Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

이 연구는 오스트리아 과학 기금 (FWF), 프로젝트 아니오 투자 되었다. 난 ERANET 프로젝트에서 변환 암 연구 (TRANSCAN) "으로 전립선 암 (CTC-스캔)에 있는 최소 잔여 질병 바이오 마커 순환 종양 세포"의 일환으로 (추 신)을 1220 B19. 박사 학위 후보자 사우스 캐롤라이나 의료 그라츠 대학교의 박사 학위 프로그램 분자 의학의 프레임 내에서 훈련 되었다. 저자는 기꺼이 그들의 전문 기술 지원에 대 한 니 나 Schlögl, 다니엘 Kummer, Gabi Wendt, 클 라우 디 아 Chudak, 줄리아 슐츠, 그리고 요한 나 쉴러 인정합니다. 저자는 게오르그 Peinhaupt 그래픽 디자인 지원 감사.

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저자는 공개 없다.

설명된 프로토콜은 단일 셀 비보 전 게놈 분석을 위한 기능성된 와이어 (장치 라고도 함)에서 셀을 검색 목표로 합니다. 우리 테스트 3 EpCAM 양성 세포 선 (HT-29, LNCaP, 및 VCaP), 하지만 원칙적으로이 방법은 EpCAM 표현 모든 셀 라인에 적용할 수 있습니다. EpCAM 긍정적인 대상 셀 순수 셀 서 스 펜 션 장치를 발표 될 수 있다 (2.1 참조) 또는 배경 셀의 흑자에 혼합 (예. 주변 혈액, 2.2 참조.). 특히 후자의 격리 용량 드문 셀 조건에서 테스트를 사용할 수 있습니다, 반면 와이어에 연결 된 셀의 수의 미세 조정 할 수 있습니다 설명된 낮은 볼륨을 사용 하 여 접근 (2.3 참조.). 로 셀 라인 간의 차이 예상 될 것 이다, 와이어, 회전을 충전을 위한 적당 한 셀 밀도 속도 뿐만 아니라 보육 시간 면역 형광 현미경을 사용 하 여 연결 된 셀의 수를 계산 하 여 경험을 테스트 될 필요가.
단일 셀 수준 WGA에서 게놈 다운스트림 응용 프로그램에 대 한이 필요 합니다. WGA 방법의 선택 실험실 사이 다를 수 있습니다 그리고, 원칙적으로, 우리의 메서드는 micromanipulation 또는 레이저 기정에서 얻은 샘플을 처리할 수 있는 보다 모든 방법에 열려. 이 프로토콜 열-조각화 기반 WGA7에 비해 더 나은 성능으로 인해 효소 조각난된 DNA 기반 방법을 사용 하 여. 옵션, 단일 셀 수 있도록 후속 DNA 프로 파일링20,21등온선 WGA에 전달할 수 있습니다.
설명된 프로토콜 게놈 단일 세포 분석을 위한 기능성된 와이어의 새로운 세대에 연결 되 고 후 그대로 세포 회복을 목표로 합니다. 또한 지금까지 시장에서 vivo에서 만 CE 승인 농축 장치, 대표 기능성된 와이어의 첫 번째 세대 열거 하는 CTCs 전이 암 환자에서 사용 되었다. 이전 게시 하 고 우리 자신의 데이터 현재 골드 표준 기술2에 비해 더 민감한 vivo에서 의 절연 기술을 제안 합니다. 따라서, 장치에서 실현이 비보에 격리 기술을 복구 기능을 갖춘 단일 세포 수준에서 묘사와 높은 CTC 복구를 결합 수 있습니다.
그러나, 장치에 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다, 그리고 따라서, 임상 데이터는 사용할 수 없습니다. Ex vivo 응용 프로그램 (즉, 샘플링 후 CTCs 주변 혈액에서 분리) 기술은 이다 cubital 헛된, 예를 들어 낮은 직경 헛된 (증가의 확률의 현재 설정에 적응에 권장 하지 않습니다 CTCs과 잡기 항 체 사이 접촉을 직접) 및 긴 보유 시간 (30 분, 와이어를 통과 하는 혈액의 2-3 L을 허용). 그러나,에 개요 섹션 2.2로. 대상 셀 혼합된 샘플7으로부터 격리 될 수 있습니다.
