Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Undersøgelsen blev finansieret af østrigske videnskab fond (FWF), projekt nr. I 1220-B19 (til PS) som en del af projektets ERA i translationel kræft forskning (TRANSCAN) "Circulating tumorceller som biomarkør for Minimal Residual sygdom i Prostata Cancer (CTC-SCAN)". Ph.d.-kandidat S.C. blev uddannet inden for rammen af ph.d.-programmet Molekylær medicin på det medicinske universitet i Graz. Forfatterne parlamentsarbejdet Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz og Johanna Schiller for deres ekspert teknisk bistand. Forfatterne vil gerne takke Georg Peinhaupt understøttelse af grafisk design.

<ol>
	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells.">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li><li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients.">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li><li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples.">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li><li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA.">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li><li>M&#246;hlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH.">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+Release:+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire.">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck.">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li><li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer.">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li><li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer.">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection.">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li><li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer.">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li><li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma.">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells.">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li><li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting.">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622 (2017).</li><li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells:+a+clinical+case+study.">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li><li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer.">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322 (2016).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM.">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells.">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR.">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification.">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li><li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., St&#229;hlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification.">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).</li><li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Challenges+of+Liquid+Biopsies.">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+technologies.">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Den beskrevne protokollen tager sigte på hentning af celler fra en functionalized wire (benævnt enhed) til ex vivo encellede genomisk analyse. Vi testede tre EpCAM-positive cellelinjer (HT-29, LNCaP og VCaP), men i princippet, denne metode kan anvendes til enhver cellelinje at udtrykke EpCAM. EpCAM-positive target-cellerne kan forelægges enhed som ren cellesuspension (Se 2.1.) eller blandet i et overskud af baggrunden celler (fx. perifere blod, se 2.2.). Især sidstnævnte kan anvendes til at teste isolation kapacitet sjældne celle betingelser, finjustering af antallet celler knyttet til wire kan gøres ved hjælp af den beskrevne lav-volumen tilgang (se punkt 2.3.). Da forskellene mellem cellelinjer forventes, hastighed egnet celle tætheder for opladning wire, rotation såvel som inkubationstiden skal afprøves empirisk ved at vurdere antallet af tilknyttede celler ved hjælp af en immunofluorescens mikroskop.
For genomisk downstream programmer på én celle niveau WGA, er påkrævet. WGA metoden variere mellem labs, og i princippet vores metode er åben for alle metoder end kan håndtere prøver fra micromanipulation eller laser microdissection. I denne protokol bruger vi en metode baseret på enzymatisk fragmenterede DNA på grund af en bedre ydeevne sammenlignet med en varme-fragmentering baseret WGA7. Valgfri, enkelt celler kan videresendes til isotermisk WGA giver mulighed for efterfølgende DNA profilering20,21.
