Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato il fondo austriaco per scienza (FWF), progetto-no. Ho 1220-B19 (al P.S.) come parte del progetto ERANET in Translational Cancer Research (TRANSCAN) "Cellule tumorali di circolazione come biomarcatore per malattia minima residua nel cancro della prostata (CTC-SCAN)". PH.d. candidate S.C. è stata addestrata all'interno della cornice della medicina molecolare programma PhD dell'Università medica di Graz. Gli autori riconoscono con gratitudine Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz e Johanna Schiller per la loro assistenza tecnica. Gli autori ringraziano Georg Peinhaupt per il supporto di progettazione grafica.

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R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Challenges+of+Liquid+Biopsies.">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Ferreira, M. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto mira al recupero di cellule da un filo funzionalizzato (denominato dispositivo) per ex vivo l'analisi genomica unicellulare. Abbiamo testato tre linee cellulari EpCAM-positivi (HT-29, LNCaP e VCaP), ma in linea di principio, questo metodo può essere applicato a qualsiasi linea cellulare che esprime EpCAM. Cellule bersaglio EpCAM-positivi possono essere presentate al dispositivo come sospensione cellulare puro (Vedi 2.1.) o misto in un surplus di cellule della priorità bassa (ad es. periferico del sangue, vedere 2.2.). Considerando che soprattutto quest'ultimo potrebbe essere utilizzato per testare le capacità di isolamento in condizioni di rara delle cellule, la messa a punto del numero delle cellule allegate al filo può essere fatto utilizzando il basso volume descritto approccio (Vedi punto 2.3.). Differenze tra linee cellulari sono da attendersi, densità delle cellule adatto per la ricarica il filo, rotazione velocità così come tempo di incubazione devono essere testati empiricamente valutando il numero di cellule allegate utilizzando un microscopio di immunofluorescenza.
Per applicazioni a valle genomiche a livello di singola cellula WGA, è richiesto. Il metodo WGA di scelta può variare tra i laboratori e, in linea di principio, il nostro metodo è aperto a tutti i metodi che può gestire campioni ottenuti da micromanipolazione o laser microdissection. In questo protocollo, utilizziamo un metodo basato sul DNA enzimaticamente frammentato a causa di una migliore performance rispetto ad un calore-frammentazione basato WGA7. Opzionale, singole cellule possono essere inoltrate ad isotermico WGA permettendo successivo DNA profiling20,21.
Il protocollo descritto mira al recupero di cellule intatte dopo essere stato collegato a una nuova generazione di fili funzionalizzati per l'analisi genomica di cella singola. La prima generazione di fili funzionalizzati, che rappresentano anche i dispositivi di arricchimento solo CE-approvato in vivo sul mercato finora, sono stata utilizzata per l'enumerazione CTCs in malati di cancro metastatizzato. Precedenti pubblicazioni e i nostri dati suggeriscono la tecnica di isolamento in vivo per essere più sensibile rispetto all'attuale tecnologia gold standard2. Quindi, dotare questa tecnica di isolamento in vivo con una funzionalità di ripristino come realizzato nel dispositivo permette che unisce alto recupero CTC con caratterizzazione a livello di singola cellula.
Tuttavia, il dispositivo non viene cancellato per l'uso in pazienti, quindi, non sono disponibili dati clinici. Applicazioni ex vivo (cioè isolare CTCs da sangue periferico dopo il campionamento) non sono raccomandati come la tecnologia si adatta le impostazioni presenti nel cubitale invano, ad es. basso diametro della vana (aumentando la probabilità di contatto diretto tra CTCs e cattura gli anticorpi) e tempo di lunga conservazione (30 min, consentendo di 2-3 L di sangue per far passare il filo). Tuttavia, come indicato nella sezione 2.2. cellule bersaglio possono anche essere isolate da campioni misti7.
Una limitazione di corrente del metodo è il recupero inefficiente delle cellule non fissati dopo distacco dai fili. Questo, tuttavia, potrebbe essere migliorata da una fase di fissazione delle cellule prima del trattamento di distacco.
