Name: workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources at JoVE.com

Vi takker Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin og Jean-Marie Sabalyrolles for å bidra til oppfatningen av robot-assistert gjæring og Martine Pradal, Nicolas Bouvier og Pascale Brial deres kundestøtte. Midler til prosjektet ble gitt av Ministère de l'Education Nationale de la Recherche et de la Technologie.

1. gjæring og prøvetaking
<ol><li>
Utarbeidelse av media og fermenters Merk: Alle fermentations er utført parallelt, bruker den samme stammen og på samme kjemisk definert syntetiske medium (SM, komposisjon i tabell 1), som inneholder en blanding av ammonium og aminosyrer nitrogen kilder15. For hver gjæring tilbys et enkelt nitrogen sammensatt utelukkende i jevnt merket 13C eller 15N skjemaer (100%), mens andre fortsatt umerket. For ...

<ol>
	<li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast:+developments+and+impacts.">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li><li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression.">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li><li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis.">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li><li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints.">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li><li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments.">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).</li><li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems.">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li><li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis.">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li><li>Quek, L. -. E., Dietmair, S., Kr&#246;mer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture.">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li><li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+amino+acids+during+beer+production:+The+concept+of+a+critical+time+value.">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li><li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li><li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid,+nucleotide,+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li><li>Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).</li><li>Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid+and+nucleotide+biosynthesis+in+yeast.">Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).</li><li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production:+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism.">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li><li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+detection+of+assimilable+nitrogen+deficiencies+during+alcoholic+fermentation+in+oenological+conditions.">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li><li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network.">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li><li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoCor:+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments.">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li></ol>

Kvantifisere partisjonering av forbindelser via metabolske nettverk som bruker isotopanrikning tracer eksperimenter er en lovende tilnærming for å forstå drift av mikrobielle metabolisme. Nå denne metodikken, mens ble brukt med en eller to merket underlag, kan ikke implementeres for å studere metabolisme av ulike kilder ved hjelp av flere merket elementær isotoper (dvs., mer enn to underlag). Faktisk kan tilgjengelig analytiske teknikker nøyaktig bestemmelse av merking mønstre av proteinogenic aminosyrer...