방법의 현재 한계는 전선에서 분리 후 고정 되지 않은 셀의 비효율적인 회복 이다. 그러나 이것,, 분리 처리 이전 셀 고정 단계에 의해 향상 될 수 있습니다.
요약 하자면,이 프로토콜은 유전자 단일 셀을 특성화에 대 한 사용은 vivo에서 격리 기법 셀 복구를 향한 첫 번째 단계입니다. 셀 복구 및 환자1,2에서 응용 프로그램에 대 한 허가의 최적화를 해결 하기 위해 더욱 노력 해야 합니다. 그러나, 치료 모니터링 및 치료 결정에 대 한 맞춤된 의학 CTCs 열거 벗어납니다. 따라서,이 메서드는 단일 세포 수준에서 게놈 CTC 특성화 향한 첫 번째 단계.
단일 셀 transcriptome 분석으로 응용 프로그램 것으로 그대로 세포 수확 가능. 그러나, 그것은 회복 절차 (예: 실시간 정량22뒤 직접 세포에 복구 된 단일 셀을 전달) RNA 무결성에 영향을가지고 있는지 평가 하 남아 있다. 성공 하면, 단일 셀 (예: CTCs)의 특성화 transcriptome 수준, 더 자세한 분석을 허용 하 이동 수 있습니다. 이 점에서 RNA-seq로 양이 많은 PCR에 (RNA-seq 라이브러리 준비 하는 동안 얻은) preamplified cDNA를 대상이 될 수 있는 단일 세포의 RNA 다운스트림 분석을 위한 유용한 도구를 제공 스마트 seq2를 사용 하 여. 이 결합된 대상 및 단일 복구 된 셀22,23의 심사 기반 분석을 허용할 것 이다.
현재 기능성된 와이어 CTCs24의 긍정적인 선택에 대 한 널리 상피 마커는 안티 EpCAM 항 체를 기반으로 합니다. 여러 CTCs 수도 cytokeratins 등 EpCAM25downregulate 상피 마커, HER2/새 등 항 체를 추가 CTC 절연의 기회를 증가할 것입니다. 여러 가지 항 체 농축 전략 개발 되었고 페 레이 외의 검토를 기반으로 합니다. 201626에. 와이어에 움직일 항 체의 혼합물 더 높은 숫자의 격리 및 추가 하위 CTCs의 기술의 미래 향상 될 수 있습니다.
그것은 그것의 기능을 유지 하기 위해 솔루션에 빠져들 와이어의 기능적인 부분을 계속 처리 하는 와이어를 포함 하는 모든 단계에 대 한 필수입니다. 평가 (현미경; 중 1 x PBS에 와이어를 배치 하는 것이 좋습니다. 예. 3.1 단계. -3.3.) 그리고 저장입니다. 부적절 한 얼룩을 피하기 위해 갓을 사용 하 여 단계 1.2.1 얼룩 솔루션을 준비 하는 것이 좋습니다. 1.2.2 하 고입니다. 약하게 스테인드 셀 셀에 계산을 방해 하 고 연결 된 셀의 과소를 이어질 수 있습니다.
그것은 고무 캡으로 파스퇴르 피 펫 파스퇴르 피펫으로 세포 현 탁 액 (단계 2.3.4.)의 후속 로드에 와이어를 삽입할 때 연결 하지 않도록 해야 합니다. 고무 캡 기능 부분 파스퇴르 피 펫의 끝 안에 위치 하 고 자리에는 와이어를 잡고 하는 데 사용 됩니다. 뚜껑 파스퇴르 피 펫의 후면에 너무 단단히 연결, 세포 현 탁 액의 로드 불가능 합니다. 이 경우에 로드 셀 서 스 펜 션에 의해 전치 되는 공기는 피 펫을 남길 수 있습니다 뚜껑을 쉽게.
와이어 벤딩 하는 것은 단계 3.2에서 셀 동안 그것의 방향에 대 한 중요 합니다. 그리고 3.3입니다. 와이어 철사의 비 기능 끝 한쪽에 거짓말을 제공 되도록 접착 테이프를 사용 하 여 탑재 합니다. 스캔 후 기능 부품의 전체 길이, 와이어는 압 연 180 ° 그래서 기능 와이어의 나머지 절반을 검색할 수 있습니다. 이 단계는 초기 실험에는 셀의 수를 평가 하는 것이 중요. 일단 특정 셀 라인 및 절차에 대 한 셀의 수 계산 절차 셀 계산 없이 반복 될 수 있다 (예.만 셀의 존재에 대 한 검사 또는이 단계 생략). 주의 pipetting 손실을 방지 하기 위해 셀 단계 4.8에서에서 상쾌한의 볼륨을 감소 때 결정적 이다. 펠 릿에 소란 없이 원활 하 게 이루어집니다 pipetting 다는 것을 확인 하십시오.