In sintesi, questo protocollo è un primo passo verso l'uso combinato di una tecnica di isolamento in vivo con recupero delle cellule per caratterizzare geneticamente le cellule singole. Bisogno di ulteriori sforzi affrontare l'ottimizzazione del recupero delle cellule e liquidazione per la sua applicazione in pazienti1,2. Tuttavia, la medicina personalizzata per le decisioni di trattamento, monitoraggio e terapia esula enumerazione di CTCs. Pertanto, questo metodo è un primo passo verso la caratterizzazione genomica di CTC a livello di singola cellula.
Le applicazioni verso l'analisi del trascrittoma di singola cellula sembrano attuabile come vengono raccolte le cellule intatte. Tuttavia, resta da valutare se la procedura di recupero ha un impatto sull'integrità di RNA (es. inoltro recuperati celluli alla lisi diretta seguita da RT-qPCR22). In caso di successo, caratterizzazione delle singole cellule (per esempio CTCs) può essere spostata al livello del trascrittoma, consentendo un'analisi più dettagliata. A questo proposito, RNA-seq utilizzando Smart-seq2 fornisce un prezioso strumento per analisi a valle del RNA di singole cellule, come il cDNA preamplificato (ottenuto durante la preparazione della biblioteca di RNA-seq) possa essere sottoposti a PCR quantitativa. Questo vi permetterà una destinazione combinato e screening-base di analisi di singole cellule recuperate22,23.
I fili funzionalizzati attuali sono basati sugli anticorpi anti-EpCAM che è un marker epiteliale ampiamente utilizzato per la selezione positiva di CTCs24. Come diversi CTCs potrebbe downregulate marcatori epiteliali quali i cytokeratins o EpCAM25, l'aggiunta di anticorpi ad esempio HER2/new aumenterebbe la possibilità di isolamento CTC. Diversi anticorpo basato arricchimento strategie sviluppate e recensite da Ferreira et al. nel 201626. Una miscela di anticorpi immobilizzati su un filo potrebbe essere un miglioramento futuro della tecnologia che porta all'isolamento di un numero superiore e ulteriori sottotipi di CTCs.
È obbligatorio per tutti i passaggi che coinvolgono filo movimentazione per mantenere la parte funzionale del filo immerso in soluzione al fine di mantenere la sua funzionalità. Si consiglia di posizionare il filo in 1X PBS durante la valutazione (microscopio; ad es. punti 3.1. -3.3.) e deposito. Al fine di evitare macchie inappropriati, si consiglia di uso fresco preparato soluzione colorante nei passaggi 1.2.1. e 1.2.2. Cellule debolmente marcate ostacolano cella contando sul filo e possono condurre a sottovalutazione delle cellule collegate.
È necessario evitare di collegare la pipetta di Pasteur con il tappo di gomma quando si inserisce il filo nella pipetta Pasteur per caricamento successivo della sospensione delle cellule (passo 2.3.4.). Il tappo di gomma è usato per tenere il filo in posizione in modo che la parte funzionale è situata all'interno della punta della pipetta Pasteur. Se il tappo è fissato troppo saldamente alla parte posteriore della pipetta Pasteur, caricamento della sospensione delle cellule non è possibile. In questo caso, di facilitare il tappo tale che l'aria che si è spostata da una sospensione cellulare caricato può lasciare la pipetta.
Piegare il filo è cruciale per il suo orientamento durante la cella conteggio nei passaggi 3.2. e 3.3. Montare i fili utilizzando il nastro adesivo, tale che la fine non funzionali del filo arriva a mentire su un lato. Dopo la scansione dell'intera lunghezza della parte funzionale, il filo è rotolato 180° quindi l'altra metà del filo funzionale possa essere scansionata. Questo passaggio è importante per gli esperimenti iniziali valutare il numero di cellule in transito. Una volta che viene valutato il numero di celle per una certa linea cellulare e procedura, la procedura può essere ripetuta senza conta cellulare (ad es. solo il controllo per la presenza di cellule o omettere questo passaggio). Attenzione il pipettaggio è fondamentale per evitare la perdita delle cellule quando si riduce il volume del surnatante nel passaggio 4.8. Assicurarsi di pipettaggio è svolto senza intoppi senza causare turbolenze al pellet.

