Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av østerrikske Science Fund (FWF), prosjekt-ingen. I 1220-B19 (til PS) som en del av ERANET prosjektet i translasjonsforskning Cancer Research (TRANSCAN) "Circulating tumorceller som biomarkør for Minimal gjenværende sykdom i prostatakreft (CTC-SCAN)". Doktorgradsstipendiat S.C. ble opplært i rammen av PhD-programmet molekylær medisin i medisinske universitet i Graz. Forfatterne erkjenner takknemlig Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz og Johanna Schiller for deres ekspert teknisk assistanse. Forfatterne takker Georg Peinhaupt for grafisk design støtte.

<ol>
	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells.">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li><li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients.">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li><li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples.">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li><li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA.">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li><li>M&#246;hlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH.">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+Release:+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire.">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck.">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li><li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer.">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li><li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer.">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection.">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li><li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer.">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li><li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma.">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells.">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li><li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting.">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622 (2017).</li><li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells:+a+clinical+case+study.">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li><li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer.">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322 (2016).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM.">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells.">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR.">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification.">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li><li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., St&#229;hlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification.">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).</li><li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Challenges+of+Liquid+Biopsies.">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+technologies.">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Beskrevet protokollen tar sikte på å hente celler fra en functionalized wire (referert til som enhet) for ex vivo encellede genomisk analyse. Vi testet tre EpCAM-positive linjer (HT-29, LNCaP og VCaP), men i prinsippet kan denne metoden brukes til enhver celle linje uttrykke EpCAM. EpCAM-positive målcellene kan presenteres på enheten som ren celle suspensjon (se 2.1.) eller blandet inn i et overskudd av bakgrunnen celler (f.eks. perifert blod, se 2.2.). Mens spesielt sistnevnte kan brukes til å teste isolasjon kapasiteter under sjeldne celle forhold, finjustering av antall celler knyttet til ledningen kan gjøres med det beskrevet lav-volumet tilnærming (se 2.3.). Forskjeller mellom linjer er å forvente, hastighet egnet cellen tettheter for lading ledningen, rotasjon samt inkubasjonstiden må testes empirisk ved å evaluere antall tilknyttede celler ved hjelp av en immunofluorescence mikroskop.
For genomisk nedstrøms programmer på én celle nivå WGA, kreves. WGA metoden for valg kan variere mellom laboratorier, og i prinsippet vår metode er åpen for alle metoder enn kan håndtere prøver innhentet fra micromanipulation eller laser microdissection. I denne protokollen bruker vi en metode basert på enzymatisk fragmentert DNA på grunn av en bedre ytelse i forhold til en varme-fragmentering basert WGA7. Valgfritt, enkelt celler kan bli videresendt til isotermiske WGA slik at etterfølgende DNA profilering20,21.
Beskrevet protokollen tar sikte på å gjenopprette intakt celler etter å være knyttet til en ny generasjon functionalized ledninger for genomisk encellede analyse. Den første generasjonen av functionalized ledninger, som også representerer berikelse bare CE-godkjent i vivo enheter på markedet så langt, ble brukt for opplisting CTCs i metastasized kreftpasienter. Tidligere publikasjoner og våre egne data tyder isolasjon i vivo teknikk for å være mer følsomme forhold til gjeldende gullstandarden teknologi2. Derfor kan utstyre denne i vivo isolasjon teknikken med en funksjon for gjenoppretting som realiseres i enheten kombinere høy CTC utvinning med karakterisering på encellede nivå.
Men enheten fjernes ikke for bruk i pasienter, dermed kliniske data er ikke tilgjengelig. Ex vivo programmer (dvs. isolere CTCs fra perifert blod etter utvalg) anbefales ikke som teknologien er tilpasset innstillingene i cubital forgjeves, f.eks lav diameteren på den forgjeves (øke sannsynligheten for direkte kontakt mellom CTCs og fange antistoffer) og lange tiden (30 min, slik at 2-3 L blod skjedde ledningen). Men som beskrevet i delen 2.2. målcellene kan også være isolert fra blandet prøver7.
