Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
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この研究は、オーストリア科学基金 (FWF)、プロジェクト no によって賄われていた。私は ERANET プロジェクト並進癌研究 (TRANSCAN)「前立腺がん (CTC スキャン) 微小残存病変に対するバイオ マーカーとして循環腫瘍細胞」の一部として (の ps) に 1220 B19。博士後期課程サウスカロライナは、グラーツ医科大学の PhD プログラム分子医学の枠内で訓練されました。著者感謝して、専門的な技術支援のニーナ反応における触媒表面、ダニエル ・ クンマー、ガビ Wendt、クラウディア Chudak、ジュリア シュルツ、ヨハンナ ・ シラーを認めます。著者はゲオルク ・ Peinhaupt のグラフィック デザイン サポートをありがちましょう。

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

記述されていたプロトコルは前のヴィヴォ単一細胞のゲノム解析の機能性ワイヤ (デバイスと呼ばれる) からのセルの取得を目指しています。3 EpCAM 陽性細胞 (HT 29、LNCaP, と VCaP) をテストしました、EpCAM を表現する任意のセルの行には、原則としてこの方法を適用できます。EpCAM 肯定的な標的細胞を純粋な細胞懸濁液としてデバイスに表示できる (2.1 を参照してください). または背景セルの黒字に混合 (e.g。 末梢血, 2.2 を参照してください。)。特に後者を使用する珍しいセル条件下で分離能力を試験するのに対し、ワイヤーに接続されているセルの数の微調整を行うことが記載されている低ボリュームを使用してアプローチ (2.3 を参照してください).。細胞ライン間の相違が予想されるとおり、ワイヤー、回転を充電するための適切なセル密度速度同様インキュベーション時間は蛍光顕微鏡を使用して接続されているセルの数を評価することによって実験的にテストする必要があります。
WGA の単一細胞レベルでゲノム下位アプリケーションが必要です。WGA の選択の方法は、ラボによって異なるかもしれませんが、原則として、本手法はマイクロマニピュレーションやレーザー顕微解剖から得られたサンプルを処理できるよりもすべてのメソッドにオープン。このプロトコルでは熱の断片化による WGA7と比較してパフォーマンスを向上させるための酵素によって断片化された DNA に基づくメソッドを使います。省略可能な単一セルは、20,21以降 DNA を許可する等温 WGA に転送できます。
記述されていたプロトコルは、ゲノムの単一細胞解析の機能ワイヤの新しい世代にアタッチした後はそのままなセルの回復を目指しています。これまでのところ市場で生体内で唯一の CE 承認された濃縮デバイスを表し、官能のワイヤの最初の世代は、転移がん患者で Ctc を列挙するために使用されました。以前の出版物および私達の自身のデータは、現在のゴールド スタンダード技術2と比較してより敏感であるため生体内で分離手法を提案します。したがって、単一細胞レベルでの解析と高 CTC 復旧を組み合わせることにより、デバイスで実現、この生体内で分離手法では回復機能を装備します。
しかし、患者で使用するため、デバイスは消去されません、したがって、臨床データはご利用いただけません。前のヴィヴォアプリケーション (すなわちサンプリング後の末梢血から Ctc を分離する) 技術の設定肘無駄、例えば低直径無駄 (増加の確率の存在に適応としては推奨されませんCtc とキャッチ抗体間の接触を直接) と長い保持時間 (30 分) 2-3 L 血のワイヤーを渡すことができます。しかしで説明セクション 2.2。標的細胞の混合サンプル7から分離も可能です。
メソッドの現在の制限は、電線から剥離後未固定細胞の非効率的なリカバリです。これはしかし、セル固定が剥離治療前に一歩改善可能性があります。
要約すると、このプロトコルは遺伝的単一細胞を特徴付けるための細胞回復と生体内での分離法の併用への第一歩です。一層の努力は、細胞回復、患者1,2への応用にクリアランスの最適化に対処する必要があります。しかし、治療のモニタリングと治療の決定のための個別化医療は Ctc の列挙体外です。したがって、このメソッドは、単一セルのレベルでゲノムの CTC 特性への第一歩です。
単一細胞のトランスクリプトーム解析に向けてのアプリケーションはようそのままなセルを収穫可能。ただし、それは復元の手順 RNA 整合性 (例えば転送直接溶解 Rt-qpcr22続いて回復された単一セル) の影響があるかどうか評価する残ります。成功した場合は、トランスクリプトームのレベルより詳細な解析を可能に単一細胞 (Ctcなど) の特性を移すことができます。この点、RNA シーケンス (RNA シーケンス ライブラリの準備時に得られた) preamplified cDNA を量的な PCR に受けることができます、単一細胞の RNA 下流解析の貴重なツールを提供しますスマート seq2 を使用します。これは、結合されたターゲットと回復した単細胞22,23のスクリーニングに基づく解析が許可されます。
現在の機能性線は Ctc24の肯定的な選択のために広く使用されている上皮性マーカーである抗 EpCAM 抗体に基づいています。いくつか Ctc では、レセプター サイトケラチンなど EpCAM25上皮系マーカーを可能性があります、HER2/新しいなどの抗体を追加で CTC 分離のチャンスを高めるでしょう。いくつかの抗体と濃縮戦略開発・ フェレイラらによって検討しました。201626。ワイヤに固定化した抗体の混合物より高い番号の分離と Ctc のサブタイプにつながる技術の将来の改善可能性があります。
ワイヤは、その機能を維持するために溶液中浸漬ワイヤの一部の機能を維持する処理を含むすべての手順は必須です。1x PBS で評価 (顕微鏡; 中にワイヤを配置するをお勧めします例えば。 3.1 の手順。-3.3.)そして記憶。不適切な染色を避けるために、手順 1.2.1 で染色液を準備たてを使用をお勧めします。1.2.2 と。弱陽性細胞細胞を頼りにワイヤーを妨げるし、接続されたセルの過小評価につながる可能性があります。
細胞懸濁液 (手順 2.3.4。) の後続の読み込みをパスツール ピペットでワイヤーを挿入するときにゴム製のキャップをパスツール ピペットを差し込むことは避けるべきです。ゴム製のキャップは、パスツール ピペットの先端内部機能の一部にあるので、場所にワイヤーを保持するために使用されます。キャップは、パスツール ピペットの後部にもしっかりと接続されている場合、細胞懸濁液の読み込みは不可能です。この場合、読み込まれた細胞懸濁液によって転置される空気は、ピペットを残すことができますようにキャップを緩和します。
ワイヤーを曲げは、3.2 の手順を数えるセル中にその方向に不可欠です。3.3。ワイヤーの非機能的な一端を 1 つの側面に嘘をつくような粘着テープを使用してワイヤーをマウントします。一部の機能の全体の長さをスキャンした後、ワイヤーは機能ワイヤの他の半分をスキャンすることができますので 180 ° がロールバックされます。この手順は、ワイヤ上のセルの数を評価する最初の実験のために重要です。セルをカウントせずに手順を繰り返すことができます特定の細胞およびプロシージャのための細胞の数が評価されると (e.g。 だけ細胞の存在を確認し、この手順を省略)。注意ピペッティング ステップ 4.8 の上澄みの量を減らすとき、セル損失を避けるために重要です。ペレットに乱れを発生させることがなくスムーズに行われ、ピペッティングを確認します。

