Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי האוסטרי המדע קרן (FWF), פרויקט-. לא. אני 1220-B19 (ל. נ) במסגרת הפרויקט ERANET ב Translational סרטן מחקר (TRANSCAN) "Circulating גידול התאים כמו סמן עבור מחלה שיורית מינימלית בסרטן הערמונית (CTC-סריקה)". דוקטורנטית ספורטינג הוכשר בתוך המסגרת של תוכנית דוקטורט הרפואה מולקולרית של האוניברסיטה הרפואית של גראץ. המחברים להכיר בהכרת תודה נינה Schlögl, דניאל קומר, גבי Wendt, קלאודיה Chudak, ג'וליה שולץ ו ג'ואנה שילר לסיוע טכני מומחה שלהם. המחברים מודים גיאורג Peinhaupt על עיצוב גרפי תמיכה.

<ol>
	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells.">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li><li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients.">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li><li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples.">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li><li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA.">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li><li>M&#246;hlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH.">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+Release:+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire.">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck.">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li><li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer.">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li><li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer.">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection.">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li><li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer.">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li><li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma.">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells.">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li><li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting.">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622 (2017).</li><li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells:+a+clinical+case+study.">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li><li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer.">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322 (2016).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM.">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells.">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR.">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification.">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li><li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., St&#229;hlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification.">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).</li><li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Challenges+of+Liquid+Biopsies.">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+technologies.">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר שמטרתה אחזור תאים חוט functionalized (המכונה התקן) עבור ex-vivo תא בודד אנליזה גנומית. בדקנו שלוש שורות תאים EpCAM-חיוביות (HT-29, LNCaP ו VCaP), אבל באופן עקרוני, ניתן ליישם שיטה זו כל שורת התאים לבטא EpCAM. התאים היעד EpCAM-חיוביים ניתן להציג על המכשיר כמו השעיה תא טהור (ראה 2.1). או מעורבות לתוך עודף של תאים הרקע (למשל. היקפי דם, רואה 2.2.). ואילו במיוחד האחרון עשוי לשמש כדי לבדוק את קיבולות בבידוד בתנאים נדירים תא, כוונון עדין של מספר התאים מחובר הכבל יכול להיעשות באמצעות מצומצמות תיאר את הגישה (ראה 2.3.). כמו ההבדלים בין שורות תאים הם צפוי, צפיפויות תא מתאים לטעינה הכבל, סיבוב מהירות כמו גם זמן הדגירה צריך להיבדק מדעית המעריכה את מספר התאים המחוברים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.
עבור יישומי הזרם גנומית ברמת תא בודד WGA, נדרש. לשיטת הבחירה WGA עשויים להשתנות בין המעבדות ופתוחה, בעקרון, השיטה שלנו על כל אמצעי ממה יכולה להתמודד דגימות המתקבל microdissection חוץ-גופית או לייזר. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים בשיטה המבוססת על ה-DNA enzymatically מפוצלים בשל ביצועים טובים יותר לעומת WGA קיטוע-חום המבוסס על7. תאים אופציונלית, יחיד ניתן להעביר אותה WGA איזותרמי ומאפשר DNA עוקבות פרופיל20,21.
הפרוטוקול המתואר שמטרתה מתאושש תאים ללא פגע לאחר להיות מחוברים דור חדש של חוטים functionalized לניתוח תא בודד גנומית. הדור הראשון של חוטים functionalized, גם לייצג את ההתקנים העשרה רק אישור CE ויוו בשוק עד כה, שימשו לספירת CTCs בחולי סרטן גרורות. פרסומים קודמים ונתונים שלנו להציע את הטכניקה בידוד ויוו להיות רגישים בהשוואה את הטכנולוגיה הנוכחית תקן זהב2. לפיכך, מצייד ויוו בידוד טכניקה זו עם תכונת שחזור כפי הבנתי את ההתקן מאפשר שילוב של שחזור CTC גבוהה עם אפיון ברמת תא בודד.
