Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Deze studie is gefinancierd door de Oostenrijkse wetenschap Fonds (FWF), project-no. Ik 1220-B19 (naar P.S.) als onderdeel van de ERANET-project in translationeel kanker onderzoek (TRANSCAN) "Circulerend tumorcellen als biomerker voor Minimal Residual Disease in prostaatkanker (CTC-SCAN)". Promovendus S.C. werd opgeleid in het kader van de PhD programma Molecular Medicine van de medische universiteit van Graz. De auteurs erkennen dankbaar Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz en Johanna Schiller voor hun deskundige technische bijstand. De auteurs bedanken Georg Peinhaupt voor grafisch ontwerp steun.

<ol>
	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells.">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li><li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients.">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li><li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples.">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li><li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA.">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li><li>M&#246;hlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH.">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+Release:+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire.">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck.">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li><li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer.">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li><li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer.">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection.">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li><li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer.">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li><li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma.">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells.">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li><li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting.">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622 (2017).</li><li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells:+a+clinical+case+study.">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li><li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer.">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322 (2016).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM.">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells.">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR.">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification.">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li><li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., St&#229;hlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification.">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).</li><li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Challenges+of+Liquid+Biopsies.">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+technologies.">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het beschreven protocol is gericht op het ophalen van cellen uit een functionalized draad (hierna: apparaat) p.a. ex vivo eencellige genomic. We testten drie cellijnen van de EpCAM-positieve (HT-29, LNCaP en VCaP), maar in principe, deze methode kan worden toegepast op elke regel van de cel uiting van EpCAM. EpCAM-positieve doelcellen kunnen worden voorgelegd aan het apparaat als pure celsuspensie (zie 2.1.) of gemengd in een overschot van achtergrond cellen (bv. perifere bloed, zie punt 2.2.). Overwegende dat vooral de laatste kunnen worden gebruikt voor het testen van isolatie capaciteiten onder zeldzame cel voorwaarden, fine tuning van het aantal cellen die zijn gekoppeld aan de draad kan gebeuren met behulp van de beschreven kleinschalige aanpak (zie 2.3.). Zoals verschillen tussen cellijnen zijn te verwachten, snelheid geschikt cel dichtheden voor het opladen van de draad, rotatie evenals incubatietijd moeten empirisch getest worden door het aantal gekoppelde cellen met behulp van een Microscoop immunofluorescentie te evalueren.
Voor genomic downstream toepassingen op het niveau van de eencellige WGA, is vereist. De WGA-methode van keuze kan verschillen tussen labs en onze methode is in principe open voor alle methoden dan monsters van micromanipulation of laser microdissection kan verwerken. In dit protocol gebruiken we een methode op basis van enzymatisch gefragmenteerde DNA als gevolg van een betere prestaties ten opzichte van een warmte-fragmentatie gebaseerd WGA7. Optionele, interne cellen kunnen worden doorgestuurd naar isothermische WGA waardoor latere DNA profielen van20,21.
Het beschreven protocol beoogt intact cellen te kunnen herstellen na zijn vastgemaakt aan een nieuwe generatie van matiemaatschappij draden voor genomic eencellige analyse. De eerste generatie van matiemaatschappij draden, die ook de afdrukapparaten alleen CE-gekeurd in vivo verrijking op de markt tot nu toe, werden gebruikt voor het opsommen van CTCs in patiënten met kanker uitgezaaid. Eerdere publicaties en onze eigen gegevens suggereren de in vivo isolatie techniek om gevoeliger zijn in vergelijking met de huidige goudstandaard technologie2. Dus, om deze in vivo isolatie techniek met een herstelfunctie uit te rusten, zoals gerealiseerd in het apparaat kunt combineren hoge CTC herstel met de karakterisering van het niveau van de eencellige.
Echter, het apparaat niet is uitgeschakeld voor het gebruik bij patiënten, dus geen klinische gegevens beschikbaar zijn. Ex vivo toepassingen (dwz isoleren CTCs uit perifeer bloed na bemonstering) zijn niet aanbevolen omdat de technologie aangepast aan de instellingen aanwezig zijn in de kubusvormige ijdel, bijvoorbeeld lage diameter is van de ijdele (verhogen de kans op direct contact tussen CTCs en antilichamen) en lange retentietijd (30 min, waardoor 2-3 L van bloed geschiedde de draad). Echter, als omschreven in punt 2.2. doelcellen kunnen ook worden geïsoleerd van gemengde monsters7.
Een huidige beperking van de methode is het inefficiënte herstel van losse cellen na detachement van de draden. Dit, echter kan worden verbeterd door een cel fixatie stap voorafgaand aan de behandeling van het detachement.