最近、CellCollector DC01、修飾と癌患者の末梢血から Ctc を隔離するため抗 EpCAM 抗体医療用ワイヤー線は CTC 列挙1,2,3 の整然としたスペクトルに追加されました.非転移性前立腺癌で現在進行中の研究、この官能ワイヤー レポートは CTC 陽性 2 回ほぼ多くの患者および CellSearch、CTC 列挙型3 のゴールド スタンダードと比較して CTC 陽性で高い CTC カウント.この奨励のパフォーマンスによる単一細胞解析用機能性医療線からセルの隔離が望ましいが細胞剥離ソリューション (例えばトリプシン) で酵素処理もレーザ切断可能そのままなセル (データは示されていない) の回復。
キャプチャされた細胞の剥離をできるように、官能のワイヤの新世代は特定のポリマーが装備されていた。キャプチャー抗体をワイヤーにリンク、このポリマーは (CellCollector DC03 のデバイスとする呼ばれる) そのままなセルの取り外しを許可するリリース バッファー処理に影響を受けやすい。新しい機能性デバイスにより、癌細胞にウシ血清アルブミン (BSA) スパイクの濃度から標的細胞の分離/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と末梢血、それぞれ。
デバイスに回復後、細胞の視覚的検出を容易に標的がん細胞が付けられて carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) と回復の治療前に DNA 染色 (すなわち。 充電およびデタッチ)。単一細胞の DNA の品質に、治療の効果、品質コントロール PCR4、5、アレイ CGH6,7によって WGA 後以前に評価したし、ターゲット シーケンス7差が認められなかったに比べて非処理細胞 micromanipulated 細胞懸濁液7から。この方法の利点は、まれなターゲット細胞前濃縮の組み合わせと単一細胞下流解析 (図 1) のための細胞の回復であります。現在体内に CE ラベル コレクション デバイスは、単一細胞分子生物学2,8ではなく、Ctc の列挙に一般的に使用されます。ただし、Ctc の不均一性を調査するためのより包括的な解析 (すなわち対象と単一細胞レベルのシーケンス) 個々 のセル レベル分析の長い。他のセル ベースの方法は、免疫 EpCAM 正 CTCs 及びその後の分子遺伝学的解析9,10の誘電泳動に基づく単一細胞処理の分離に基づいています。Ctc の分子特性は臨床の現場で役に立つ実装にとって重要な要件と転移連鎖の基礎的研究にも同様に重要。Ctc に並行して、循環腫瘍 DNA (葉緑体) なっている非常に重要なことで最小限の技術分離手順11,12と腫瘍の重荷の DNA 解析。セルベース アプローチ RNA13,14タンパク質15式分析の相補的な貢献として役立つかもしれないこと、また CTC 派生セル文化または異種16,17. 低細胞の回復と患者の使用のためのクリアランスなどの障害物は、まだ克服しなければならない必要ですが、キャッチとリリース メソッドはまれなターゲット セルの特性評価に向けた重要な次のステップです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