אולם, המכשיר אינה נמחקת לשימוש בחולים, לפיכך, נתונים קליניים אינם זמינים. Ex-vivo יישומים (דהיינו בידוד CTCs מדם היקפי לאחר דגימה) אינם מומלצים כמו הטכנולוגיה היא להתאים הגדרות נוכח cubital שחצן, למשל נמוך הקוטר של שחצן (הגדלת ההסתברות קשר בין CTCs לבין נוגדנים תופסת ישיר), זמן ארוך השמירה (30 דקות, המאפשר L 2-3 של דם להעביר את החוט). עם זאת, כמתואר בסעיף 2.2. התאים היעד יכול להיות גם מבודד דגימות מעורבת7.
מגבלה הנוכחי של השיטה היא התאוששות לא יעיל של תאים מבולבל לאחר ניתוק חוטי החשמל. זה, עם זאת, אולי ניתן לשפר על ידי צעד קיבוע תא לפני הטיפול ניתוק.
לסיכום, פרוטוקול זה הוא צעד ראשון לקראת השימוש בשילוב של שיטת בידוד ויוו עם תא השחזור עבור גנטית איפיון תאים בודדים. מאמצים נוספים צריכה לטפל אופטימיזציה של שחזור התא, סיווג עבור היישום שלה חולים1,2. עם זאת, רפואה אישית להחלטות ניטור וטיפול טיפול חורג ספירה של CTCs. לפיכך, שיטה זו היא צעד ראשון לקראת גנומית CTC אפיון ברמת תא בודד.
יישומים לקראת ניתוח transcriptome תא בודד נראה ריאלי כמו תאים שלמים נקצרים. עם זאת, הוא נשאר לפנות לבדיקה אם ההליך בגמילה יש השפעה על תקינות RNA (למשל העברת תאים בודדים התאושש כדי פירוק ישיר ולאחריו RT-qPCR22). אם מצליחים, אפיון של תאים בודדים (למשל CTCs) יכול להיות מוזז לשלב transcriptome, המאפשר ניתוח מפורט יותר. בהקשר זה, ה-RNA-seq שימוש חכם-seq2 מספק כלי חשוב לניתוח במורד הזרם RNA של תאים בודדים כמו cDNA preamplified (שהתקבל במהלך ההכנה ספריית ה-RNA-seq) יכולה להיות נתונה ל- PCR כמותי. זה יאפשר היעד משולב עם ניתוח המבוסס על הקרנה של תאים בודדים התאושש22,23.
החוטים functionalized הנוכחי מבוססים על נוגדנים anti-EpCAM אשר מהווה סמן אפיתל בשימוש נרחב לבחירה חיובי של CTCs24. כפי CTCs מספר עשוי downregulate אפיתל סמנים כגון cytokeratins או EpCAM25, הוספת נוגדנים כגון HER2/ש להגדיל את הסיכוי של CTC בידוד. מספר נוגדן מבוסס העשרה יש אסטרטגיות פותחה, נבדקו על ידי פריירה ואח. 201626. תערובת של נוגדנים ותשמרו על חוט יכול להיות שיפור עתידי של הטכנולוגיה המוביל את ניתוקה של מספר גבוה יותר של תת נוספים CTCs.
. זה חובה על כל השלבים הכרוכים חוט בטיפול כדי לשמור את החלק פונקציונלי של החוט שקועים פתרון על מנת לשמור על הפונקציונליות שלו. אנו ממליצים למקם את החוט ב- 1 x PBS במהלך ההערכה (מיקרוסקופ; למשל-צעדים 3.1. -3.3.) אחסון... כדי למנוע כתמים בלתי הולם, אנו ממליצים על שימוש טרי שהוכן מכתימים פתרון בשלבים 1.2.1. 1.2.2. התאים בחולשה מוכתם ה"בלתי תא סומכים את החוט, עלול להוביל underestimation של התאים המצורפת.