Kortom is dit protocol een eerste stap naar het gecombineerd gebruik van een in vivo isolatie techniek met terugwinning van de cel voor genetisch karakteriseren van afzonderlijke cellen. Verdere inspanningen moeten aanpakken van de optimalisering van de cel herstel en goedkeuring voor de toepassing ervan in patiënten1,2. Gepersonaliseerde geneeskunde voor monitoring en therapie behandelingsbeslissingen is echter buiten opsomming van CTCs. Deze methode is dus een eerste stap in de richting genomische karakterisering van de CTC op het niveau van één cel.
Toepassingen naar eencellige transcriptome analyse lijken haalbaar als intact cellen worden geoogst. Het blijft echter om te worden beoordeeld of de herstellende procedure heeft een impact op RNA integriteit (bijvoorbeeld doorsturen herstelde afzonderlijke cellen aan directe lysis gevolgd door RT-qPCR22). Als dat lukt, kan karakterisering van afzonderlijke cellen (bijvoorbeeld CTCs) worden verschoven naar het transcriptoom niveau, waardoor meer gedetailleerde analyses. In dit verband, RNA-seq met behulp van Smart-seq2 biedt een waardevol instrument voor RNA downstream analyse van enige cellen preamplified cDNA (verkregen tijdens RNA-seq bibliotheek voorbereiding) kan worden onderworpen aan kwantitatieve PCR. Hierdoor kan een gecombineerde doel en screening gebaseerde analyse van enkele van de teruggekregen cellen22,23.
De huidige functionalized draden zijn gebaseerd op de antilichamen van de anti-EpCAM die is een veel gebruikte epitheliale marker voor positieve selectie van CTCs24. Als verschillende CTCs downregulate epitheliale markeringen zoals Cytokeratines of EpCAM25 kunnen, zou toevoegen van antistoffen zoals HER2/nieuwe de kans verhogen van CTC isolatie. Verschillende antilichaam gebaseerd verrijking strategieën hebben ontwikkeld en herzien door Ferreira et al. in 201626. Een mengsel van antilichamen geïmmobiliseerd op een draad zou een toekomstige verbetering van de technologie die leidt tot de isolatie van een hoger nummer en extra subtypes CTCs.
Het is verplicht voor alle maatregelen waarbij draad omgaan om te houden van het functionele deel van de draad ondergedompeld in oplossing teneinde de functionaliteit. Het is raadzaam om de draad in 1 x PBS tijdens de beoordeling (Microscoop; bv. 3.1 stappen. -3.3.) en opslag. Om te voorkomen dat ongepaste kleuring, is het raadzaam de kleurstofoplossing in stappen 1.2.1 gebruik vers worden bereid. en 1.2.2. Zwak gekleurde cellen belemmeren cel tellen op de draad en kunnen leiden tot de onderschatting van de gekoppelde cellen.
Het is noodzakelijk om te voorkomen dat het inpluggen van de Pipet van Pasteur met de rubberen dop bij invoegen van de draad in de Pipet van Pasteur voor latere laden van de celsuspensie (stap 2.3.4.). De rubberen dop wordt gebruikt om de draad op zijn plaats te houden, zodat het functionele deel binnen het uiteinde van de Pipet van Pasteur ligt. Als het GLB te stevig wordt vastgemaakt aan de achterkant van de Pipet van Pasteur, is laden van de celsuspensie niet mogelijk. In dit geval het GLB te verlichten zodanig zijn dat de lucht die wordt verplaatst door de geladen celsuspensie de pipet laten kunt.
Buigen van de draad is van cruciaal belang voor zijn oriëntatie tijdens de cel tellen in stappen 3.2. en 3.3. Koppel de draden met behulp van het plakband, zodat de niet-functionele uiteinde van de draad komt te liggen aan de ene kant. Na het scannen van de hele lengte van het functionele deel, is de draad 180° gerold zodat de andere helft van de functionele draad kan worden gescand. Deze stap is belangrijk voor de eerste experimenten ter beoordeling van het aantal cellen op de draad. Zodra het aantal cellen voor een bepaalde cellijn en de procedure wordt geëvalueerd, de procedure kan worden herhaald zonder het tellen van de cel (bv. alleen controleren op de aanwezigheid van cellen of weglaten van deze stap). Zorgvuldige pipetteren is cruciaal voor het verlies van de cel kunt voorkomen vermindering van het volume van het supernatans dat in stap 4.8. Zorg ervoor dat soepel zonder turbulenties op de pellet pipetteren gebeurt.