최근, CellCollector DC01, 의료 와이어 기능성된 암 환자의 말 초 혈액에서 CTCs를 격리 하기 위한 안티 EpCAM 항 체와 CTC 열거형1,2,3의 조직적 스펙트럼에 추가 되었습니다. . 비 전이성 전립선 암에는 현재 진행 중인 연구,이 기능성된 와이어 CTC 양성 되도록 거의 두 배나 많은 환자를 보고 하 고 CellSearch, CTC 열거형3 황금 표준에 비해 CTC 양성 환자에서 높은 CTC 계산 . 이 격려 성능으로 인해 단일 세포 분석을 위한 기능성된 의료 와이어에서 셀의 격리, 바람직한 것 하지만 셀 분리 솔루션 (예: trypsin) 효소 치료도 아니다 아니 레이저 기정 그대로 셀 (데이터 표시 되지 않음)의 복구.
허용 하려면 캡처된 세포의 분리, 기능성된 와이어의 새로운 세대는 특정 폴리머로 갖춰 졌다. 이 폴리머는 와이어를 캡처 항 체를 연결 하는 그대로 셀 (CellCollector DC03 라고도 장치)의 분리를 허용 릴리스 버퍼 치료를 받기 쉽습니다. 암 셀 라인 셀 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 아군의 다양 한 농도에서 대상 셀의 격리를 허용 하는 새로운 기능성된 장치 / 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 말 초 혈액, 각각.
편하게 하기 위해 셀의 시각적 탐지 장치 및 복구 후, 대상 암 세포는 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)와 회복 치료 전에 DNA 얼룩 셔 서 (즉. 충전 및 분리). 단일 세포의 DNA 품질에 대 한 치료의 효과는 품질 관리 PCR4,5, 배열 CGH6,7 에 의하여 WGA 후 이전 평가 했다 및 타겟 시퀀싱7 아무 차이 보여주는 셀 정지7에서 치료 비 셀 micromanipulated에 비해. 이 방법의 장점은 단일 셀 다운스트림 분석 (그림 1)에 대 한 세포의 복구와 희귀 대상 셀 사전 농축의 조합에 있다. 수집 장치 vivo에서 CE 표시 현재는 단일 셀 분자 특성2,8보다 CTCs의 열거에 대 한 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, CTCs 가운데이 조사 하기 위해 보다 포괄적인 분석 개별 셀 수준 (즉, 타겟 시퀀싱 단일 셀 수준)에서 분석에 대 한 긴. 다른 셀 기반 방법 EpCAM 긍정적인 CTCs 및 후속 분자 유전 분석9,10dielectrophoresis에 따라 단일 셀 처리의 immunomagnetic 격리를 기반으로 합니다. CTCs의 분자 특성 임상 설정에서 그들의 유용한 구현 위한 중요 한 요구 이며 전이성 캐스케이드의 기초 연구에서 똑같이 중요 하다. 최소한의 기술 격리 절차11,12종양의 DNA 분석 수 CTCs에 평행선, 순환 종양 DNA (ctDNA) 매우 중요 되고있다. 셀 기반 접근 RNA13,14 및 단백질15 식 분석에 대 한 수는 상호 보완적인 기여 역할을 수 있습니다 및 또한 CTC 파생 셀 문화 또는 xenografts16, 17. 비록 낮은 셀 복구 및 환자에 사용에 대 한 허가 등 장애물을 해야, 캐치 및 릴리스 메서드 희귀 대상 셀의 특성으로 중요 한 다음 단계 걸립니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