Forstå er hvordan mikrobiell metabolisme driver en viktig sak for utformingen av effektive strategier for å forbedre gjæring prosesser og modulere produksjonen av fermentative forbindelser. Fremskritt i genomics og funksjonell genomforskning i disse to siste tiårene i stor grad bidratt til å utvide kunnskapen om topologien for metabolske nettverk i mange mikroorganismer. Tilgang til denne informasjonen førte til utviklingen av tilnærminger som mål for en omfattende oversikt over cellulære funksjoner1. Disse metodene er ofte avhengige av en modell-basert tolkning av målbare parametere. Disse eksperimentelle data omfatter, på den ene siden metabolitten opptak og produksjon priser, og på den annen side, kvantitativ intracellulær informasjon som hentes fra isotop tracer eksperimenter. Disse dataene inneholder viktig informasjon om fradrag i vivo aktivitet av ulike veier i en definert metabolske nettverk2,3,4. Foreløpig tilgjengelig analytiske teknikker bare aktiverer nøyaktig påvisning av merking mønstre av molekyler ved en ett element isotop og muligens når co merking med to isotopanrikning elementer. Videre under de fleste vekst forhold består karbon kilde bare av én eller to-forbindelser. Følgelig ble tilnærminger basert på 13C-isotopanrikning tracers fra karbon underlag utbredt og vellykket brukt til å utvikle en fullstendig forståelse av karbon metabolske nettverk operasjoner5,6,7 ,8.
I kontrast i mange naturlige og industrielle miljøer består tilgjengelig nitrogen ressursen som støtter mikrobiell vekst ofte av en rekke molekyler. For eksempel i vin eller øl gjæring leveres nitrogen som en blanding av 18 aminosyrer og ammonium variabel konsentrasjoner9. Dette rekke N forbindelser som er tilgjengelige for anabolism gjør disse komplekse media forholdene svært forskjellig fra de som vanligvis brukes for fysiologiske studier, som sistnevnte er oppnådd ved hjelp av en unik kilde til nitrogen, vanligvis ammonium.
Samlet internalisert nitrogen forbindelser kan være direkte innlemmet i proteiner eller catabolized. Nettverkets struktur av nitrogen stoffskiftet i mange mikroorganismer, inkludert gjær Saccharomyces cerevisiae, er svært kompleks i samsvar med mangfoldet av underlag. Skjematisk, er dette systemet basert på kombinasjonen av den sentrale kjernen av nitrogen stoffskifte som gir interconversion glutamin, glutamat og α-ketoglutarate10,11, transaminaser og deaminases. Gjennom dette nettverket, Amin grupper fra ammonium eller andre aminosyrer er samlet og α-keto syrer utgitt. Disse mellomprodukter er også synthetized til sentrale karbon metabolisme (CCM)12,13. Antall forgrenet reaksjoner og mellomprodukter, involvert i både katabolisme eksogene nitrogen kilder og anabolism av proteinogenic aminosyrer, oppfyller kravene anabole cellene. Aktiviteten gjennom disse forskjellige sammenkoblede ruter resulterer også i utskillelse av metabolitter. Spesielt kan α-keto syrer bli sendt gjennom Ehrlich sti å produsere høyere alkoholer og deres acetate ester derivater14, som er viktige bidragsytere til sensorisk profil av produkter. Deretter spiller hvordan nitrogen metabolisme opererer en nøkkelrolle i biomasse produksjon og dannelsen av flyktige molekyler (aroma).
Reaksjoner, enzymer og gener involvert i nitrogen metabolisme er grundig beskrevet i litteraturen. Men har spørsmålet om distribusjon av flere nitrogen kilder gjennom et metabolske nettverk ikke ennå blitt adressert. Det er to hovedgrunner som forklarer denne mangelen på informasjon. Først lys viktig kompleksiteten av nitrogen metabolisme nettverket, en stor mengde kvantitative data er nødvendig for en fullstendig forståelse av driften som ikke var tilgjengelig før nå. Andre, mange eksperimentelle begrensninger og begrensninger av analytiske metoder hindret gjennomføringen av tilnærminger som tidligere ble brukt til utviklingen av CCM-funksjonen.
For å overvinne disse problemene, valgte vi å utvikle en systemnivå tilnærming basert på avstemming av data fra en rekke isotopanrikning tracer eksperimenter. Arbeidsflyten inneholder: -Et sett av fermentations utført under samme miljømessige forhold, mens en annen valgte næringsstoffer kilde (substrat) er merket hver gang. -En kombinasjon av analytisk prosedyrer (HPLC, GC-MS) for en nøyaktig bestemmelse, på ulike stadier av gjæring, gjenværende konsentrasjonen av merket substrat og konsentrasjonen og isotopanrikning anriking av forbindelser som er avledet fra katabolisme av merket molekyl, inkludert avledede biomasse. – En beregning av masse og isotopanrikning saldoen for hver fortært merket molekylet og en mer integrert analyse av datasettet å få en generell oversikt over forvaltningen av flere næringsstoffer kilder av mikroorganismer gjennom bestemmelse av flux prosenter .
Hvis du vil bruke denne metoden, må oppmerksomhet betales i reproduserbar virkemåten til den belastning/microorganism mellom kulturer. Videre må prøver fra ulike kulturer tas under samme veldefinerte gjæring utviklingen. I eksperimentelle arbeidet i dette manuskriptet, brukes en robot-assistert system for avlytting av fermentations å ta hensyn til disse begrensninger.
Det er viktig å velge et sett med merket underlag (sammensatte, natur og plasseringen av merkingen) som passer til til vitenskapelige problemet av studien. Her, ble 15N-merket ammonium, glutamin og arginin valgt som tre store nitrogen kildene funnet i druesaft. Dette tillot vurdere mønster av nitrogen omfordeling fra brukte forbindelser til aminosyrer proteinogenic. Vi har også som mål å undersøke skjebnen til karbon ryggraden i brukte aminosyrer og deres bidrag til produksjonen av flyktige molekyler. For å oppfylle dette målet, jevnt 13C-merket leucine, ble isoleucin, threonin og Valin inkludert i studien som aminosyrer som er avledet fra store intermediates av Ehrlich veien.
Samlet utforsket vi kvantitativt hvordan gjær administrerer en kompleks nitrogen ressurs ved å omfordele eksogene nitrogen kilder for å oppfylle sin anabole krav gjennom gjæring under i tillegg fjerning overskytende av karbon prekursorer som flyktige molekyler. Den eksperimentelle prosedyren i notatet kan brukes for å undersøke andre flere næringsstoffer kilder brukes av noen andre microorganism. Det synes å være en passende tilnærming for analyse av virkningen av genetisk bakgrunn eller miljøforhold på metabolske virkemåten av mikroorganismer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>141341.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Fructose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>142728.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Malic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt (II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine, hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergost&#233;rol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101074F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C5-L-Valine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2249-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-L-Leucine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2262-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-Ammonium chloride</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALPHA-15N-L-Glutamine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-1016-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-15N4-L-Arginine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-396-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl propanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylpropanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>246085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl butanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>306886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8.08541.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl hexanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>148962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl octanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl decanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W243205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl dodecanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl succinate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W237701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W217514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W364401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methyl butyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>287725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>290580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>294829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>133051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>128570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>77861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>94425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>193070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W310212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>153745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W279900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W236403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentor 1L</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1357</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable vacuum filtration system</td>
			<td>Dominique Deutscher</td>
			<td>029311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenters (250 ml)</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1352</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentation locks</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1356</td>
			<td>Fermetation locks handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoYeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoPeptone</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605697</td>
			<td>Multisizer 3 Coulter Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Jouan</td>
			<td></td>
			<td>GR412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Robotic system</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td>PF0X-MA</td>
			<td>Automatic instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Software</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td></td>
			<td>Robot monitor software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RobView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house developed calculation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My SQL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>International source database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50088009</td>
			<td>String Drive 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchBlotter platform rocker</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>60903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia enzymatic kit</td>
			<td>R-Biopharm AG</td>
			<td>5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer UviLine 9400</td>
			<td>Secomam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - acidics and neutrals</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - basics</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalycilic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochrom 30 AAA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZChrom Elite</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultropac 8 resin Lithium</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6002-47</td>
			<td>Lithium High Resolution Physiological Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Millex GV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGVX13NL</td>
			<td>Millex GV 13mm (pore size 0.22 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter PALL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-4157</td>
			<td>Supor-450 47mm 0.45&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump Millivac Mini</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XF5423050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium smooth weigh dish 70mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>611-1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Mettler</td>
			<td></td>
			<td>Specifications AE163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid dried</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1029310161</td>
			<td>(max. 0.025% H2O) SeccoSolv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combustion oven</td>
			<td>Legallais</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>UP40840A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td>Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate buffer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2038-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial solution of hydrolyzed amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AAS18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass culture tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z653586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>131780500</td>
			<td>99% Extrapure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl chloroformate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinserts for 1.5ml vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SU860066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5890 GC/5973 MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemstation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Chromasolv, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>ChromasolvPlus, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>394963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>33024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-17MS column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>122-4731</td>
			<td>30m*0.25mm*0.15&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate, anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical nitrogen</td>
			<td>Air products</td>
			<td>14629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebron ZB-WAX column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m*0.25mm*0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium BIP</td>
			<td>Air products</td>
			<td>26699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources

Studier innen mikrobiologi stole på gjennomføringen av en rekke metoder. Spesielt bidrar utviklingen av egnede metoder vesentlig til å gi omfattende kunnskap om metabolismen av mikroorganismer vokser i kjemisk definerte mediet som inneholder unike nitrogen og karbon kilder. Derimot forblir styring gjennom metabolisme av flere næringsstoffer kilder, til tross for sin brede tilstedeværelse i natur- eller industrielle miljøer, nesten ukjente. Denne situasjonen skyldes hovedsakelig mangel på passende metoder, som hindrer undersøkelser.
Vi rapporterer en eksperimentell strategi kvantitativt og omfattende utforske hvordan stoffskiftet fungerer når et næringsstoff som finnes som en blanding av ulike molekyler, i.e., en omfattende ressurs. Her beskriver vi sin søknad for å vurdere partisjonering flere nitrogen kilder gjennom gjær metabolske nettverket. Arbeidsflyten kombinerer informasjon innhentet under stabil isotop tracer eksperimenter med valgte 13C- eller 15N-merket underlag. Den første består av parallelle og reproduserbar fermentations i samme medium, som inneholder en blanding av N inneholder molekyler; men er en valgte nitrogen kilde merket hver gang. En kombinasjon av analytisk prosedyrer (HPLC, GC-MS) er gjennomført å vurdere merking mønstre av målrettet forbindelser og å kvantifisere forbruk og gjenoppretting av underlag i andre metabolitter. En integrert analyse av hele datasettet gir en oversikt over skjebnen til brukte underlag i celler. Dette krever en presis protokoll for innsamling av prøver-tilrettelagt av en robot-assistert system for avlytting av fermentations- og oppnåelse av mange tidkrevende analyser. Til tross for disse begrensningene er lov det forståelse for første gang, partisjonering av flere nitrogen kilder på gjær metabolske nettverket. Vi belyst videreformidling av nitrogen fra mer rikelig kilder mot andre N-forbindelser og bestemt metabolske opprinnelsen til ustabile molekyler og proteinogenic aminosyrer.