Onlangs, CellCollector DC01, een medische draad matiemaatschappij met anti-EpCAM antilichamen voor het isoleren van CTCs uit perifeer bloed van kankerpatiënten, werd toegevoegd aan het methodisch spectrum van CTC (opsomming)1,2,3 . In een momenteel lopend onderzoek in niet-gemetastaseerd prostaatkanker, deze functionalized draad verslagen bijna tweemaal zoveel patiënten CTC-positief en hogere CTC telt in CTC-positieve patiënten in vergelijking met CellSearch, de gouden standaard in CTC opsomming3 . Wegens deze bemoedigende prestatie, isolatie van cellen uit een functionalized medische draad voor eencellige analyse zou wenselijk zijn, maar enzymatische behandeling met cel detachement oplossingen (bijvoorbeeld trypsine) noch laser microdissection kunt het herstel van de onbeschadigde cellen (gegevens niet worden weergegeven).
Zodat het detachement van de opgenomen cellen, was een nieuwe generatie van matiemaatschappij draden uitgerust met een specifieke polymeer. Dit polymeer, die de antilichamen vastleggen met de draad verbindt, is gevoelig voor een release buffer behandeling waardoor detachement van onbeschadigde cellen (CellCollector DC03 apparaat genoemd). De nieuwe functionalized apparaat, u kunt isolatie van doelcellen van verschillende concentraties van cel kankercellen spiked in bovien serumalbumine (BSA) lijn / fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en perifeer bloed, respectievelijk.
Om te vereenvoudigen de visuele detectie van cellen op het apparaat en na herstel, de kankercellen doel worden geëtiketteerd met carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) en een DNA-vlek vóór de herstellende behandeling (dwz. opladen en loskoppelen). De behandeling van de effecten op DNA kwaliteit van afzonderlijke cellen werden eerder geëvalueerd na WGA door middel van een kwaliteitscontrole PCR4,5, matrix-CGH6,7 en gerichte sequencing7 tonen geen verschil in vergelijking met niet-behandelde cellen micromanipulated van cel schorsingen7. Het voordeel van deze methode ligt in de combinatie van zeldzame doelcel pre verrijking en het herstel van cellen p.a. eencellige stroomafwaarts (Figuur 1). Het huidige CE-geëtiketteerd in vivo collectie apparaat wordt meestal gebruikt voor het opsommen van CTCs in plaats van voor eencellige moleculaire karakterisering2,8. Echter, meer uitgebreide analyse te onderzoeken heterogeniteit onder CTCs lang voor analyse op het niveau van de individuele cel (dat wil zeggen gericht rangschikken op het niveau van eencellige). Andere cel-gebaseerde methoden zijn gebaseerd op isolatie van de immunomagnetic van EpCAM-positieve CTCs en eencellige behandeling op basis van diëlektroforese voor latere moleculaire genetische analyse9,10. Moleculaire karakterisering van CTCs is een belangrijke voorwaarde voor hun nuttige toepassing in een klinische setting, en is net zo belangrijk bij het basisonderzoek van de metastatische cascade. Parallel aan CTCs, is de circulerende tumor DNA (ctDNA) van groot belang geworden aangezien het toestaat DNA-analyse van de last van de tumor met minimale technische isolatie procedures11,12. De cellen gebaseerde benaderingen kunnen dienen als een aanvullende bijdrage omdat het zorgt voor RNA13,14 en eiwitten15 expressie analyse en ook voor de CTC afgeleid cel culturen of xenografts16, 17. Hoewel obstakels zoals lage cel herstel en goedkeuring voor het gebruik bij patiënten nog worden overwonnen moeten, de vangst- en release-methode neemt een belangrijke volgende stap karakterisering van zeldzame doelcellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

Zeldzame doelcellen kunnen worden geïsoleerd uit een hoge achtergrond van doelsoort cellen met behulp van antilichamen specifiek voor oppervlakte proteïnen van de doelcellen. Een onlangs ontwikkelde methode maakt gebruik van een medische draad matiemaatschappij met anti-epitheliale cel adhesie molecuul (EpCAM) antilichamen voor in vivo isolatie van circulerende tumor cellen (CTCs)1. Een patiënt-matched cohort in niet-gemetastaseerde prostaatkanker bleek dat de isolatie in vivo techniek in een hoger percentage van de patiënten positief voor CTCs evenals hogere CTC graven ten opzichte van de huidige gouden standaard in CTC-opsomming resulteerde. Als cellen niet kunnen worden teruggevorderd van de huidige medische hulpmiddelen, werd een nieuwe functionalized draad (hierna: apparaat) vervaardigd waardoor vastleggen en latere detachement van cellen door enzymatische behandeling. Cellen kunnen hechten aan het apparaat, gevisualiseerd op een microscoop en vrijstaand met behulp van enzymatische behandeling. Herstelde cellen zijn cytocentrifuged in membraan beklede dia's en afzonderlijk geoogst door middel van laser microdissection of micromanipulation. Eencellige monsters worden vervolgens onderworpen aan het hele genoom eencellige versterking waardoor meerdere stroomafwaartse analyse, met inbegrip van screening en doelgroepen gerichte benaderingen. De procedure voor isolatie en herstel levert hoge kwaliteit DNA van afzonderlijke cellen en latere hele genoom versterking (WGA) niet wordt aangetast. Een eencellige versterkte DNA kan worden doorgestuurd naar screening en/of gerichte analyse zoals matrix vergelijkende genoom hybridisatie (matrix-CGH) of volgorde. Het apparaat kan ex vivo isolatie van kunstmatige zeldzame celsteekproeven (d.w.z. 500 doelcellen spiked in 5 mL van perifeer bloed). Overwegende dat detachement tarieven van cellen zijn aanvaardbaar (50-90%), de opbrengst van vrijstaande cellen in dia's omvat een breed scala afhankelijk van de cellijn gebruikt (< 10 - > 50%) en sommige verdere aandacht nodig heeft. Dit apparaat is niet uitgeschakeld voor het gebruik bij patiënten.