Recentemente, CellCollector DC01, un filo medico funzionalizzato con anticorpi anti-EpCAM per isolare CTCs da sangue periferico di pazienti di cancro, è stato aggiunto alla gamma metodico di CTC enumerazione1,2,3 . In uno studio attualmente in corso nel carcinoma della prostata non metastatico, questo filo funzionalizzato segnala quasi due volte altrettanti pazienti CTC-positivi e CTC superiore conta nei pazienti di CTC-positivi rispetto ai CellSearch, il gold standard nella enumerazione CTC3 . A causa di questa performance incoraggia, isolamento di cellule da un filo medica funzionalizzato per cella singola analisi sarebbe auspicabile, ma trattamento enzimatico con soluzioni di distacco delle cellule (ad es. tripsina) né microdissezione laser permette il recupero di cellule intatte (dati non mostrati).
Per consentire il distacco delle cellule catturati, una nuova generazione di fili funzionalizzati era dotata di un polimero specifico. Questo polimero, che collega gli anticorpi di cattura al filo, è suscettibile di un trattamento di buffer di rilascio che permette il distacco delle cellule intatte (CellCollector DC03 noto come dispositivo). Il nuovo dispositivo funzionalizzato, consente l'isolamento delle cellule bersaglio da varie concentrazioni delle cellule di linea delle cellule tumorali a spillo in albumina di siero bovino (BSA) / tampone fosfato salino (PBS) e nel sangue periferico, rispettivamente.
Per facilitare il riconoscimento visivo delle cellule sul dispositivo e dopo il recupero, le cellule tumorali bersaglio sono munite di carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) e una macchia di DNA prima del trattamento di recupero (cioè. ricarica e disconnessione). Effetti del trattamento sulla qualità di DNA di singole cellule precedentemente sono stati valutati dopo WGA tramite un controllo di qualità PCR4,5, array-CGH6,7 e mirati sequenziamento7 non risultati nessuna differenza rispetto a cellule non trattate micromanipulated da cella sospensioni7. Il vantaggio di questo metodo è la combinazione di pre-arricchimento rara cella di destinazione e il recupero delle cellule per l'analisi a valle di singola cellula (Figura 1). Il dispositivo di raccolta marchio CE in vivo corrente è generalmente utilizzato per l'enumerazione di CTCs, piuttosto che per la caratterizzazione molecolare di cella singola2,8. Tuttavia, analisi più completa per indagare eterogeneità tra CTCs lungo per analisi a livello di singola cellula (cioè mirati sequenzializzate a livello di singola cellula). Altri metodi basati su cellule si basano sull'isolamento immunomagnetica di CTCs EpCAM-positivi e cella singola gestione basata sulla dielettroforesi per successive analisi genetica molecolare9,10. Caratterizzazione molecolare di CTCs è un requisito importante per la loro attuazione utili in una regolazione clinica ed è altrettanto importante nella ricerca di base della cascata metastatica. In parallelo CTCs, circolanti tumore DNA (ctDNA) è diventato di grande importanza in quanto permette l'analisi del DNA del carico del tumore con isolamento tecnico minimo procedure11,12. Gli approcci di cella basata potrebbero servire come un contributo complementare in quanto consente di RNA13,14 e proteina15 analisi di espressione e anche per CTC derivata cell culture o xenotrapianti16, 17. anche se ostacoli come recupero basso delle cellule e lo spazio per l'uso in pazienti devono ancora essere superate, il metodo di cattura e rilascio compie un importante passo successivo verso la caratterizzazione delle cellule bersaglio rara.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

Cellule bersaglio raro possono essere isolate da un fondo elevato di cellule non-bersaglio utilizzando anticorpi specifici per proteine di superficie delle cellule bersaglio. Un metodo sviluppato di recente utilizza un filo medico funzionalizzato con anticorpi di molecola (EpCAM) di adesione delle cellule anti-epiteliale per isolamento in vivo di circolazione del tumore le cellule (CTCs)1. Una coorte di paziente-abbinato nel carcinoma della prostata non metastatico ha mostrato che la tecnica di isolamento in vivo ha provocato una percentuale maggiore di pazienti positivi per CTCs, come pure i conteggi del CTC superiori rispetto la parità aurea corrente nell'enumerazione CTC. Come le cellule non possono essere recuperate da dispositivi medici attuali, un nuovo filo funzionalizzato (denominato dispositivo) è stato prodotto da trattamento enzimatico che consente la cattura e successiva separazione delle cellule. Le cellule possono collegare al dispositivo, visualizzati su un microscopio e staccato mediante trattamento enzimatico. Le cellule recuperate sono citocentrifugate sui vetrini rivestite con membrana e raccolgono individualmente mediante microdissezione laser o micromanipolazione. Cella singola campioni vengono sottoposti all'amplificazione di cella singola intero genoma permettendo analisi multipla a valle, inclusi gli approcci di screening e mirate. La procedura di isolamento e di recupero produce alta qualità del DNA da cellule singole e non altera l'amplificazione successiva intero genoma (WGA). DNA amplificato di una singola cellula può essere inoltrato allo screening e/o analisi come l'ibridazione comparativa del genoma di matrice (array-CGH) o sequenziamento mirate. Il dispositivo consente l'isolamento ex vivo da campioni di cellule rare artificiale (cioè 500 cellule bersaglio a spillo in 5 mL di sangue periferico). Considerando che i tassi di distacco delle cellule sono accettabili (50-90%), il tasso di recupero delle cellule indipendente sui vetrini riguardano una vasta gamma dipenda sulla linea cellulare utilizzata (< 10 - > 50%) e necessita di qualche ulteriore attenzione. Questo dispositivo non viene cancellato per l'uso in pazienti.

