductibles dans le même milieu, qui comprend un mélange de molécules contenant du N ; Toutefois, une source d’azote sélectionné est étiquetée chaque fois. Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) est mis en place pour évaluer les modèles étiquetage des composés ciblés et de quantifier la consommation et la récupération des substrats dans les autres métabolites. Une analyse intégrée de l’ensemble de données complet donne un aperçu du sort des substrats consommés dans les cellules. Cette approche nécessite un protocole précis pour la collecte d’échantillons – facilité par un système assistée par robot de surveillance en ligne des fermentations – et la réalisation de nombreuses analyses fastidieuses. Malgré ces contraintes, elle a permis de comprendre, pour la première fois, la séparation des multiples sources d’azote dans tout le réseau métabolique de la levure. Nous avons élucidé la redistribution d’azote provenant de sources plus abondantes vers autres composés N et déterminé l’origine métabolique des molécules volatiles et acide aminé.

La figure 3 présente un schéma du flux de travail qui a été mis en place pour enquêter sur la gestion par la levure de multiples sources d’azote qui se trouvent au cours de la fermentation du vin. Pour les différents points d’échantillonnage, les caractéristiques des paramètres biologiques – la croissance, les habitudes de consommation d’azote et le profil d’acides aminés acide – spectacle une reproductibilité élevée parmi les ferm...

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Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour quantitativement et complètement étudier le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs. Ce flux de travail, basé sur une combinaison d’expériences de traceur isotopique et une méthode d’analyse, permet le sort des nutriments consommés et l’origine métabolique des molécules synthétisée par des microorganismes à déterminer.

Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Recherche

Bio-ingénierie

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Mise en place d&#39;un modèle chirurgicalement induite chez la souris pour étudier le rôle de protection de progranuline dans l&#39;arthrose

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Combinaison de Microstéréolithographie et Électrofilage à produire des membranes Equipé Niches pour la régénération de la cornée

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

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Un expérimental et Finite Element Protocole pour Enquêter sur la transport des solutés neutres et chargés dans Cartilage Articulaire

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Un protocole expérimental pour évaluer la Performance des nouvelles sondes ultrasons basés sur la technologie CMUT en Application à l’imagerie cérébrale

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Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

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We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

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