Cellen na CFSE en stikstofbase kleuring kunnen worden geëvalueerd met behulp van een Microscoop van de immunofluorescentie uitgerust met filters voor DAPI en FITC. Kernen presenteren met een heldere counterstain in de DAPI kanaal terwijl het cytoplasma van de cellen Toon uniforme etikettering met CFSE met heterogene Inter cel intensiteit (figuur 2A en 2E). Soortgelijke vorm en kleuring intensiteiten zijn van cellen die zijn gekoppeld aan de draad (figuur 2B en 2F) verwacht evenals losgekoppeld van de draad en hersteld op een dia (figuur 2D en 2 H).
Hoge cel dichtheden (b.v. > 1 000 000 cellen/mL) kan leiden tot totale dekking van de draad met cellen tijdens het opladen van de draden. Echter lager cel dichtheden, veranderingen in de rotatiesnelheid tijdens de incubatie en het gebruik van verschillende cellijnen invloed op de efficiëntie van isolatie en moeten afzonderlijk worden getest. Wanneer de draden werden geïncubeerd met 5 mL van de HT-29 cellen bij 100 000 cellen / mL als beschreven in punt 2.1., een gemiddelde van 254 ± 103 cellen (n = 5) werden vastgelegd op de draden. Experimenteren met de zelfde LNCaP cuvetten, een gemiddelde van 440 ± 319 cellen (n = 5) per draad was verkregen.
Presentatie van de cellen in de 500, 5 000 en 50 000 de HT-29 op een achtergrond van 5 mL van perifeer bloed aan draden (volgens protocol punt 2.2.) resulteerde in de verovering van 75 ± 18 cellen, 25 ± 9 cellen en 47 ± 57 cellen (n = 3, elk), respectievelijk. Als de draad is belast met 15 µL celsuspensie (1 000 000 cellen/mL) volgens het protocol in punt 2.3., maximaal 1 000 personen (HT-29) cellen kunnen hechten aan een draad.
Cel detachement efficiëntie varieerden van 81% in HT-29 cellen (variëren 54,9% - 93,2%, en n = 5) naar 81% (variëren van 63.51-92.87%, n = 6) en 91% (assortiment 84,7% - 95,3%, n = 6) in LNCaP en VCaP cellen, respectievelijk. Ook het herstel van vrijstaande cellen verschilt tussen cellijnen: een gemiddelde van 28% van de vrijstaande HT-29 cellen werden teruggevonden door cytocentrifugation. Overwegende dat de opbrengst voor LNCaP lager dan 10% was, was de gemiddelde terugvinding voor VCaP cellen 55%.
