Name: workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources at JoVE.com

אנו מודים ז'אן רוש מורה, סילבי Dequin ו ז'אן-מארי Sabalyrolles לתרום התפיסה של מערכת רובוטית בסיוע תסיסה, מרטין Pradal, ניקולא בובייה, פסקל Brial לתמיכה טכנית שלהם. מימון עבור פרוייקט זה סופק על ידי Ministère de l'Education נאסיונאל, דה לה רשרש et de la Technologie.

1. תסיסה ודגימה
<ol><li>
הכנת fermenters ומדיה הערה: כל fermentations מתבצעות בחוץ במקביל, תוך שימוש המתח אותו, באותו כימית מוגדר בינוני סינתטי (SM, קומפוזיציה הניתנים טבלה 1), אשר כוללת תערובת של אמוניה וחומצות אמינו כמו חנקן ממקורות15. עבור כל התסיסה, תרכובת חנקן אחד מסופק ב...

<ol>
	<li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast:+developments+and+impacts.">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li><li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression.">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li><li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis.">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li><li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints.">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li><li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments.">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).</li><li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems.">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li><li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis.">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li><li>Quek, L. -. E., Dietmair, S., Kr&#246;mer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture.">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li><li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+amino+acids+during+beer+production:+The+concept+of+a+critical+time+value.">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li><li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li><li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid,+nucleotide,+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li><li>Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).</li><li>Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid+and+nucleotide+biosynthesis+in+yeast.">Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).</li><li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production:+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism.">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li><li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+detection+of+assimilable+nitrogen+deficiencies+during+alcoholic+fermentation+in+oenological+conditions.">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li><li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network.">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li><li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoCor:+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments.">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li></ol>

לכימות חלוקת תרכובות דרך רשתות מטבוליות באמצעות מעקב איזוטרופי הניסויים היא גישה מבטיחה להבנת פעולת חילוף החומרים מיקרוביאלי. מתודולוגיה זו, בעוד הוחלו בהצלחה עם מצעים עם תוויות אחד או שניים, כעת אפשרות ליישם ללמוד מטבוליזם של מקורות שונים באמצעות מספר איזוטופים אלמנטלים שכותרתו (קרי<...