En gjeldende begrensning av metoden er ineffektiv utvinning av unfixed celler etter løsgjøring fra ledninger. Dette kan imidlertid forbedres ved en celle fiksering trinn før avdeling behandling.
I sammendraget er denne protokollen et første skritt mot kombinert bruk av en i vivo isolasjon teknikk med celle utvinning for å karakterisere genmodifiserte enkeltceller. Ytterligere innsats må ta optimalisering av celle utvinning og klarering for dens anvendelse i pasienter1,2. Personlig medisin for behandling overvåking og terapi beslutninger er imidlertid utover opplisting av CTCs. Dermed er denne metoden et første skritt mot genomisk CTC karakterisering på enkeltcelle nivå.
Søknader mot encellede transcriptome analyse synes mulig som intakt celler er høstet. Men gjenstår det å bli vurdert om utvinne prosedyren har en innvirkning på RNA integritet (f.eks videresending gjenopprettede enkeltceller til direkte lyse etterfulgt av RT-qPCR22). Hvis karakteristikk av enkeltceller (f.eks CTCs) kan bli forskjøvet til transcriptome nivå, slik at mer detaljerte analyser. I denne forbindelse, RNA-seq bruker Smart-seq2 gir et verdifullt verktøy for RNA nedstrøms analyse av enkeltceller som preamplified cDNA (innhentet under RNA-seq biblioteket forberedelse) kan utsettes for kvantitative PCR. Dette vil tillate en kombinert mål og screening-basert analyse av enkeltceller gjenopprettede22,23.
Gjeldende functionalized ledninger er basert på anti-EpCAM antistoffer som er en mye brukt epithelial for positiv utvalg av CTCs24. Som flere CTCs kan downregulate epitel markører som cytokeratins eller EpCAM25, vil legge antistoffer som HER2/nye øke sjansen for CTC isolasjon. Flere antistoff basert berikelse strategier er utviklet og gjennomgått av Ferreira et al. i 201626. En blanding av antistoffer immobilisert på en wire kan være en fremtidig forbedring av teknologien fører til isolasjon av mange og flere undergrupper av CTCs.
Det er obligatorisk for alle foranstaltningene innvolvere wire håndtering for å holde den funksjonelle delen av ledningen neddykket i løsning for å opprettholde sin funksjonalitet. Vi anbefaler for å plassere ledningen i 1 x PBS under evaluering (mikroskop; f.eks. trinn 3.1. -3.3.) og lagring. For å unngå upassende flekker, anbefaler vi nymalt forberedt flekker løsning i trinn 1.2.1. og 1.2.2. Svakt farget celler hemmer celle teller på ledningen og kan føre til undervurdering av tilknyttede cellene.
Er det nødvendig å unngå koble Pasteur pipette med gummi cap når setter inn ledningen i Pasteur pipette for påfølgende lasting av cellen suspensjon (trinn 2.3.4.). Gummi cap brukes til å holde wire på plass slik at den funksjonelle delen ligger inni tuppen av Pasteur pipette. Hvis hetten er tilknyttet for fast på baksiden av Pasteur pipette, er lasting av cellen suspensjon ikke mulig. I dette tilfellet lette hetten slik at luften som er fortrengt av lastet celle suspensjon kan la pipette.
Bøye ledningen er avgjørende for retningen under cellen teller i trinn 3.2. og 3.3. Montere ledninger med teip slik at ikke-fungerende slutten av ledningen kommer å ligge på en side. Etter skanning av hele lengden av funksjonelle rulles ledningen 180° så den andre halvdelen av funksjonelle ledningen kan skannes. Dette trinnet er viktig for initial eksperimenter å vurdere antall celler på ledningen. Når antall celler for en bestemt celle linje og prosedyre evalueres, fremgangsmåten kan gjentas uten celle teller (f.eks. bare sjekke for tilstedeværelsen av celler eller utelate dette trinnet). Forsiktig pipettering er avgjørende for å unngå tap av cellen når redusere volumet av nedbryting i trinn 4.8. Sikre pipettering gjøres jevnt uten å forårsake turbulens å pellet.