Ongeveer 75% van de afzonderlijke cellen onderworpen aan producten van de WGA van hoge kwaliteit van de opbrengst van WGA: dit is 1) uitstrijkje van WGA producten variërend van 0.1 tot > 1 kb (Figuur 4, bovenste paneel) en 2) drie of vier bands in de 4plex-kwaliteit controle PCR (Figuur 4, onderste paneel) . WGA producten gebruikt kunnen worden voor 1) matrix-CGH profilering voldoen aan de kwaliteitscriteria voor 6,7 van de profielen van de eencellige matrix-CGH en 2) gerichte NGS na opnieuw versterking WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figuur 1: Workflow bij het opsporen en herstellen van doelcellen eencellige p.a.. (A) cellen worden gekweekt tot 90% confluentie en (B) geoogst om te verkrijgen van een eencellige schorsing. Na kleuring met CFSE en een stikstofbase vlek, (C) de functionalized draad is geïncubeerd in aanwezigheid van de cellen in een volume van 5 mL met behulp van reactie buizen of in een laag volume met behulp van een Pasteur pipette uiteinde. Deze laatste voorziet in toepassing van cel schorsing volumes zo laag als 15 µL. (D) cellen moeten worden losgemaakt binnen 4 uur na het opladen. Dus de draad in een 1,5 mL reactiebuis gevuld met release buffer geplaatst. Na 15 minuten incubatie op een rocker en 10 min centrifugeren, de draad wordt verwijderd en de celsuspensie gecentrifugeerd om de pellet van de cellen. (E) hersteld cellen zijn ofwel overgebracht naar een glasplaatje voor eencellige micromanipulation (boven) of cytocentrifuged op een membraan beklede dia en doorgestuurd om laser microdissection (onder). (F) ten slotte geoogste afzonderlijke cellen worden versterkt door middel van versterking van de hele genoom (WGA). WGA producten zijn compatibel met matrix-CGH en gerichte NGS downstream analyse. EpCAM epitoop: groene cirkel op het celoppervlak. Matiemaatschappij draad: apparaat, grijze triple-helix draden. Polymer: paarse lijnen. Anti-EpCAM antilichamen: oranje. Vrijgeven van buffer activiteit: rode pijl. Vet marker aan celsuspensie op zijn plaats houden: donker blauwe ellips. Celsuspensie hersteld: lichtblauw. Capillaire voor micromanipulation: zwarte lijn. Vergroting: herstelde cel geoogst door micromanipulation, cytospin op het membraan bedekte Schuif met herstelde cellen (grijs opgevulde ovaal). Vergroting: herstelde cel wordt laser microdissected (grijs cirkelvormige lijn: membraan van membraan dia serveren als backbone voor laser microdissection), objectieve met laserstraal (blauwe lijn naderen de membraan dia uit de onderstaande lijst). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figuur 2: visualiseren van gelabelde cellen. (A, E) Cellen voordat het opladen: cellen zijn voorzien van CFSE en counterstained met een DNA intercalating kleurstof toont de signaalsterkte van een bereik van CFSE (groen). (B,F) Gelabelde cellen gevangen op de draad. (C,G) Draad na mobiele-detachement procedure. (D,H) Cellen los van draad en door de cytocentrifugation op een dia hersteld. CFSE: FITC kanaal (groen). DNA vlek: DAPI kanaal (blauw). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figuur 3: draad en opslag compartiment. (A) compartimenten van de draad. (B) Detail van het functionalized deel. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figuur 4: kwaliteitscontrole van WGA producten verkregen uit één micromanipulated cellen. BOVENPANEEL: WGA producten verkregen uit afzonderlijke cellen meestal resultaat in DNA uitstrijkjes variërend van 0.2 kb tot > 1.0 kb met een intensiteit van de piek bij ongeveer 0,5 kb. Monsters nummer 1, 7 en 13 (aangegeven met een sterretje) Toon suboptimaal of geen DNA uitstrijkjes. Onderste paneel: WGA producten van voldoende kwaliteit zijn als de 4plex PCR resulteert in drie of vier van vier PCR producten (op 100, 200, 300 en 400 bp). Monsters 1, 7, 10 en 13 Toon minder dan drie bands en zouden worden uitgesloten van verdere analyse. Lane M bevat een 100 bp ladder en sterretjes geven de monsters van onvoldoende kwaliteit van de producten van de WGA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer volgorde</td>
			<td>OPMERKING</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '</td>
			<td>100 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 '</td>
			<td>100 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tgg agc gag gct agc-3 '</td>
			<td>200 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 '</td>
			<td>200 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3 '</td>
			<td>300 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-tcc wet aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>300 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc kat gcc atc handelen gc-3 '</td>
			<td>400 bp voorwaartse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gct tga caa agt ggt cgt GS-3 '</td>
			<td>400 bp omgekeerde primer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primer sequenties voor de controle van de kwaliteit van de 4plex PCR

Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho Stroom Cytometry met fluorescerende cel Barcoding voor eencellige signalering analyse en ontdekking van Biomarker

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subcultuur en cryopreservatie van oesofageaal adenocarcinoom organoïden: voor- en nadelen voor eencellige spijsvertering

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrische tumor organoïde drug screening met behulp van Widefield Live-Cell Imaging voor bulk en single-organoïde analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...