드문 대상 셀 대상 세포의 표면 단백질에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 비 대상 셀의 높은 배경 으로부터 격리 될 수 있습니다. 최근에 개발 된 방법 안티 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 순환 종양 세포 (CTCs)1의 비보에 격리에 대 한 항 체와 기능성된 의료 와이어를 사용 합니다. 비 전이성 전립선 암에 일치 하는 환자 코 호트 vivo에서 절연 기술 CTCs CTC 열거형의 현재 황금 표준에 비해 높은 CTC 카운트에 대 긍정적인 환자의 높은 백분율에서 결과 나타났다. 으로 셀은 현재 의료 기기에서 복구할 수 없습니다, (장치 라고도 함)는 새로운 기능성된 와이어 제조 되었다 캡처 및 셀의 후속 분리 효소 처리에 의해. 셀 장치, 현미경에 시각 및 효소 처리를 사용 하 여 분리를 첨부할 수 있습니다. 복구 된 세포 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 이며 레이저 서 또는 micromanipulation 개별적으로 수확. 단일 셀 샘플 검사 및 대상별 접근을 포함 하 여 여러 다운스트림 분석을 허용 하는 단일 셀 전체 게놈 증폭 다음 대상이 됩니다. 격리 및 복구의 절차 고품질 DNA 단일 세포에서 생성 하 고 후속 전체 게놈 증폭 (WGA)을 손상 하지 않습니다. 단일 셀의 증폭 된 DNA 검사에 전달 될 수 있습니다 또는 배열 비교 게놈 교 잡 (배열 CGH) 또는 시퀀싱 등 분석 대상. 장치 인공 드문 셀 샘플 (즉 500 아군 주변 혈액 5 mL에는 대상 셀)에서 ex vivo 격리를 수 있습니다. 슬라이드에 분리 된 세포의 복구 속도 광범위 사용 셀 라인에 걸쳐 세포의 분리 요금은 허용 (50-90%), 반면 (< 10-> 50%)와 몇 가지 더 주의가 필요 하다. 이 장치는 환자에 사용에 대 한 지워지지 않습니다.