Nylig ble CellCollector DC01, en medisinsk wire functionalized med anti-EpCAM antistoffer for å isolere CTCs fra perifert blod av pasienter, lagt til metodisk spekteret av CTC opplisting1,2,3 . I en pågående studie i ikke-metastatisk prostatakreft, denne functionalized wire rapporter nesten dobbelt så mange pasienter skal CTC-positive og høyere CTC teller i CTC-positive pasienter i forhold til CellSearch, gullstandarden i CTC opplisting3 . På grunn av denne oppmuntrende ytelse, isolering av celler fra en functionalized medisinske wire for én celle analyse ville være ønskelig, men verken enzymatisk behandling med cellen avdeling løsninger (f.eks trypsin) eller laser microdissection tillater utvinning av intakt celler (data ikke vist).
Hvis brøkdel av fanget celler, var en ny generasjon functionalized ledninger utstyrt med en bestemt polymer. Dette polymer, som forbinder fange antistoffer til ledningen, er utsatt for utgivelsen buffer behandling slik at avdeling av intakt celler (CellCollector DC03 referert til som enhet). Nye functionalized enheten lar isolering av målcellene fra ulike konsentrasjoner av cellen linje kreftceller piggete i bovin serum albumin (BSA) / fosfat bufret saltvann (PBS) og perifert blod, henholdsvis.
For å lette visuell gjenkjenning av celler på enheten og etter utvinning, målet kreftceller er merket med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) og en DNA flekk før utvinne behandling (dvs. lading og frakobling). Behandlings effekter på DNA kvaliteten på enkeltceller ble tidligere vurdert etter WGA ved hjelp av en kvalitetskontroll PCR4,5, matrise-CGH6,7 og målrettet sekvensering7 viser ingen forskjell sammenlignet med ikke-behandlet celler micromanipulated celle suspensjoner7. Fordelen med denne metoden ligger i kombinasjonen av sjeldne målcellen pre berikelse og utvinning av celler i én celle nedstrøms analyse (figur 1). Gjeldende CE-merket i vivo samlingen enheten brukes vanligvis for opplisting av CTCs i stedet for én celle molekylær karakterisering2,8. Men mer omfattende analyse å undersøke heterogenitet blant CTCs etter analyse på enkeltcelle nivå (i.e. målrettet sekvensering på encellede nivå). Andre cellebasert metoder er basert på immunomagnetic isolasjon av EpCAM-positive CTCs og encellede håndtering basert på dielectrophoresis for påfølgende molekylær genetisk analyse9,10. Molekylær karakterisering av CTCs er en viktig forutsetning for gjennomføring deres nyttig i en klinisk setting og er like viktig i grunnleggende forskning av metastatisk kaskade. Parallelt med CTCs, har sirkulerende svulst DNA (ctDNA) blitt av stor betydning da DNA-analyse av tumor byrden med minimal teknisk isolasjon prosedyrer11,12. Cellen basert tilnærminger kan tjene som et supplerende bidrag som gjør det mulig for RNA13,14 og protein15 uttrykk analyse og også for CTC avledet celle kulturer eller xenografts16, 17. selv om hindringer som lav celle utvinning og klarering for bruk i pasienter fremdeles må overvinnes, Fang og slipp metoden tar et viktig neste skritt mot karakteristikk av sjeldne målcellene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