まれな標的細胞は標的細胞の表面蛋白質の特異抗体を用いた非標的細胞の高いバック グラウンドから分離することができます。最近開発された方法は、医療用ワイヤー線の循環腫瘍細胞 (CTCs)1の絶縁に生体内で抗上皮細胞接着分子 (EpCAM) 抗体修飾を使用します。非転移性前立腺癌患者照合のコホートは、生体内で分離技術は、Ctc として CTC 列挙体の現在のゴールド スタンダードと比較して高い CTC 数陽性患者の割合が高いの結果を示した。セルは、現在の医療機器から復旧できない、(デバイスと呼ばれる) 新しい機能性ワイヤーはキャプチャと後続の剥離細胞の酵素処理でに製造されました。細胞は顕微鏡で視覚化、酵素処理を使用して、デバイスに接続できるとしています。回復した細胞膜コーティング スライド cytocentrifuged、レーザ切断またはマイクロマニピュレーションによる個別に収穫します。単一セルのサンプル スクリーニングとターゲット固有のアプローチを含む複数のダウン ストリーム解析を許可する単一細胞ゲノム増幅を受けます。隔離および復元の手順は単一セルから高品質 DNA を生成し、以降の全ゲノムの拡大 (WGA) を損なうことはありませんできます。単一セルの増幅された DNA のスクリーニングに転送することができますおよび/または配列比較ゲノム交配 (アレイ CGH) やシーケンスなどの分析を対象としました。デバイスには、珍しい人工細胞サンプル (すなわち500 標的細胞が末梢血 5 mL にスパイク) から分離前のヴィヴォことができます。広い範囲の細胞ラインの使用に依存して細胞の剥離料金は許容範囲 (50-90%) である一方スライド上に剥離細胞の回収率にまたがる (< 10 - > 50%) といくつかのさらなる注意が必要があります。患者の使用のため、このデバイスは消去されません。