זה הכרחי למנוע חיבור על פיפטה פסטר עם הכיפה גומי בעת הוספת את החוט פיפטה פסטר לטעינה עוקבות של התליה תא (שלב 2.3.4.). הכיפה גומי משמש כדי להחזיק את החוט במקום כך החלק פונקציונלי-שוכן בקצה פיפטה פסטר. אם הכיפה מחוברת גם בחוזקה על חלקו האחורי של פיפטה פסטר, העמסה של התליה תא אינה אפשרית. במקרה זה, להקל את הכובע כך האוויר אשר נמצא שנעקרו על ידי התליה תא טעון יכולים להשאיר את פיפטה.
לכופף את החוט חיונית ומגמתו במהלך תא ספירת צעדים 3.2. 3.3. לטעון את הרשת בעזרת סרט דביק על כך שאינם פונקציונליים סוף החוט מגיע לשקר לצד אחד. לאחר סריקה של כל אורכו של החלק פונקציונלי, החוט הוא התגלגל 180° אז ניתן לסרוק את החצי השני של החוט פונקציונלי. שלב זה חשוב עבור הניסויים הראשוניים להעריך את מספר התאים על החבל. ברגע מוערך מספר התאים עבור שורת התאים ו הליך מסוים, שיכול לחזור ההליך מבלי לספור תאים (למשל. בדיקת נוכחות של תאים או השמטת שלב זה בלבד). Pipetting זהיר הוא חיוני כדי למנוע איבוד תאים בעת הורדת כמות תגובת שיקוע בשלב 4.8. ודא pipetting מתבצע בצורה חלקה מבלי לגרום turbulences לכדור בגדר.

לאחרונה, נוספו CellCollector DC01, חוט רפואי functionalized עם נוגדנים anti-EpCAM לבידוד CTCs מדם היקפי של חולי סרטן, הספקטרום שיטתי של CTC ספירה1,2,3 . במחקר כרגע מתמשך ללא גרורות סרטן הערמונית, החוט functionalized הזה מדווח כמעט כפליים למטופלים. להיות CTC-חיוביות וסופרת CTC גבוה יותר בחולים CTC-חיוביות לעומת CellSearch, תקן הזהב ב ספירת CTC3 . במופע זה מעודד, בידוד של תאים מן חוט רפואי functionalized לניתוח תא בודד יהיה רצוי, אלא טיפול אנזימטי עם פתרונות ניתוק התא (למשל טריפסין) ולא לייזר microdissection לא מאפשר ההתאוששות של תאים שלמים (נתונים לא מוצג).
כדי לאפשר התנתקות של התאים שנתפסו, דור חדש של חוטים functionalized היה מצויד פולימר ספציפיים. זה פולימר, המקשר בין הנוגדנים לכידת לכבל, היא חשופה טיפול מאגר שחרור המאפשר ניתוק של תאים שלמים (CellCollector DC03 המכונה התקן). המכשיר החדש functionalized, מאפשר בידוד תאי היעד של ריכוזים שונים של תאים סרטניים קו תא קפץ לתוך אלבומין שור (BSA) / buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ודם היקפי, בהתאמה.