Beskrevet protokollen tager sigte på at inddrive intakt celler efter at være knyttet til en ny generation af functionalized ledninger for genomisk encellede analyse. Den første generation af functionalized ledninger, som også repræsenterer kun CE-godkendt i vivo berigelse enheder på markedet indtil videre, blev brugt til optælling af CTCs i spredt sig i kroppen kræftpatienter. Tidligere publikationer og vores egne data tyder i vivo isolation teknik for at være mere følsom i forhold til den nuværende guld standard teknologi2. Således tillader udstyre denne i vivo isolation teknik med en funktion til dokumentgendannelse, som realiseret i enheden kombinerer høj CTC opsving med karakterisering på én celle-niveau.
Men enheden er ikke blevet godkendt til brug hos patienter, således kliniske data er ikke tilgængelige. Ex vivo applikationer (dvs isolere CTCs fra perifert blod efter prøvetagning) ikke anbefales som teknologien er tilpasset til de indstillinger, der er til stede i kubiske forgæves, fx lave diameteren af den forfængelige (øge sandsynligheden for direkte kontakt mellem CTCs og fange antistoffer) og lang opholdstid (30 min, så 2-3 L blod til at passere ledningen). Men som beskrevet i afsnit 2.2. target-cellerne kan også isoleres fra blandet prøver7.
En nuværende begrænsning af metoden er ineffektiv inddrivelse af optagne celler efter løsrivelse fra ledningerne. Dette, kan imidlertid forbedres ved en celle fiksering skridt før udstationering behandling.
I Resumé er denne protokol et første skridt mod den kombinerede brug af en i vivo isolation teknik med celle opsving for genetisk karakterisering af enkelt celler. Yderligere indsats at løse optimering af celle opsving og regnskabsafslutning for dens anvendelse i patienter1,2. Personlig medicin til behandling overvågning og terapi afgørelser er dog ud over optælling af CTCs. Således, denne metode er et første skridt i retning af genomisk CTC karakterisering på det enkelte celle niveau.
Programmer mod encellede transkriptom analyse synes muligt som intakt celler er høstet. Det er imidlertid vurderes, om proceduren for inddrive indvirker på RNA integritet (f.eks. forwarding gendannede enkelt celler til direkte lysis efterfulgt af RT-qPCR22). Hvis det lykkes, kan karakterisering af enkelt celler (f.eks. CTCs) være flyttet til transkriptom niveau, giver mulighed for mere detaljerede analyser. I denne henseende, RNA-seq ved hjælp af Smart-seq2 giver et værdifuldt redskab for RNA downstream analyse af enkelt celler som den preamplified cDNA (opnået under RNA-seq bibliotek forberedelse) kan blive udsat for kvantitativ PCR. Dette vil give mulighed for en kombineret mål og screening-baseret analyse af enkelt gendannede celler22,23.
De nuværende functionalized ledninger er baseret på anti-EpCAM antistoffer, som er udbredte epitelial markør for positiv markering af CTCs24. Som flere CTCs kan nedregulere epitelial markører som cytokeratins eller EpCAM25, ville tilføje antistoffer som HER2/nye øge chancen for CTC isolation. Flere antistof baseret berigelse strategier er blevet udviklet og gennemgået af Ferreira mfl. i 201626. En blanding af antistoffer immobiliseret på en wire kunne være en fremtidig forbedring af teknologi fører til isolering af et højere tal og flere undertyper af CTCs.
Det er obligatorisk for alle skridt involverer wire håndtering for at holde den funktionelle del af wiren neddykket i løsning for at opretholde dens funktionalitet. Vi anbefaler for at placere ledningen i 1 x PBS under evaluering (mikroskop; fx. trin 3.1. -3.3.) og opbevaring. For at undgå upassende farvning, anbefaler vi brug af frisk tilberedt Farvningsopløsningen i trin 1.2.1. og 1.2.2. Svagt farvede celler hæmmer celle tælle på ledningen og kan føre til undervurderingen af de tilknyttede celler.
Det er nødvendigt at undgå plugging Pasteur pipette med en gummihætte, når du indsætter wiren i Pasteur pipette til senere indlæsning af cellesuspension (trin 2.3.4.). Gummihætte bruges til at holde wiren på plads, så at den funktionelle del er beliggende inde i spidsen af Pasteur pipette. Hvis fælles landbrugspolitik er alt for fast tilknyttet den bageste del af Pasteur pipette, er indlæsning af cellesuspension ikke muligt. I dette tilfælde lette fælles landbrugspolitik, således at den luft, der er fordrevet af de indlæste cellesuspension kan forlade pipetten.
Bøje wiren er afgørende for dets orientering under cellen optælling i trin 3.2. og 3.3. Monter ledningerne ved hjælp af selvklæbende tape, sådan at de ikke-funktionelle ende af wiren kommer til at ligge til den ene side. Efter scanning af hele længden af den funktionelle del, kastes wiren 180°, så anden halvdelen af den funktionelle wire kan scannes. Dette trin er vigtigt for indledende forsøg at vurdere antallet af celler på wiren. Når antallet af celler for en bestemt cellelinje og proceduren er evalueret, proceduren kan gentages uden celle tælle (f.eks. kun kontrol for tilstedeværelse af celler eller udelade dette trin). Omhyggelig pipettering er afgørende for at undgå celletab når man skal reducere mængden af supernatanten taktfast 4.8. Sørg for pipettering sker gnidningsløst uden forårsager turbulens til pellet.