Figur 3 viser en skjematisk diagram for arbeidsflyten som ble gjennomført for å undersøke forvaltningen av gjær flere nitrogen kilder finnes i vin gjæring. For ulike steder av prøvetaking, biologiske parametere-vekst egenskapene, nitrogen forbruksmønstre og profilen proteinogenic aminosyrer-Vis en høy reproduserbarhet blant fermentations (Figur 4). Konsistens validerer relevansen av tilnærming basert på en kombinasjo...

Watch this Scientific Journal Video about Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources at JoVE.com

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Denne protokollen beskriver en eksperimentelle prosedyren kvantitativt og omfattende undersøke metabolismen av flere næringsstoffer kilder. Denne arbeidsflyten, basert på en kombinasjon av isotopanrikning tracer eksperimenter og en analytiske prosedyren kan skjebnen til brukte næringsstoffer og metabolske opprinnelsen til molekyler synthetized av mikroorganismer skal fastsettes.

Arbeidsflyt basert på kombinasjonen av isotopanrikning Tracer eksperimenter for å undersøke mikrobiell metabolismen av flere næringsstoffer kilder

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Etablering av et kirurgisk indusert Model i mus for å undersøke den beskyttende rollen Progranulin i Artrose

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Kombinasjon av Microstereolithography og electro å produsere Membraner Utstyrt med nisjer hornhinnens Regeneration

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En eksperimentell og Finite Element-protokollen for å undersøke Transport av nøytrale og siktet Oppløste stoffer over Leddbrusk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

En eksperimentell protokoll for taksere arbeidsinnsatsen av nye ultralyd sonder basert på CMUT teknologi i programmet hjernen bildebehandling

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: En kraftig, Noninvasive tilnærming til undersøke Cellular energi metabolisme

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Gjennomføre flere Imaging modi med en fluorescens mikroskopet

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gene Expression analyse av endotelceller utsatt for skjæring Stress ved hjelp av flere parallelle-plate flyt Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generere kontrollerte, dynamiske kjemiske landskap for å studere mikrobiell atferd

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...