על מנת להקל על זיהוי חזותי של תאים על המכשיר, לאחר התאוששות התאים הסרטניים היעד מלווים בלוחיות אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), כתם DNA לפני הטיפול בגמילה (כלומר-טעינה וניתוק). הטיפול השפעות על איכות ה-DNA של תאים בודדים בעבר הוערכו לאחר WGA באמצעות בקרת איכות PCR4,5,6,מערך-CGH7 , ממוקד רצף7 מציג שום הבדל לעומת תאים שאינם מטופלים micromanipulated תא המתלים7. היתרון של שיטה זו נעוץ השילוב של העשרה קדם תא היעד נדיר ושחזור של תאים לניתוח במורד הזרם תא בודד (איור 1). מתויג CE ויוו אוסף התקן הנוכחי משמשת בדרך כלל עבור ספירה של CTCs ולא על אפיון מולקולרי בתא יחיד2,8. עם זאת, ניתוח מקיף יותר לחקור הטרוגניות בין CTCs זמן לניתוח ברמה תא בודד (כלומר ממוקד רצף ברמת תא בודד). שיטות אחרות מבוססת תא מבוססים על בידוד immunomagnetic של CTCs EpCAM-חיובית וטיפול תא בודד בהתבסס על dielectrophoresis לאחר מכן ניתוח גנטי מולקולרי9,10. אפיון מולקולרי של CTCs דרישה חשוב ליישום שימושי שלהם בסביבה קלינית והוא לא פחות חשוב במחקר בסיסי של המפל גרורתי. במקביל CTCs, הגידול במחזור ה-DNA (ctDNA) הפך חשיבות רבה, שכן היא מאפשרת ניתוח הדנ א את נטל הגידול עם בידוד טכנית מינימלית הליכים11,12. הגישות תא מבוסס עשוי לשרת כתרומה משלימים שכן היא מאפשרת רנ א13,14 , חלבון15 ביטוי ניתוח, גם עבור CTC נגזר תא תרבויות או xenografts16, 17. למרות מכשולים כגון שחזור תא נמוך, אישור לשימוש בחולים עדיין צריך להתגבר, בשיטת תפוס ושחרר לוקח צעד הבא חשוב לקראת אפיון של התאים היעד נדיר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

התאים היעד נדירים ניתן לבודד מרקע גבוהה של תאים שאינם-יעד באמצעות נוגדנים ספציפיים חלבונים פני השטח של תאי היעד. שיטה שפותחה לאחרונה משתמשת חוט רפואי functionalized עם תאים אפיתל אנטי אדהזיה מולקולה (EpCAM) נוגדנים ויוו בידוד של מחזורי גידול תאים (CTCs)1. עמית מתאימים חולה בסרטן הערמונית ללא גרורות הראה כי הטכניקה בידוד ויוו , גרמו אחוז גבוה יותר של חולים חיובית CTCs, כמו גם ספירת CTC גבוה יותר לעומת תקן הזהב הנוכחי ב CTC ספירה. כמו תאים לא ניתן לשחזר ממכשירים רפואיים הנוכחי, חוט functionalized חדש (המכונה התקן) יוצר ומאפשר לכידת ולהתנתקות עוקבות של תאים על ידי טיפול אנזימטי. תאים רשאים לצרף המכשיר, דמיינו על המיקרוסקופ, מנותק באמצעות טיפול אנזימטי. תאים התאושש cytocentrifuged על גבי שקופיות מצופה קרום, שנקטפו בנפרד באמצעות לייזר microdissection או חוץ-גופית. דוגמאות תא בודד אז ותוחלת הגברה הגנום כולו בתא יחיד המאפשר ניתוח במורד הזרם מרובים כולל גישות הקרנת במטרה. ההליך של בידוד ושחזור התשואות באיכות גבוהה ה-DNA של תאים בודדים, אינו פוגע הגברה הגנום כולו עוקבות (WGA). ה-DNA של תא בודד מוגבר ניתן להעביר אותה ההקרנה ו/או ממוקד ניתוח כמו הכלאה הגנום השוואתי מערך (מערך-CGH) או רצף. המכשיר מאפשר שמחוץ בידוד מדגימות תא נדיר מלאכותיים (כלומר 500 התאים היעד קפץ לתוך 5 מ של דם היקפיים). ואילו שיעורי ניתוק של תאים הם מקובלים (50-90%), קצב התאוששות התאים מנותקים על גבי שקופיות משתרע על פני התלויים על הקו תא בשימוש מגוון רחב (< 10 - > 50%) צריך קצת תשומת לב נוספת. התקן זה אינה נמחקת לשימוש בחולים.

תאים לאחר CFSE מכתים nucleic שניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence מצויד מסננים עבור דאפי, FITC. הגרעינים להציג counterstain בהיר בערוץ דאפי ואילו הציטופלסמה מהתאים הצג תוויות אחיד עם CFSE בעוצמה הבין-תאית הטרוגנית (איור 2 א ו 2E). צורה דומה, צביעת עוצמות צפוי מתאי מחובר הכבל (איור 2B ו- 2F) כמו גם מנותק מן החוט, התאושש בשקופית (איור 2D ו- 2 H).