For nylig, CellCollector DC01, en medicinsk wire functionalized med anti-EpCAM antistoffer til at isolere CTCs fra perifert blod af kræftpatienter, blev tilføjet til den metodisk spektrum af CTC tælling1,2,3 . I en igangværende undersøgelse i ikke-metastatisk prostatacancer, denne functionalized wire rapporterer næsten dobbelt så mange patienter at være CTC-positive og højere CTC tæller i CTC-positive patienter i forhold til CellSearch, den gyldne standard i CTC optællingen3 . På grund af denne opmuntrende resultater, dyrkning af celler fra en functionalized medicinsk ledning til enkelt-celle analyse ville være ønskeligt, men hverken enzymatisk behandling med celle detachement løsninger (f.eks. trypsin) eller laser microdissection giver mulighed for inddrivelse af intakt celler (data ikke vist).
For at tillade udstationering af erobrede celler, var en ny generation af functionalized ledninger udstyret med en specifik polymer. Denne polymer, der forbinder capture-antistoffer til wire, er modtagelige for en frigivelse buffer behandling tillader udstationering af intakt celler (CellCollector DC03 omtales som enhed). Den nye functionalized indretning, giver isolation af target-cellerne fra forskellige koncentrationer af kræft celle linje celler spidse til bovint serumalbumin (BSA) / fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og perifert blod, henholdsvis.
For at lette den visuelle påvisning af celler på enheden og efter opsving, målrette kræftceller er mærket med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) og en DNA pletten før inddrive behandling (dvs. opladning og afmonterer). Den behandling effekter på DNA kvaliteten af enkelt celler ved hjælp af en kvalitetskontrol PCR4,5, array-CGH6,7 tidligere, blev evalueret efter WGA og målrettet sekventering7 viser ingen forskel i forhold til ubehandlede celler micromanipulated fra celle suspensioner7. Fordelen ved denne metode ligger i kombinationen af sjældne målcellen pre berigelse og inddrivelse af celler til én celle downstream analyse (figur 1). Den nuværende CE-mærket i vivo samling enhed er generelt bruges til optælling af CTCs i stedet for én celle Molekylær karakterisering2,8. Dog mere omfattende analyse at undersøge heterogenitet blandt CTCs længe til analyse på den enkelte celle niveau (dvs. målrettet sekventering på én celle-niveau). Andre cell-baserede metoder er baseret på immunomagnetic isolation af EpCAM-positive CTCs og encellede håndtering baseret på dielektroforesis for efterfølgende Molekylær genetisk analyse9,10. Molekylær karakterisering af CTCs er en vigtig forudsætning for deres nyttige gennemførelse i kliniske omgivelser og er lige så vigtige for grundforskning af metastatisk cascade. Parallelt med CTCs, er cirkulerende tumor DNA (ctDNA) blevet af stor betydning, da det giver mulighed for DNA analyse af tumor byrde med minimal teknisk isolering procedurer11,12. Celle-baserede tilgange kan tjene som et supplerende bidrag, da det giver mulighed for RNA13,14 og protein15 udtryk analyse og også for CTC stammer celle kulturer eller xenografts16, 17. selv om forhindringer såsom lav celle opsving og clearance til brug hos patienter skal stadig overvindes, metoden fangst- og frigivelse tager et vigtigt næste skridt til karakterisering af sjældne target-cellerne.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

Sjældne target-cellerne kan isoleres fra en stor baggrund af ikke-målarter celler ved hjælp af antistoffer specifikke for overflade proteiner af target-cellerne. En nyligt udviklede metode bruger en medicinsk wire functionalized med anti-epitelcelle vedhæftning molekyle (EpCAM) antistoffer for i vivo isolation af cirkulerende tumor celler (CTCs)1. En patient-matchede kohorte i ikke-metastatisk prostatacancer viste, i vivo isolation teknik resulterede i en højere procentdel af patienterne positiv for CTCs samt højere CTC tæller i forhold til den nuværende guld standard i CTC optællingen. Som cellerne ikke kan inddrives fra aktuelle medicinsk udstyr, blev en ny functionalized wire (benævnt enhed) fremstillet tillader opsamling og efterfølgende udstationering af celler af enzymatisk behandling. Celler er tilladt at tillægge enheden, visualiseret på et mikroskop og adskilt ved hjælp af enzymatisk behandling. Gendannede celler er cytocentrifuged på membran-belagt dias og høstet individuelt ved hjælp af laser microdissection eller micromanipulation. Encellede prøver underkastes derefter encellede samlede genom forstærkning tillader flere downstream analyse herunder screening og target-specifikke tilgange. Proceduren for isolation og recovery giver høj kvalitet DNA fra enkelt celler og forringe ikke efterfølgende hele genom forstærkning (WGA). En enkelt celle amplificerede DNA kan videresendes til screening og/eller målrettet analyse som array sammenlignende genom hybridisering (array-CGH) eller sekvensering. Enheden tillader ex vivo isolation fra kunstige sjældne celle prøver (dvs. 500 målceller spidse til 5 mL af perifert blod). Detachement satser af celler er acceptabel (50-90%), genfindingsprocenten for fritliggende celler på dias spænder over en bred vifte afhængig af cellelinie anvendes (< 10 - > 50%) og har brug for nogle yderligere opmærksomhed. Denne enhed er ikke markeret til brug i patienter.