ההבנה כיצד פועלת מטבוליזם מיקרוביאלי היא סוגיה מרכזית על עיצוב האתר של אסטרטגיות יעילות כדי לשפר תהליכי תסיסה, לווסת את הייצור של תרכובות fermentative. ההתקדמות גנומיקה, גנומיקה תפקודית בשני עשורים האחרונים אלו תרמו במידה רבה הרחבת הידע של הטופולוגיה של רשתות מטבוליות של מיקרואורגניזמים רבים. הגישה למידע זה הוביל לפיתוח גישות המטרה עבור סקירה מקיפה של תפקוד התאים1. מתודולוגיות אלה לעיתים קרובות לסמוך על פרשנות המבוססת על מודל של פרמטרים מדידים. נתונים ניסיוני אלה כוללים, מצד אחד, ספיגת מטבוליט וקצבי ייצור ו, מצד שני, ניסויים כמותיים תאיים המתקבל איזוטופ מעקב. נתונים אלה מספקים מידע חיוני עבור ניכוי של הפעילות ויוו של מסלולים שונים הרשת המוגדרות מטבוליים2,3,4. כיום, טכניקות אנליטיות זמין רק לאפשר את איתור מדויק של תיוג דפוסים של מולקולות בעת שימוש איזוטופ רכיב אחד ואולי גם כאשר תיוג במשותף עם שני אלמנטים איזוטרופי. יתר על כן, תחת רוב תנאי הגידול, מקור פחמן מורכבת רק אחד או שניים-תרכובות. כתוצאה מכך, גישות המבוסס על 13C-איזוטרופי קליעים נותבים של פחמן סובסטרטים נרחב ובהצלחה הוחלו לפתח הבנה מלאה של פחמן רשת מטבולית פעולות5,6,7 ,8.
לעומת זאת, רבים בסביבות טבעיים ותעשייתיים, המשאב חנקן זמין התומך צמיחת חיידקים מורכב לעיתים קרובות של מגוון רחב של מולקולות. לדוגמה, במהלך התסיסה יין או בירה, חנקן מסופק הוא תערובת של 18 חומצות אמינו, אמוניום ריכוזים משתנים9. זה מגוון של תרכובות N הנגישים עבור אנאבוליזם הופך תנאים אלה מדיה מורכבת מאוד שונים מאלה הנפוץ עבור מחקרים פיזיולוגיים, כמו האחרון מושגות באמצעות מקור ייחודי של חנקן, בדרך כלל אמוניום.
בסך הכל, הפנימו עשוי להיות שולבו חלבונים או catabolized ישירות תרכובות חנקן. מבנה הרשת של חילוף החומרים חנקן מיקרואורגניזמים רבים, כולל את השמרים האפייה, מורכב מאוד בהתאם המגוון של סובסטרטים. סכמטי, מערכת זו מבוססת על השילוב של הליבה המרכזית של חילוף החומרים של חנקן אשר מזרז את interconversion של גלוטמין, גלוטמט וα-ketoglutarate10,11, עם הטרנסאמינאז ורמת deaminases. דרך רשת זו, אמין קבוצות אמוניום או חומצות אמיניות אחרות נאספים ושוחררה חומצות α-קטו. Intermediates אלה הם גם synthetized עד12,פחמן מרכזי חילוף החומרים (CCM)13. זה מספר רב של תגובות מסועף, intermediates, מעורב קטבוליזם של מקורות חנקן אקסוגני והן את אנאבוליזם proteinogenic חומצות אמינו, ממלא את הדרישות anabolic של התאים. הפעילות דרך המסלולים מחוברים שונים תוצאות גם הפרשה של מטבוליטים. בפרט, חומצות α-קטו ייתכן שתנותב דרך ארליך בשביל לייצר כהלים גבוה יותר, שלהם אצטט אסתר נגזרים14, אשר חיוני כתורמים הפרופילים חושית של מוצרים. לאחר מכן, איך פועל חנקן מטבוליזם תפקיד המפתח לייצור ביומסה, היווצרות של מולקולות נדיפות (ארומה).
תגובות, אנזימים, גנים המעורבים בחילוף החומרים חנקן מתוארים בהרחבה בספרות. עם זאת, סוגיית חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי רשת מטבולית לא כבר טופלה. ישנן שתי סיבות עיקריות להסביר חוסר מידע. ראשית, על רקע המורכבות חשוב של הרשת חילוף החומרים חנקן, כמות גדולה של נתונים כמותיים נדרשת עבור הבנה מלאה של הפעולה שלו, זה לא היה זמין עד עכשיו. שנית, רבים ניסיוני אילוצים ומגבלות של שיטות אנליטיות מנעו את יישום גישות ששימשו בעבר הבהרה של הפונקציה CCM.
כדי להתגבר על בעיות אלה, בחרנו לפתח גישה ברמת המערכת המבוסס על הפיוס של נתונים מתוך סדרה של ניסויים איזוטרופי מעקב. זרימת העבודה כוללת: -קבוצת fermentations מתבצעת תחת באותם תנאים סביבתיים, בעוד מקור מזין שנבחר שונה (סובסטרט) נקראת בכל פעם. -שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) לקביעת מדויק, בשלבים שונים של התסיסה, של ריכוז המצע שכותרתו וריכוז שיורית והעשרה איזוטרופי של תרכובות הנגזרים קטבוליזם של מולקולת שכותרתו, כולל ביומסה נגזר. -חישוב של האיזון מסה ו איזוטרופי לכל נצרך מולקולה שכותרתו, ניתוח משולב נוסף של ערכת הנתונים כדי לקבל סקירה הכללית של ההנהלה של מקורות מזון רבים על-ידי מיקרואורגניזמים באמצעות הקביעה של יחסי גודל השטף .
כדי להחיל מתודולוגיה זו, ישולם תשומת לב להתנהגות לשחזור של הזן/בקטריה בין תרבויות. יתר על כן, יש לקחת דגימות מתרבויות שונות במהלך התקדמות התסיסה מוגדרים היטב אותו. עבודה ניסיונית דיווח בכתב היד, מערכת בסיוע רובוט משמש לניטור המקוון של fermentations להביא בחשבון אילוצים אלה.
יתר על כן, זה חיוני לבחור סט מצעים עם תוויות (מתחם טבע, המיקום של תיוג) המתאים לדון בבעיית המדעי של המחקר. . הנה, 15התווית על-ידי N אמוניום, גלוטמין וארגינין נבחרו שלושה מקורות חנקן העיקריים שנמצאו מיץ ענבים. פעולה זו מותרת הערכת הדפוס של חנקן הפצה מחדש של תרכובות נצרך כדי חומצות האמינו את proteinogenic. אנחנו נועד גם כדי לחקור את גורלו של עמוד השדרה פחמן של חומצות האמינו נצרך את ותרומתם הייצור של מולקולות נדיפות. לפגוש את המטרה, בצורה אחידה 13התווית על-ידי C לאוצין, איזולאוצין, תראונין, ולין נכללו במחקר כמו חומצות אמינו הנגזרים intermediates העיקריים של הנתיב ארליך.
בסך הכל, באופן כמותי חרשנו שבו שמרים מנהל משאב חנקן מורכבים, בעזרת חנקן אקסוגני מקורות כדי למלא את הדרישות anabolic שלה במהלך התסיסה בעת הסרת בנוסף עודף של פחמן מבשרי כמו מולקולות נדיפות. ניתן להחיל את הליך ניסיוני דיווח בעיתון הזה לחקור מקורות תזונתיים מרובים אחרים בשימוש על ידי כל מיקרואורגניזם אחר. זה נראה גישה המתאים לניתוח של ההשפעה של הרקע הגנטי או תנאי הסביבה על התנהגות מטבולית של מיקרואורגניזמים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>141341.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Fructose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>142728.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Malic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt (II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine, hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergost&#233;rol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101074F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C5-L-Valine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2249-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-L-Leucine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2262-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-Ammonium chloride</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALPHA-15N-L-Glutamine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-1016-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-15N4-L-Arginine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-396-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl propanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylpropanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>246085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl butanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>306886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8.08541.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl hexanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>148962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl octanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl decanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W243205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl dodecanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl succinate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W237701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W217514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W364401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methyl butyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>287725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>290580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>294829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>133051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>128570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>77861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>94425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>193070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W310212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>153745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W279900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W236403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentor 1L</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1357</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable vacuum filtration system</td>
			<td>Dominique Deutscher</td>
			<td>029311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenters (250 ml)</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1352</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentation locks</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1356</td>
			<td>Fermetation locks handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoYeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoPeptone</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605697</td>
			<td>Multisizer 3 Coulter Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Jouan</td>
			<td></td>
			<td>GR412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Robotic system</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td>PF0X-MA</td>
			<td>Automatic instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Software</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td></td>
			<td>Robot monitor software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RobView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house developed calculation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My SQL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>International source database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50088009</td>
			<td>String Drive 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchBlotter platform rocker</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>60903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia enzymatic kit</td>
			<td>R-Biopharm AG</td>
			<td>5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer UviLine 9400</td>
			<td>Secomam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - acidics and neutrals</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - basics</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalycilic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochrom 30 AAA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZChrom Elite</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultropac 8 resin Lithium</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6002-47</td>
			<td>Lithium High Resolution Physiological Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Millex GV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGVX13NL</td>
			<td>Millex GV 13mm (pore size 0.22 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter PALL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-4157</td>
			<td>Supor-450 47mm 0.45&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump Millivac Mini</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XF5423050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium smooth weigh dish 70mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>611-1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Mettler</td>
			<td></td>
			<td>Specifications AE163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid dried</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1029310161</td>
			<td>(max. 0.025% H2O) SeccoSolv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combustion oven</td>
			<td>Legallais</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>UP40840A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td>Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate buffer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2038-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial solution of hydrolyzed amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AAS18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass culture tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z653586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>131780500</td>
			<td>99% Extrapure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl chloroformate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinserts for 1.5ml vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SU860066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5890 GC/5973 MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemstation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Chromasolv, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>ChromasolvPlus, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>394963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>33024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-17MS column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>122-4731</td>
			<td>30m*0.25mm*0.15&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate, anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical nitrogen</td>
			<td>Air products</td>
			<td>14629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebron ZB-WAX column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m*0.25mm*0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium BIP</td>
			<td>Air products</td>
			<td>26699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources

מחקרים בתחום המיקרוביולוגיה להסתמך על ביצוע מגוון רחב של מתודולוגיות. בפרט, פיתוח שיטות המתאימות תורמת באופן משמעותי במתן ידע נרחב על חילוף החומרים של המיקרואורגניזמים הגדלים בתקשורת כימית מוגדרים המכילים חנקן ייחודי ומקורות פחמן. לעומת זאת, הניהול באמצעות חילוף החומרים ממספר מקורות מזון, למרות נוכחותם רחבה בסביבה טבעית או תעשייתית, נשאר כמעט שאינו גלוי. המצב הזה הוא בעיקר בגלל חוסר של מתודולוגיות מתאימים, שפוגעת חקירות.
אנחנו מדווחים על אסטרטגיית ניסיוני לחקור באופן כמותי ומקיף איך חילוף החומרים פועל כאשר התזונתי מסופק הוא תערובת של מולקולות שונות, קרי, משאב מורכבים. כאן, אנו מתארים את היישום שלה לשם הערכת חלוקת ממספר מקורות חנקן דרך הרשת מטבולית שמרים. זרימת העבודה משלב מידע שהתקבל במהלך איזוטופ יציב מעקב ניסויים באמצעות שנבחרו 13C - או 15התווית על-ידי N סובסטרטים. תחילה מורכבת fermentations מקבילים, לשחזור במדיום אותו, הכולל תערובת של מולקולות המכילות N; עם זאת, מקור חנקן שנבחר מסומן בכל פעם. שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) מיושמת כדי להעריך את הדפוסים תיוג של תרכובות יישוב וכדי לכמת את צריכת ושחזור של מצעים בשנת מטבוליטים אחרים. ניתוח משולב של ערכת הנתונים השלם מספק מבט על גורלם של סובסטרטים נצרך בתוך התאים. גישה זו דורשת פרוטוקול מדויק עבור האוסף של דוגמאות – הקל על-ידי מערכת בסיוע רובוט לניטור המקוון של fermentations – ואת ההישג של אינספור ניתוחים גוזלת זמן. למרות אילוצים אלה, זה מותר הבנה, בפעם הראשונה, חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי הרשת מטבולית שמרים. מבואר הפצה מחדש של חנקן ממקורות שופע יותר לכיוון N-תרכובות אחרות ואנו נחוש את המקורות מטבולית של מולקולות נדיפות וחומצות אמינו proteinogenic.