CFSE と核酸染色後の細胞は、DAPI の FITC フィルター搭載蛍光顕微鏡を用いた評価できます。細胞の細胞質を示す (図 2 aと2 e) 異種のセル間強度と CFSE と制服ラベルに対し核を DAPI チャネルで明るい対比染色と提示します。似た形や強度を染色がワイヤ (図 2 bと2 f) に接続されているセルからの期待と同様ワイヤーを切り離す、スライド (図 2 Dと2 H) の回復します。
高細胞密度 (例えば> 1 000 000 細胞/ml) ワイヤーを充電時細胞とワイヤの全体をカバーになります。しかし、細胞の密度を低く、インキュベーション中に回転速度の変化と別の細胞ラインの使用の分離効率に影響を与える個別にテストする必要があります。ときワイヤー培養 5 ml 100 000 で HT 29 セルのセル/セクション 2.1 で説明として mL。、254 ± 103 セルの平均値 (n = 5) ワイヤで捕えられました。同じ平均 440 ± 319 細胞 LNCaP 細胞を用いた実験 (n = 5) ワイヤあたりが得られました。
75 ± 18 セル、25 ± 9 セル、および 47 ± 57 細胞の捕獲で起因した提示 (プロトコル セクション 2.2) によるとワイヤーに末梢血 5 mL のバック グラウンドで 500、5 000、50 000 の HT 29 細胞 (n = 3、それぞれ)、それぞれ。ワイヤーはセクション 2.3 でプロトコルに従って細胞懸濁液 (1 000 000 細胞/mL) の 15 μ L と満たされるかどうか。、1 000 (HT 29) まで細胞をワイヤーに添付可能性があります。
HT 29 セルで 81% であった剥離効率を細胞 (54.9% 93.2%、および n の範囲 = 5) 81% (63.51%-92.87%、n の範囲 = 6) と 91% (84.7%-95.3%、n の範囲 = 6) VCaP と LNCaP 細胞それぞれ。同様に、剥離細胞の回復は違い細胞: 戸建 HT 29 セルの 28% の平均が cytocentrifugation によって回復されました。LNCaP の回収率は 10% よりも低い、VCaP セルの平均回収率 55% であった。
単一細胞の約 75% が収量高品質 WGA WGA を受ける: これは 1) 0.1 から > 1 kb (図 4、上部パネル)、2) 3 まで WGA 製品の汚れまたは 4 plex 品質の 4 バンド コントロール PCR (図 4下のパネル).WGA 製品の 1) アレイ CGH 後再増幅 WGA 7単一セル配列 CGH プロファイル6,7と 2) ターゲットを絞った NGS の品質基準を満たすプロファイルを使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> 図 1: 分離および単一細胞解析のための標的細胞を回復するためのワークフロー 。(A) 90% の confluency に培養される細胞および(B)単一細胞懸濁液を取得する収穫します。CFSE と核酸染色、 (C)官能のワイヤを染色後は 5 mL の反応管を使用してのボリューム、パスツール ピペット チップを使用して少量の細胞の存在下で培養しました。後者は、細胞懸濁液ボリュームのアプリケーション 15 μ L と低(D)セルは充電後 4 時間以内にデタッチする必要があります。したがって、ワイヤは、1.5 mL の反作用の管をリリース バッファーでいっぱいに配置されます。ロッカーで 10 分遠心 15 分後、ワイヤが削除され、セルをペレットに細胞懸濁液を遠心しました。(E)回復済みセルがどちらか単一セル マイクロマニピュレーション (上) または cytocentrifuged 膜コーティング スライドにスライド ガラスに転送され、レーザーマイクロダイ セクション (下部) に転送されます。(F)最後に、収穫の単一セルは、全ゲノムの拡大 (WGA) によって増幅されます。WGA の製品は、アレイ CGH と NGS 下流解析と互換性が。EpCAM エピトープ: 細胞表面に緑色の円。ワイヤーを官能基化: 灰色のトリプル ヘリカル ワイヤ デバイス。ポリマー: 紫のライン。アンチ EpCAM 抗体: オレンジ。解放バッファー活動: 赤い矢印。代わりに細胞懸濁液を保持するグリース マーカー: 暗い青色の楕円。細胞懸濁液を回復: 水色します。マイクロマニピュレーション用キャピラリー: 黒のライン。倍率: マイクロマニピュレーションにより収穫された回復されたセル、膜で覆われた上 cytospin 回復を含んでいるセル (灰色塗りつぶし楕円) をスライドさせます。倍率: 回復されたセルがされている microdissected のレーザー (灰色の円の線: レーザ切断のためのバックボーンとして膜スライドから膜)、レーザー (膜スライドを下から近づいて青線) を用いた客観的。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> 図 2: ラベル付きセルの視覚化します。(A ・ E)充電する前にセル: セルを付けられて CFSE して染料 CFSE 範囲 (緑) の信号強度を示す間をインターカ レート DNA と counterstained。(B、F)ワイヤーでキャプチャされた細胞。(C、G)細胞の剥離処理後に配線します。(D,H)セル ワイヤから切断し、スライドに cytocentrifugation によって回復します。CFSE: FITC チャンネル (グリーン)。DNA 染色: DAPI チャネル (青)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> 図 3: ワイヤーおよびストレージコン パートメント。(A)電線のコンパートメント。(B)機能部分のディテール。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> 図 4: WGA 製品の品質管理は、単一の micromanipulated 細胞から得られた。上部パネル: 単一細胞から得られた WGA 製品通常 DNA の結果塗抹 0.5 kb のまわりでピーク強度と > 1.0 kb 0.2 kb に至る。サンプル数 1、7、13 (アスタリスクで示される) 最適ではない表示または DNA を塗りません。底板: WGA 製品が十分な品質の 3 つまたは 4 つの PCR の製品の 4 4 plex PCR が得られます (100、200、300、400 で bp)。1、7、10、および 13 のサンプルより少ない 3 つのバンドを表示、さらに分析から除外されます。レーン M 100 bp ラダーを含み、アスタリスクが不十分な WGA 製品品質のサンプルを示します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プライマー シーケンス</td>
			<td>メモ</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '</td>
			<td>100 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 '</td>
			<td>100 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tgg agc ギャグ gct agc-3 '</td>
			<td>200 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 '</td>
			<td>200 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tga gac att ctt gct gg-3 '</td>
			<td>300 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' tcc 法 aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>300 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc 猫 gcc atc 法 gc-3 '</td>
			<td>400 bp 前方プライマー</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gct tga caa agt ggt cgt tg-3 '</td>
			<td>400 bp 逆プライマー</td>
		</tr>
</tbody></table>4 plex 品質コントロール PCR のプライマー シーケンスを表 1:

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Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング ベースし、解析を対象とした)。

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

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