Celler efter CFSE og nukleinsyre farvning kan evalueres ved hjælp af en immunofluorescens mikroskop udstyret med filtre for DAPI og FITC. Kerner til stede med en lyse kontrastfarve i DAPI kanal cytoplasma af celler viser ensartede mærkning med CFSE med heterogene Inter celle intensitet (figur 2A og 2E). Lignende form og farvning intensiteter forventes fra celler knyttet til wire (figur 2B og 2F) såvel som løsrevet fra ledningen og genoprettet på et dias (figur 2D og 2 H).
Høj celle tætheder (f.eks. > 1 000 000 celler/mL) kan resultere i samlede dækning af wire med celler, når opladningen ledningerne. Dog lavere celle tætheder, ændringer i rotationshastighed under inkubation, og brugen af forskellige cellelinjer påvirker isolation effektivitet og skal afprøves særskilt. Når ledningerne blev inkuberet med 5 mL af HT-29 celler til 100.000 celler / mL som beskrevet i afsnit 2.1., en middelværdi på 254 ± 103 celler (n = 5) blev fanget på ledningerne. Med det samme eksperiment ved hjælp af LNCaP celler, en middelværdi på 440 ± 319 celler (n = 5) pr. tråd blev opnået.
Præsentere 500, 5 000 og 50.000 HT-29 celler i en baggrund af 5 mL af perifert blod til ledninger (ifølge protokollen afsnit 2.2.) resulterede i erobringen af 75 ± 18 celler, 25 ± 9 celler og 47 ± 57 celler (n = 3, hver), henholdsvis. Hvis wiren debiteres med 15 µL af cellesuspension (1 000 000 celler/mL) i henhold til protokollen i afsnit 2.3., op til 1 000 (HT-29) celler kan knytte til en wire.
Celle detachement effektivitetsgevinster varierede fra 81% i HT-29 celler (range 54,9% - 93.2%, og n = 5) til 81% (range 63.51% - 92.87%, n = 6) og 91% (spænder 84,7-95.3%, n = 6) i LNCaP og VCaP celler, henholdsvis. På samme måde, inddrivelse af fritliggende celler varierer mellem cellelinjer: en gennemsnitlig 28% af fritliggende HT-29 celler blev inddrevet af cytocentrifugation. Mens genfindingsprocenten for LNCaP var lavere end 10%, var den gennemsnitlige genfindelse sats for VCaP celler 55%.
Ca. 75% af enkelt celler udsat for WGA udbyttet høj kvalitet WGA produkter: Dette er 1) udstrygningspræparat af WGA produkter lige fra 0,1 til > 1 kb (figur 4, top panel) og 2) tre eller fire bands i 4plex kvalitet styre PCR (figur 4, nederste panel) . WGA produkter kan bruges til 1) array-CGH profilering opfylder kvalitetskriterierne for encellede array-CGH profiler 6,7 og 2) målrettet NGS efter fornyet forstærkning WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figur 1: arbejdsproces til isolering og inddrive målceller for enkelt-celle analyse. (A) celler er kulturperler til 90% confluency og (B) høstet for at få en enkelt celle suspension. Efter farvning med CFSE og nukleinsyre pletten, (C) den functionalized ledning er inkuberes med celler i et volumen på 5 mL ved hjælp af reaktion rør eller i en lav lydstyrke ved hjælp af en Pasteur pipette tip. Sidstnævnte giver mulighed for anvendelse af celle suspension diskenheder fra så lavt som 15 µL. (D) celler skal være fritliggende inden for 4 timer efter opladning. Derfor, ledningen er placeret i et 1,5 mL reaktion rør fyldt med udgivelsen buffer. Efter 15 min inkubation på en rocker og 10 min centrifugering, wiren er fjernet og cellesuspension centrifugeres for at sammenpresse cellerne. (E) gendannet celler er enten overført til et glas dias for enkelt-celle micromanipulation (øverst) eller cytocentrifuged på en membran-belagt slide og videresendt til laser microdissection (nederst). (F) endelig høstede enkelt celler forstærkes gennem hele genom forstærkning (WGA). WGA-produkter er kompatible med array-CGH og målrettede NGS downstream analyse. EpCAM epitop: grøn cirkel på cellens overflade. Functionalized wire: enhed, grå triple-cylindriske ledninger. Polymer: lilla linjer. Anti-EpCAM antistoffer: orange. Frigive buffer aktivitet: rød pil. Fedt markør til at holde cellesuspension på plads: mørk blå ellipse. Genvundet cellesuspension: lys blå. Kapillar for micromanipulation: sort linje. Forstørrelse: gendannede cellen høstet af micromanipulation, cytospin på membran-dækket skub indeholdende gendannede celler (grå udfyldt ellipse). Forstørrelse: gendannede celle bliver laser microdissected (grå cirkulær linje: membran fra membran dias tjener som rygraden for laser microdissection), objektiv med laserstråle (blå linje nærmer membran dias fra neden). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figur 2: visualisere mærkede celler. (A, E) Celler før opladning: celler er mærket med CFSE og counterstained med en DNA intercalating farvestof viser et udvalg af CFSE (grøn) signal intensitet. (B,F) Mærkede celler fanget på wiren. (C,G) Wire efter celle-udstationering procedure. (D,H) Celler løsrevet fra wire og inddrives af cytocentrifugation på et dias. CFSE: FITC kanal (grøn). DNA pletten: DAPI kanal (blå). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figur 3: Wire og opbevaring rum. (A) rum af wiren. (B) udsnit af den functionalized del. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figur 4: kvalitetskontrol af WGA produkter fremstillet af enkelt micromanipulated celler. Toppanelet: WGA produkter fremstillet af enkelt celler typisk resultat i DNA udstrygningspræparater spænder fra 0,2 kb til > 1.0 kb med en maksimal intensitet på ca 0.5 kb. Prøver nummer 1, 7 og 13 (vises med stjerner) Vis suboptimal eller ingen DNA udstrygninger. Bundpanelet: WGA produkter er af tilstrækkelig kvalitet, hvis 4plex PCR udbytter tre eller fire af fire PCR produkter (på 100, 200, 300 og 400 bp). Prøver 1, 7, 10 og 13 Vis færre end tre bands og ville blive udelukket fra videre analyse. Lane Møller indeholder en 100 bp-stige og stjerner angiver prøver af utilstrækkelig WGA produktkvalitet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer sekvens</td>
			<td>BEMÆRK</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′</td>
			<td>100 bp fremad primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′</td>
			<td>100 bp omvendt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tgg agc gag gct agc-3 '</td>
			<td>200 bp fremad primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′</td>
			<td>200 bp omvendt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3′</td>
			<td>300 bp fremad primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-tcc handle aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>300 bp omvendt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc kat gcc atc act gc-3′</td>
			<td>400 bp fremad primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gct tga caa agt ggt KBRT tg-3′</td>
			<td>400 bp omvendt primer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primer sekvenser for 4plex kvalitetskontrol PCR

Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Denne protokol er at restituere sig og forberede Molekylær genetisk karakterisering på niveauet encellede sjældne målceller fra en blanding med ikke-målarter baggrund celler. DNA kvalitet er lig med ubehandlede enkelt celler og giver mulighed for enkelt-celle ansøgning (begge screening baseret og målrettet analyse).

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakterisering af cellemembranen udvidelser og studere deres roller i kræft celle vedhæftning Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flowcytometri med fluorescerende celle stregkodesystem for enkelt celle signalering analyse og biomarkør opdagelse

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider: Fordele og ulemper ved enkeltcelle fordøjelse

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisk tumororganoid lægemiddelscreening ved hjælp af widefield levende cellebilleddannelse til bulk- og enkeltorganoidanalyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed stregkode billedanalyse til immunprofilering og rumlig kortlægning karakterisering i enkeltcelleanalyse af paraffinvævsprøver

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...