צפיפות גבוהה התא (למשל > תאים 1 000 000/mL) עלול לגרום לסיקור של הכבל עם תאים כאשר הטעינה את החוטים. עם זאת, להוריד את צפיפויות תא, שינויים במהירות סיבוב במהלך הדגירה, ושימוש של שורות תאים שונים משפיעים על יעילות הבידוד, צריך להיבדק בנפרד. מתי החוטים היו מודגרות 5 מ של תאים HT-29-100 000 תאים / מ ל כפי שמתואר בסעיף 2.1., ממוצע של תאים ± 103 254 (n = 5) נתפסו על החוטים. עם אותם ניסויים באמצעות תאים LNCaP, ממוצע של תאים ± 319 440 (n = 5) לכל חוט הושג.
הצגת תאים HT-29 500 5 000, לא 50000 רקע של 5 מ"ל של דם היקפיים חוטים (על פי פרוטוקול סעיף 2.2.), גרמו לכידתו של תאים ± 18 75, 25 ± 9 תאים ותאים ± 57 47 (n = 3, כל אחד), בהתאמה. אם הכבל מואשם µL 15 תא השעיה (תאים 1 000 000/mL) לפי הפרוטוקול בסעיף 2.3., עד 1 000 (HT-29) תאים עשוי לחבר חוט.
תא היעילות ניתוק נע בין 81% בתאים HT-29 (טווח 54.9% 93.2% ו- n = 5) ל- 81% (טווח 63.51% 92.87%, n = 6) ו- 91% (טווח 84.7% 95.3% n = 6) LNCaP בולטים VCaP תאים, בהתאמה. באופן דומה, ההתאוששות של תאים מנותקת שונה בין שורות תאים: ממוצע של 28% של תאים HT-29 מנותקת ששוחזרו על ידי cytocentrifugation. ואילו קצב ההחלמה LNCaP היה נמוך יותר מ-10%, שיעור ההחלמה הממוצע עבור תאים VCaP היה 55%.
כ- 75% של תאים בודדים נתון WGA תשואה באיכות גבוהה WGA מוצרים: 1) השמצות של WGA מוצרים ועד 0.1 > 1 kb (איור 4, החלונית העליונה), 2) ושלוש או ארבע להקות איכות 4plex לשלוט PCR (איור 4, החלונית התחתונה) . WGA המוצרים יכולים לשמש עבור 1) מערך-CGH פרופיל להכיר את הקריטריונים איכות עבור מערך בתא יחיד-CGH פרופילים 6,7 ו- 2) יישוב המיתרים לאחר הגברה מחדש WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> איור 1: זרימת עבודה עבור לבודד ולשחזר התאים היעד לניתוח החד-תאיים. (א) תאים מתורבתים עד 90% confluency וקצרו (B) כדי לקבל השעיה תא בודד. לאחר צביעת עם CFSE, הכתם nucleic, (ג) את החוט functionalized מודגרת בנוכחות תאי נפח של 5 מ"ל באמצעות צינורות התגובה או באמצעי אחסון נמוך באמצעות טיפ פיפטה פסטר. האחרון מאפשר יישום של התא המתלים כרכים נמוך כמו 15 µL. תאים (D) צריך להיות מנותק תוך 4 שעות לאחר הטעינה. לכן, החוט ימוקם צינור התגובה 1.5 mL מלא עם שחרור מאגר. לאחר 15 דקות דגירה נדנדה ו 10 דקות צנטריפוגה, החוט יוסר ולא התליה תא הוא centrifuged כדי הצניפה התאים. (ה) משוחזר תאים או הועבר שקופית זכוכית תא בודד המיקרומניפולציה (למעלה) או cytocentrifuged לשקופית מצופה קרום, מועבר לייזר microdissection (למטה). (נ) בסופו של דבר, שנקטפו תאים בודדים הם מוגבר באמצעות הגברה הגנום כולו (WGA). WGA מוצרים תואמים מערך-CGH וניתוח ממוקד המיתרים במורד הזרם. EpCAM epitope: עיגול ירוק על פני השטח של התא. Functionalized חוט: מכשיר, חוטים משולש-הסליל אפור. פולימרים: קווים סגולים. נוגדנים אנטי-EpCAM: כתום. לשחרר את פעילות המאגר: חץ אדום. גריז סמן כדי להחזיק תא ההשעיה במקום: אליפסה כחולה כהה. התאושש תא ההשעיה: תכלת. נימי עבור המיקרומניפולציה: שחור קו. הגדלה: תא התאושש לקצור ידי חוץ-גופית, cytospin על מכוסה קרום השקופית המכילה תאים התאושש (אליפסה ממולאת אפור). הגדלה: להיות התאושש תא לייזר microdissected (גריי קו מעגלי: ממברנה משקופית ממברנה הגשה המרכזי (backbone) עבור microdissection לייזר), אובייקטיבי עם קרן לייזר (קו כחול מתקרבת השקופית הממברנה מלמטה). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> איור 2: להמחיש תאים עם תוויות ברורות. (A, E) התאים לפני טעינה: תאים בלוחיות הסבר CFSE, counterstained עם ה-DNA intercalating צבע מציג עוצמת האות של טווח של CFSE (ירוק). (B,F) תאים עם תוויות ברורות שנתפסו על החוט. (C,G) תיל לאחר הליך ניתוק התא. (יח,ח) התאים מנותקים תיל, התאושש על ידי cytocentrifugation לשקופית. CFSE: ערוץ FITC (ירוק). כתם DNA: ערוץ דאפי (כחול). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> איור 3: האזנה ואחסון תא. (א) תאים של החוט. פרט (B) של ה-functionalized. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> איור 4: בקרת איכות של מוצרים WGA מתקבל מתאי יחיד micromanipulated. הדף פאנל: מוצרים WGA המתקבל תאים בודדים בדרך כלל התוצאה ב- DNA מכפיש החל 0.2 kb > 1.0 kb בעוצמה שיא-סביב 0.5 ק ב. דוגמאות מספר 1, 7, 13 (מסומן בכוכביות) להראות שיוצרת או אין דנ א מטושטש. פאנל התחתונה: WGA המוצרים הם באיכות מספקת אם PCR 4plex התשואות שלושה או ארבעה ארבעה מוצרים PCR (ב- 100, 200, 300, 400 bp). 1, 7, 10 ו 13 להראות פחות משלוש הלהקות ודוגמאות לא ייכללו ניתוח נוסף. ליין M מכיל סולם bp 100 ומציינים כוכביות הדגימות איכות המוצר לא מספיק של WGA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פריימר רצף</td>
			<td>הערה</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-gtt המרכז לאמנות עכשווית אתא tga ttc cac cc-3′</td>
			<td>bp 100 פריימר לפנים</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-ctc ctg גה גת ggt גת gg-3′</td>
			<td>bp 100 פריימר הפוכה</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-קנאה tgg agc מחסום פה gct agc-3′</td>
			<td>פריימר לפנים 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-ttt tgc ggt לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה aat gtc ct-3′</td>
			<td>200 bp פריימר הפוכה</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-קנאה tga gac att ctt gct gg-3′</td>
			<td>bp 300 פריימר לפנים</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-tcc מעשה aac חטיבתי tca gcg tc-3′</td>
			<td>bp 300 פריימר הפוכה</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-aca gtc החתול gcc atc מעשה gc-3′</td>
			<td>400 bp פריימר לפנים</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונקות-gct tga לפנות לסוכנות של agt ggt מס רווחי הון tg-3′</td>
			<td>400 bp פריימר הפוכה</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: רצפים פריימר לבקרת איכות 4plex PCR

Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

תת-תרבות ושימור בהקפאה של אורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט: יתרונות וחסרונות לעיכול תאים בודדים

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...