Name: workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources at JoVE.com

Vi tackar Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin och Jean-Marie Sabalyrolles för att bidra till befruktningen av robot-assisterad jäsning systemet och Martine Pradal, Nicolas Bouvier och Pascale Brial för deras tekniska support. Finansiering av detta projekt lämnades av Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

1. jäsning och provtagning
<ol><li>
Förberedelse av media och komposter Obs: Alla fermentering är utföras parallellt, med hjälp av samma stam och i samma kemiskt definierade syntetiskt medium (SM, sammansättning anges i tabell 1), som innehåller en blandning av ammonium och aminosyror som kväve källor15. För varje jäsning tillhandahålls en enda kväve förening uteslutande i ett enhetligt märkta 13C eller 15N formulär (100%...

<ol>
	<li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast:+developments+and+impacts.">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li><li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression.">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li><li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis.">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li><li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints.">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li><li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments.">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).</li><li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems.">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li><li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis.">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li><li>Quek, L. -. E., Dietmair, S., Kr&#246;mer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture.">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li><li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+amino+acids+during+beer+production:+The+concept+of+a+critical+time+value.">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li><li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li><li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid,+nucleotide,+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li><li>Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).</li><li>Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid+and+nucleotide+biosynthesis+in+yeast.">Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).</li><li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production:+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism.">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li><li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+detection+of+assimilable+nitrogen+deficiencies+during+alcoholic+fermentation+in+oenological+conditions.">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li><li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network.">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li><li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoCor:+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments.">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li></ol>

Kvantifiering av uppdelning av föreningar genom metaboliska nätverk med isotopiska tracer experiment är en lovande strategi för att förstå driften av mikrobiell metabolism. Denna metod, kan medan tillämpats med ett eller två märkta substrat, inte för närvarande tillämpas för att studera metabolismen av olika källor med hjälp av flera märkta elementärt isotoper (dvs, mer än två substrat). Faktiskt, de tillgängliga analytiska teknikerna aktivera noggrann bestämning av märkning konsumtionsmön...