CFSE와 핵 얼룩 후 셀 DAPI FITC에 대 한 필터를 장착 하는 면역 형광 현미경을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 반면 셀의 세포질 이기종 간 세포 농도 (그림 2A 및 2E) CFSE와 균일 한 라벨 핵 DAPI 채널에 밝은 counterstain 제시. 비슷한 모양 및 강렬을 얼룩이 지 와이어 (그림 2B 와 2 층)에 연결 된 셀에서 예상으로 전선에서 분리 있으며 슬라이드 (그림 2D 및 2 H)에 복구.
높은 세포 밀도 (예 > 1000000 셀/mL) 전선을 충전 셀 와이어의 전체 범위에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 낮은 세포 밀도, 인큐베이션, 동안 회전 속도 변화 및 다른 세포를 사용 하 여 분리 효율에 영향을 별도로 테스트 하는 데 필요한. 때 전선을 했다 인 큐베이 팅 100 000에 HT-29 셀의 5 mL와 셀 / mL으로 섹션 2.1에서에서 설명., 254 ± 103 셀의 평균 (n = 5) 철사에 체포 되었다. 같은 실험 LNCaP 셀, 440 ± 319 셀의 평균을 사용 하 여 (n = 5) 와이어 당 획득 했다.
75 ± 18, 25 ± 9 셀 전지와 47 ± 57 셀의 캡처 귀착되 었 다 (에 따르면 프로토콜 섹션 2.2.) 전선 주변 혈액 5 mL의 배경에서 500, 5 000, 50 000 HT-29 세포 (n = 3, 각각), 각각. 와이어 15 µ L 섹션 2.3에서에서 프로토콜에 따라 세포 현 탁 액 (1000000 셀/mL)의 비용이 청구 됩니다 경우., 1 000 (HT-29)까지 셀 철사에 첨부할 수 있습니다.
HT-29 셀에 81%에서 배열 했다 분리 효율성 셀 (범위 54.9%-93.2%, 및 n = 5) 81% (범위 63.51-92.87%, n = 6) 91% (범위 84.7%-95.3%, n = 6) LNCaP 시내 VCaP 세포, 각각. 마찬가지로, 분리 된 세포의 복구 셀 라인 다릅니다: 분리 된 HT-29 셀의 28%의 평균 cytocentrifugation에 의해 재기 되었다. LNCaP에 대 한 회복 율 10% 미만인 반면, VCaP 셀에 대 한 평균 복구 율은 55%.
단일 셀의 약 75%에 WGA 수확량 고품질 WGA 제품 복종: 이것이 1) > 1 kb (그림 4, 맨 위 패널)와 2) 3 0.1에서 배열 하는 WGA 제품의 얼룩 또는 4 밴드 4plex 품질에서 제어 PCR (그림 4, 하단 패널) . WGA 제품에 대 한 1) 배열-CGH 다시 증폭 WGA 7후 단일 셀 배열 CGH 프로필 6,7 과 2) 타겟된 NGS에 대 한 품질 기준에 부합 하는 프로 파일링을 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> 그림 1: 분리 하 고 복구 하는 단일 세포 분석에 대 한 대상 셀에 대 한 워크플로. (A) 세포 90 %confluency 교양 하 고 (B) 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 수확. 기능성된 와이어 CFSE와 핵 얼룩, (C) 얼룩 후를 incubated 5 mL 반응 관을 사용 하 여 볼륨 또는 낮은 볼륨 파스퇴르 피 펫 팁을 사용 하 여 셀의 존재. 후자의 수 있습니다 셀 서 스 펜 션의 응용 프로그램에 대 한 낮은로 15 µ L. (D) 셀 충전 후 4 시간 이내 분리할 필요가. 따라서, 와이어 릴리스 버퍼 가득 1.5 mL 반응 관에 배치 됩니다. 15 분 보육 로커에 10 분 원심, 후 철사를 제거 하 고 세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 centrifuged. (E) 복구 세포는 중 단일 셀 micromanipulation (맨 위) 또는 막 코팅 슬라이드에 cytocentrifuged 유리 슬라이드에 전송 하 고 서 (아래)를 레이저로 전달. (F) 마지막으로, 수확된 단일 셀은 전체 게놈 증폭 (WGA)에 의해 증폭 됩니다. WGA 제품 배열 CGH 및 타겟된 NGS 다운스트림 분석과 호환 됩니다. EpCAM epitope: 세포 표면에 녹색 원. 와이어 기능성: 장치, 회색 트리플-나선형 와이어. 폴리머: 보라색 라인입니다. 안티-EpCAM 항 체: 오렌지. 버퍼 활동 발표: 빨간 화살표. 장소에 세포 현 탁 액을 그리스 마커: 다크 블루 타원. 세포 현 탁 액을 복구: 밝은 파란색. Micromanipulation에 대 한 모 세관: 블랙 라인. 확대: 복구 된 셀 micromanipulation에 의해 수확에 막 덮여 cytospin 슬라이드 포함 복구 세포 (회색 채워진된 타원). 확대: microdissected 레이저 복구 된 셀 되 (원형 선 회색: 막 슬라이드 레이저 서 위한 등뼈로 봉사에서 막), 레이저 빔 (파란색 선 막 슬라이드를 아래에서 접근)으로. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> 그림 2: 시각화 이라는 셀. (A, E) 충전 하기 전에 셀: 셀 CFSE와 표시 및 dna 염료 CFSE의 범위 (녹색) 신호 강도 보여주는 intercalating counterstained. (B,F) 통신 중에 캡처한 이라는 셀. (C,G) 휴대-분리 절차 후 와이어. (D,H) 셀은 와이어에서 분리 하 고 슬라이드에 cytocentrifugation에 의해 발견. CFSE: FITC 채널 (녹색)입니다. DNA 얼룩: DAPI 채널 (파란색). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> 그림 3: 와이어 및 스토리지 구획. 와이어의 (A) 구획. (B) 기능성된 부품의 세부 사항. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> 그림 4: 단일 micromanipulated 세포에서 얻은 WGA 제품의 품질 관리. 상단 패널: 단일 세포에서 얻은 WGA 제품 일반적으로 DNA에 결과 얼룩 피크 강도 약 0.5 k b에 0.2 kb에서 > 1.0 kb에 이르기까지. 샘플 번호 1, 7, 13 차선 표시 (별표 표시) 또는 아무 DNA 얼룩. 하단 패널: WGA 제품은 충분 한 품질의 4plex PCR 수익률 3 또는 4 4 PCR 제품의 경우 (100, 200, 300, 그리고 400에 bp). 예제 1, 7, 10, 및 13 3 밴드를 표시 하 고 추가 분석에서 제외 될 것 이다. 레인 M 100 bp 사다리를 포함 하 고 별표 부족 WGA 제품 품질의 샘플을 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>뇌관 순서</td>
			<td>참고</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gtt cca ata tga ttc cac cc-3</td>
			<td>100 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3</td>
			<td>100 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tgg agc gct agc-3 ' 개 그</td>
			<td>200 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3</td>
			<td>200 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' agg tga gac att ctt gct gg-3</td>
			<td>300 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' tcc 법 aac cag tca gcg tc-3</td>
			<td>300 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc 고양이 gcc atc 법 gc-3</td>
			<td>400 bp 앞으로 뇌관</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ' gct tga caa agt ggt cgt 안내-3</td>
			<td>400 bp 역 뇌관</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 4plex 품질 관리 PCR 뇌관 순서

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Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

연구

암 연구학

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

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The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

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