Le cellule dopo CFSE e colorazione acido nucleico possono essere valutate utilizzando un microscopio di immunofluorescenza dotato di filtri per DAPI e FITC. I nuclei presentano una colorazione brillante nel canale DAPI mentre citoplasma delle cellule Visualizza etichettatura uniforme con CFSE con intensità eterogenea Inter-cellula (Figura 2A e 2E). Forma e intensità di colorazione simile sono previsto dalle cellule collegate al cavo (Figura 2B e 2F) così come staccati dal filo e recuperati su un vetrino (Figura 2D e 2 H).
Densità elevata delle cellule (ad es. > 1 000 000 singoli cellule/mL) potrebbe causare una copertura totale del filo con cellule quando i cavi di ricarica. Tuttavia, bassa densità delle cellule, cambiamenti nella velocità di rotazione durante l'incubazione e l'uso di diverse linee cellulari influenzano l'efficienza di isolamento e devono essere testati separatamente. Quando i fili sono stati incubati con 5 mL di cellule HT-29 a 100 000 cellule / mL come descritto al punto 2.1., una media di 254 ± 103 cellule (n = 5) sono stati catturati i fili. Con lo stesso esperimento utilizzando cellule di LNCaP, una media di 440 ± 319 cellule (n = 5) per filo è stata ottenuta.
Che presenta cellule HT-29 500, 5 000 e 50 000 in una priorità bassa di 5 mL di sangue periferico per fili (secondo protocollo sezione 2.2.) ha provocato la cattura di 75 ± 18 celle, 25 ± 9 celle e 47 ± 57 cellule (n = 3, ogni), rispettivamente. Se il filo è stato incaricato da 15 µ l di sospensione cellulare (1 000 000 singoli cellule/mL) secondo il protocollo nella sezione 2.3., fino a 1 000 (HT-29) cellule possono essere agganciato a un filo.
Efficienze di distacco ha variate da 81% in cellule HT-29 di cella (gamma 54,9% - 93,2% e n = 5) all'81% (gamma 63.51-92.87%, n = 6) e 91% (gamma 84,7% - 95,3%, n = 6) le cellule LNCaP e VCaP, rispettivamente. Allo stesso modo, il recupero delle cellule indipendente differisce tra linee cellulari: una media del 28% delle cellule HT-29 indipendente sono stati recuperati da citocentrifugazione. Considerando che il tasso di recupero per LNCaP era inferiore al 10%, il tasso di recupero medio per VCaP cellule era 55%.
Circa il 75% delle singole cellule sottoposte a prodotti di WGA WGA resa alta qualità: questo è 1) striscio di prodotti WGA che vanno da 0,1 a > 1 kb (Figura 4, pannello superiore) e 2) tre o quattro bande nella qualità 4plex controllano PCR (Figura 4, pannello inferiore) . WGA prodotti possono essere utilizzati per 1) array-CGH profilatura soddisfano i criteri di qualità per cella singola array-CGH profili 6,7 e 2) mirata NGS dopo ri-amplificazione WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro per isolare e recupero di cellule bersaglio per analisi unicellulare. (A) le cellule sono coltivate a confluency di 90% e (B) raccolte per ottenere una sospensione unicellulare. Dopo colorazione con CFSE e acido nucleico macchia, (C) il filo funzionalizzato viene incubato in presenza di cellule in un volume di 5 mL utilizzando provette di reazione o in un volume basso usando la punta di una pipetta di Pasteur. Quest'ultimo permette di volumi di sospensione cellulare partir 15 µ l. (D) le cellule hanno bisogno di essere indipendente all'interno di 4 h dopo la ricarica. Di conseguenza, il filo è collocato in una provetta di reazione 1,5 mL riempita con buffer di uscita. Dopo l'incubazione di 15 min su un rocker e 10 min di centrifugazione, il filo viene rimosso e la sospensione cellulare viene centrifugata per agglomerare le cellule. (E) cellule recuperate sono sia trasferite a una lastra di vetro per cella singola micromanipolazione (in alto) o citocentrifugate su un vetrino rivestite con membrana e inoltrate a laser microdissection (in basso). (F) infine, raccolte singole cellule sono amplificate mediante amplificazione del genoma intero (WGA). WGA prodotti sono compatibili con array-CGH e mirate analisi a valle di NGS. EpCAM epitopo: cerchio verde sulla superficie delle