Förståelse är hur mikrobiell ämnesomsättning fungerar en nyckelfråga för design av effektiva strategier för att förbättra jäsningsprocesser och modulera produktion av fermentativa föreningar. Framstegen inom genomik och funktionsgenomik i dessa senaste två decennierna i hög grad bidragit till att utöka kunskapen om topologin för metaboliska nätverk i många mikroorganismer. Tillgång till denna information ledde till utvecklingen av metoder som syftar till en omfattande översikt av cellulär funktion1. Dessa metoder är ofta beroende av en modellbaserad tolkning av mätbara parametrar. Dessa experimentella data inkluderar, å ena sidan, metabolit upptag och produktion priser och, å andra kvantitativa intracellulära informationen som erhålls från isotopen tracer experiment. Dessa uppgifter ger viktig information för avdrag för aktiviteten i vivo av olika vägar i en definierad metaboliska nätverk2,3,4. För närvarande är de tillgängliga analytiska teknikerna bara aktivera exakt detektion av märkning mönster av molekyler när du använder en enda element isotop och eventuellt när Co märkning med två isotopiska element. Dessutom under de flesta odlingsbetingelser består kol källan bara av en eller två-föreningar. Följaktligen, metoder som bygger på 13C-isotopiska spårämnen från kol substrat allmänt och framgångsrikt tillämpades för att utveckla en fullständig förståelse av kol metabola network operations5,6,7 ,8.
Däremot i många naturliga och industriella miljöer består resursen tillgängligt kväve som stöder mikrobiell tillväxt ofta av ett brett utbud av molekyler. Exempelvis under jäsning av vin eller öl tillhandahålls kväve som en blandning av 18 aminosyror och ammonium vid varierande koncentrationer9. Denna samling av N-föreningar som är tillgängliga för anabolism gör dessa komplexa media villkor avsevärt skiljer sig från de vanligaste för fysiologiska studier, eftersom det senare uppnås med hjälp av en unik källa till kväve, vanligtvis ammonium.
Sammantaget internaliserat kväve föreningar kan ingå i proteiner eller kataboliseras direkt. Nätstrukturen av kväve metabolism i många mikroorganismer, inklusive jästen Saccharomyces cerevisiae, är mycket komplext i enlighet med mångfalden av substrat. Schematiskt, är detta system baserat på en kombination av den centrala kärnan av kväve metabolism vilket katalyserar omvandling av glutamin, glutamat och α-ketoglutarat10,11, med transaminaser och deaminases. Genom detta nätverk, amine grupper från ammonium eller andra aminosyror är samlade och α-keto syror släppt. Dessa intermediärer är också synthetized genom centrala kol metabolism (CCM)12,13. Detta stora antal Grenade reaktioner och intermediärer, involverade i både katabolismen av exogena kväve källor och anabolism proteinogena aminosyror, uppfyller de anabola kraven i cellerna. Aktiviteten via dessa olika sammanlänkade vägar leder även utsöndring av metaboliter. I synnerhet kan α-keto syror omdirigeras via Ehrlich vägen att producera högre alkoholer och deras acetat ester derivat14, som är viktig bidragsgivare till de sensoriska profilerna av produkter. Därefter spelar hur kväve ämnesomsättning fungerar en nyckelroll i produktion av biomassa och bildandet av flyktiga molekyler (arom).
De reaktioner, enzymer och gener som är involverade i metabolismen av kväve är utförligt beskrivna i litteraturen. Dock har frågan om fördelningen av flera kväve källor i hela ett metaboliska nätverk inte ännu tagits upp. Det finns två huvudsakliga skäl som förklarar denna brist på information. Först, med tanke på viktiga komplexiteten av kväve metabolism nätverket, en stor mängd kvantitativa data krävs för en fullständig förståelse av verksamheten som inte var tillgänglig förrän nu. Andra, många experimentella begränsningar och begränsningar av analysmetoder hindrade genomförandet av strategier som tidigare användes för förtydligandet av CCM funktion.
För att övervinna dessa problem, valde vi att utveckla en strategi för system-nivå som baseras på försoningen av data från en serie isotopiska tracer experiment. Arbetsflödet innehåller: -En uppsättning av fermentering som utförs under samma miljöförhållanden, medan en annan valda näringsämnen källa (substrat) är märkta varje gång. -En kombination av analytiska förfaranden (HPLC, GC-MS) för en noggrann bestämning, i olika skeden av jäsning, av kvarvarande koncentrationen av märkt substrat och koncentrationen och isotopiska anrikningen av föreningar som härrör från katabolismen av märkt molekylen, inklusive härledda biomassa. -En beräkning av massa och isotopiska balansen för varje konsumeras märkt molekyl och ytterligare en integrerad analys av datamängden att få en global översikt över förvaltningen av flera näringskällor av mikroorganismer genom bestämning av flux nyckeltal .
För att tillämpa denna metod, måste det uppmärksammas att reproducerbara beteendet av stam/mikroorganism mellan kulturer. Prover från olika kulturer måste dessutom tas under samma väldefinierade jäsning. I experimentella arbetet redovisas i detta manuskript, används ett robot-assisterad system för online-övervakning av fermentering att ta hänsyn till dessa begränsningar.
Dessutom är det viktigt att välja en uppsättning märkt substrat (förening, natur och ställning märkning) som är lämpligt att ta itu med vetenskapliga problemet av studien. Här valdes 15N-märkt ammonium, glutamin och arginin som de tre stora kväve källorna hittade i druvjuice. Detta gjorde att bedöma mönstret av kväve omfördelning från förbrukade föreningar till proteinogena aminosyror. Vi syftar också till att utreda ödet för kol ryggraden i de förbrukade aminosyrorna och deras bidrag till produktionen av flyktiga molekyler. För att uppfylla detta mål, enhetligt 13C-märkta leucin, ingick isoleucin, treonin och valin i studien som aminosyror som härleds från stora intermediärer av Ehrlich väg.
Sammantaget utforskade vi kvantitativt hur jäst hanterar en komplex kväve resurs genom att omfördela exogena kväve källor för att uppfylla dess anabola krav under hela jäsningen medan dessutom att ta bort överskottet av kol prekursorer som flyktiga molekyler. Experimentella förfarandet redovisas i detta dokument kan användas för att undersöka andra flera näringskällor används av någon annan mikroorganism. Det verkar vara en lämplig metod för analys av effekterna av genetisk bakgrund eller miljöförhållanden på metabola uppförandet av mikroorganismer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>141341.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Fructose</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>142728.0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Malic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese sulfate monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt (II) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium heptamolybdate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine, hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergost&#233;rol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>101074F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Valine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C5-L-Valine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2249-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-L-Leucine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>CLM-2262-H-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-Ammonium chloride</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALPHA-15N-L-Glutamine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-1016-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-15N4-L-Arginine</td>
			<td>Eurisotop</td>
			<td>NLM-396-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl propanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>112305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylpropanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>246085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl butanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E15701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 2-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>306886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-methylbutanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8.08541.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl hexanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>148962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl octanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl decanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W243205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl dodecanoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W244015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl succinate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W237701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W217514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W364401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methyl butyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>287725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethyl acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>290580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>294829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>133051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>128570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phenylethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>77861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>94425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>19215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylpropanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>193070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methylbutanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W310212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>153745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W279900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W236403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecanoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentor 1L</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1357</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable vacuum filtration system</td>
			<td>Dominique Deutscher</td>
			<td>029311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermenters (250 ml)</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1352</td>
			<td>Fermenter handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermentation locks</td>
			<td>Legallais</td>
			<td>AT1356</td>
			<td>Fermetation locks handmade for fermentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoYeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoPeptone</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Particle Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605697</td>
			<td>Multisizer 3 Coulter Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Jouan</td>
			<td></td>
			<td>GR412</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Robotic system</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td>PF0X-MA</td>
			<td>Automatic instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Butler Software</td>
			<td>Lab Services BV</td>
			<td></td>
			<td>Robot monitor software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RobView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In-house developed calculation software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My SQL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>International source database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50088009</td>
			<td>String Drive 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchBlotter platform rocker</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>60903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia enzymatic kit</td>
			<td>R-Biopharm AG</td>
			<td>5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer UviLine 9400</td>
			<td>Secomam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - acidics and neutrals</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids standards physiological - basics</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosalycilic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norleucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochrom 30 AAA</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZChrom Elite</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultropac 8 resin Lithium</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>BC80-6002-47</td>
			<td>Lithium High Resolution Physiological Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Millex GV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGVX13NL</td>
			<td>Millex GV 13mm (pore size 0.22 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter PALL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-4157</td>
			<td>Supor-450 47mm 0.45&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump Millivac Mini</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XF5423050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium smooth weigh dish 70mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>611-1380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Mettler</td>
			<td></td>
			<td>Specifications AE163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxid dried</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1029310161</td>
			<td>(max. 0.025% H2O) SeccoSolv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combustion oven</td>
			<td>Legallais</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>UP40840A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td>Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate buffer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-2038-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial solution of hydrolyzed amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AAS18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass culture tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z653586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>131780500</td>
			<td>99% Extrapure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl chloroformate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>854165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinserts for 1.5ml vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SU860066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5890 GC/5973 MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemstation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Instrument control and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Chromasolv, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>ChromasolvPlus, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>394963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>33024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-17MS column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>122-4731</td>
			<td>30m*0.25mm*0.15&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate, anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical nitrogen</td>
			<td>Air products</td>
			<td>14629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebron ZB-WAX column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m*0.25mm*0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium BIP</td>
			<td>Air products</td>
			<td>26699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources

Studier inom mikrobiologi är beroende av genomförandet av en rad olika metoder. Särskilt bidrar utvecklingen av lämpliga metoder väsentligen till att ge omfattande kunskap av metabolismen av mikroorganismer växer i kemiskt definierade media som innehåller unika kväve och kolkällor. Förvaltningen genom metabolism av flera näringskällor, trots deras bred närvaro i naturliga eller industriella miljöer, är däremot fortfarande nästan outforskade. Denna situation beror främst på bristen på lämpliga metoder, som hindrar utredningar.
Vi rapporterar en experimentell strategi att kvantitativt och grundligt utforska hur ämnesomsättningen fungerar när ett näringsämne tillhandahålls som en blandning av olika molekyler, dvs, en komplex resurs. Här, beskriver vi sin ansökan för att bedöma delningen av flera kväve källor genom jäst metaboliska nätverk. Arbetsflödet kombinerar information som erhålls under stabil isotop tracer experiment med valda 13C- eller 15N-märkt substrat. Den första består av parallella och reproducerbara fermentering i samma medium, som innehåller en blandning av N-innehållande molekyler; en valda kväve källa är dock märkt varje gång. En kombination av analytiska förfaranden (HPLC, GC-MS) genomförs att bedöma märkning mönster av riktade föreningar och kvantifiera konsumtion och återvinning av substrat i andra metaboliter. En integrerad analys av hela datamängden innehåller en översikt över ödet av förbrukade substrat inom celler. Denna strategi kräver en korrekt protokoll för insamling av prover – underlättas av ett robot-assisterad system för online-övervakning av fermentering – och uppnåendet av många tidskrävande analyser. Trots dessa begränsningar är tillåtet det att förstå, för första gången av uppdelning av flera kväve källor i hela jäst metabola nätverket. Vi klarlagd omfördelning av kväve från mer rikliga källor mot andra N-föreningar och beslutsam metabolisk ursprung flyktiga molekyler och proteinogena aminosyror.