תרשים 3 מציג תרשים סכימטי של זרימת העבודה שיושמה כדי לחקור את הניהול על ידי שמרים של מקורות חנקן מרובות שנמצאו במהלך התסיסה היין. עבור נקודות שונות של הדגימה, המאפיינים ביולוגי פרמטרי – צמיחה, דפוסי צריכת החנקן לפרופיל של proteinogenic חומצות אמינו – הצג הפאר?...

Watch this Scientific Journal Video about Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources at JoVE.com

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסוי לחקור באופן כמותי ומקיף על חילוף החומרים של מקורות מזון רבים. זרימת עבודה זו, המבוססת על שילוב של ניסויים מעקב איזוטרופי שגרת אנליטית, מאפשר את גורלו של חומרים מזינים נצרך המקור מטבולית של מולקולות synthetized על-ידי מיקרואורגניזמים נקבע.

זרימת עבודה המבוסס על השילוב של מעקב איזוטרופי ניסויים כדי לחקור את חילוף החומרים מיקרוביאלית של מקורות מזון רבים

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

שילוב של Microstereolithography וElectrospinning כדי לייצר ממברנות מצויד בגומחות להתחדשות קרנית

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

טיפול נסיוני הערכת הביצועים של הגששים סאונד חדש מבוסס על טכנולוגיית CMUT ביישום כדי הדמיה מוחית

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

יצירת מבוקרת, נופים כימיים דינמי ללמוד התנהגות מיקרוביאלית

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...