cellule. Funzionalizzati filo: dispositivo, grigi fili tripla elica. Polimero: linee viola. Gli anticorpi anti-EpCAM: arancione. Attività di buffer di uscita: freccia rossa. Marcatore di grasso per mantenere la sospensione cellulare in posizione: ellisse blu scuro. Recuperata la sospensione cellulare: blu chiaro. Capillare per micromanipolazione: linea nera. Ingrandimento: recuperati delle cellule raccolte di micromanipolazione, cytospin su rivestito diapositive contenenti celle recuperate (ellisse piena grigia). Ingrandimento: essere recuperato cella laser microdissected (grigio linea circolare: membrana da diapositiva di membrana che funge da spina dorsale per il laser microdissection) obiettiva con raggio laser (linea blu si avvicina la diapositiva di membrana dal basso). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figura 2: visualizzazione di cellule marcate. (A, E) Cellule prima della ricarica: le cellule sono etichettate con CFSE e controcolorate con un DNA intercalanti tintura che mostra un'intensità di segnale gamma di CFSE (verde). (B,F) Cellule marcate catturate sul filo. (C,G) Filo dopo procedura di distacco cellulare. (D,H) Cellule staccate dal filo e recuperati da citocentrifugazione in una diapositiva. CFSE: Canale FITC (verde). Macchia di DNA: canale DAPI (blu). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figura 3: filo e conservazione vano. (A) scomparti del filo. (B) dettaglio della parte funzionalizzata. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figura 4: controllo di qualità dei prodotti WGA ricavate dalle celle singole micromanipulated. Pannello superiore: prodotti WGA ottenuti da singole cellule in genere risultato nel DNA sbavature che vanno da 0,2 kb a > 1,0 kb con un'intensità di picco a circa 0,5 kb. Numero di campioni 1, 7 e 13 (contrassegnati con un asterisco) Visualizza suboptimale o nessun DNA sbavature. Pannello di fondo: WGA prodotti sono di qualità sufficiente se la PCR 4plex produce tre o quattro di quattro prodotti di PCR (100, 200, 300 e 400 bp). Campioni 1, 7, 10 e 13 mostrano meno di tre bande e sarebbero esclusi da ulteriori analisi. Il vicolo M contiene una scala di bp 100 e gli asterischi indicano i campioni di qualità di prodotto WGA insufficiente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sequenza più superelegante</td>
			<td>NOTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 ′</td>
			<td>primer in avanti di 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 ′</td>
			<td>primer inverso di 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-agg tgg agc gag gct agc-3 ′</td>
			<td>primer in avanti di 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 ′</td>
			<td>primer inverso di 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-agg tga gac att ctt gct gg-3 ′</td>
			<td>300 primer forward bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-tcc atto aac cag tca gcg tc-3 ′</td>
			<td>300 primer inverso di bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-aca gtc gatto gcc atc atto gc-3 ′</td>
			<td>primer in avanti di 400 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 ′</td>
			<td>primer inverso di 400 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sequenze di Primer per il controllo di qualità 4plex PCR

Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Questo protocollo è quello di recuperare e preparare cellule bersaglio rara da una miscela con cellule non-bersaglio della priorità bassa per la caratterizzazione genetica molecolare a livello di singola cellula. Qualità del DNA è uguale a cellule singole non trattata e permette per cella singola applicazione (entrambi screening basato e analisi mirate).

Amplificazione dell'obiettivo delle cellule pre-arricchimento e intero genoma per singola cella a valle caratterizzazione

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

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Cancer Research

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