Figur 3 visar en schematisk bild av det arbetsflöde som genomfördes för att undersöka hanteringen av jäst av flera kväve källorna som finns under vin jäsning. På olika punkter för provtagning, biologiska parametrar – tillväxt egenskaper, kväve konsumtionsmönster och profilen för proteinogena aminosyror – Visa en hög reproducerbarhet bland fermentering (figur 4). Denna konsekvens validerar relevansen av den s...

Watch this Scientific Journal Video about Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources at JoVE.com

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Det här protokollet beskriver en experimentell förfarande för att kvantitativt och grundligt undersöka metabolismen av flera näringskällor. Detta arbetsflöde, baserat på en kombination av isotopiska tracer experiment och en analytisk procedur, tillåter ödet för förbrukade näringsämnen och molekyler synthetized metabolisk ursprung av mikroorganismer skall fastställas.

Arbetsflödet baserat på kombinationen av isotopiska Tracer experiment att undersöka mikrobiell metabolismen av flera näringskällor

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Inrättande av en kirurgiskt inducerad modell i möss för att undersöka den skyddande roll i Progranulin i Artros

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Kombination av Microstereolithography och Electro att producera Membran Utrustad med Nischer för Corneal Regeneration

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

En Experimental och Finite Element protokoll för att undersöka transport av neutrala och laddade Lösta ämnen över Ledbrosk

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

An Experimental Protocol for Assessing the Performance of New Ultrasound Probes Based on CMUT Technology in Application to Brain Imaging

Ett experimentellt protokoll för bedömning av nya ultraljud sonder baserat på CMUT teknik i programmet och hjärnavbildning

The possibility to perform an early and repeatable assessment of imaging performance is fundamental in the design and development process of new ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: En kraftfull, icke-invasiv metod att undersöka cellernas energimetabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Genomföra flera Imaging lägen med en fluorescens Mikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen uttryck analys av Endothelial celler utsätts för Shear Stress med hjälp av flera parallella-plattan flöde Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Generera kontrollerade, dynamiska kemiska landskap för att studera mikrobiell beteende

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...