Sjeldne målcellene kan isoleres fra en høy bakgrunn av ikke-målet celler ved hjelp av antistoffer spesifikke for overflate proteiner av målcellene. En nylig utviklet metoden bruker en medisinsk wire functionalized med anti-epitelial celle vedheft molekyl (EpCAM) antistoffer i vivo isolering av sirkulerende tumor celler (CTCs)1. En pasient-matchet kohort i ikke-metastatisk prostatakreft viste at i vivo isolasjon teknikken resulterte i en høyere prosentandel av pasienter positiv for CTCs samt høyere CTC teller i forhold til gjeldende gullstandarden i CTC opplisting. Som cellene kan gjenopprettes fra gjeldende medisinsk utstyr, ble en ny functionalized wire (referert til som enhet) produsert slik at fangst og påfølgende avdeling av celler av enzymatisk behandling. Cellene kan feste til enheten, visualisert på et mikroskop og frittliggende bruke enzymatisk behandling. Gjenopprettede celler er cytocentrifuged på membran-belagt lysbilder og høstet individuelt ved hjelp av laser microdissection eller micromanipulation. Encellede prøver er så utsatt for encellede hele genomet forsterkning tillater flere nedstrøms analyse inkludert sortering og mål-spesifikke tilnærminger. Prosedyren for isolasjon og gjenoppretting gir høy kvalitet DNA fra enkeltceller og svekke ikke påfølgende hele genomet forsterkning (WGA). En enkeltcelle forsterket DNA kan videresendes til screening og/eller målrettet analyse som matrise sammenlignende genomet hybridisering (matrise-CGH) eller sekvenser. Enheten kan ex vivo isolasjon fra kunstig sjeldne celle prøver (i.e. 500 målcellene piggete i 5 mL av perifert blod). Mens avdeling celler er akseptabel (50-90%), utvinningsgrad på frittstående celler på lysbilder spenner over en rekke som er avhengige av cellen linjen brukes (< 10 - > 50%) og trenger litt mer oppmerksomhet. Denne enheten er ikke fjernet for bruk i pasienter.

Cellene etter CFSE og nukleinsyre flekker kan evalueres ved hjelp av en immunofluorescence mikroskop utstyrt med filtre for DAPI og FITC. Kjerner presenterer en lyse counterstain i DAPI kanalen mens cytoplasma cellene Vis uniform merking med CFSE med heterogene mellom cellen intensitet (figur 2A og 2E). Lignende form og flekker intensiteter er forventet fra celler knyttet til ledningen (figur 2B og 2F) samt løsrevet fra ledningen og gjenopprettet på et lysbilde (figur 2D og 2 H).
Høyt tettheter (f.eks > 1 000 000 celler/mL) kan føre til total dekning av ledningen med celler når lading ledningene. Imidlertid lavere celle tettheter, endringer i rotasjonshastighet under inkubasjonen, og bruk av ulike cellelinjer påvirker isolasjon effektiviteten og må testes separat. Når ledningene ble inkubert med 5 mL HT-29 cellene på 100 000 celler / mL som beskrevet i Seksjon 2.1., et gjennomsnitt på 254 ± 103 celler (n = 5) ble tatt på ledninger. Med samme eksperimentere med LNCaP celler, et gjennomsnitt på 440 ± 319 celler (n = 5) per wire ble innhentet.
Presentere 500, 5 000 og 50 000 HT-29 celler i en bakgrunn av 5 mL av perifert blod ledninger (i henhold til protokollen delen 2.2.) resulterte i erobringen av 75 ± 18 celler, 25 ± 9 celler og 47 ± 57 celler (n = 3, hver), henholdsvis. Hvis kabelen belastes med 15 µL av cellen suspensjon (1 000 000 celler/mL) i henhold til protokollen i avsnitt 2.3., opp til 1000 innbyggere (HT-29) celler fester seg til en ledning.
Celle avdeling effektivitet varierte fra 81% i HT-29 celler (rekkevidde 54.9 – 93.2%, og n = 5) 81% (varierer 63.51 – 92.87%, n = 6) og 91% (varierer 84.7 – 95.3%, n = 6) i LNCaP og VCaP celler, henholdsvis. Tilsvarende utvinning av frittstående celler skiller mellom linjer: et gjennomsnitt på 28% av frittstående HT-29 celler gjenvunnet ved cytocentrifugation. Mens utvinningsgrad for LNCaP var lavere enn 10%, var mener utvinningsgrad for VCaP cellene 55%.
Ca 75% av enkeltceller utsatt for avkastning på WGA kvalitetsprodukter WGA: Dette er 1) smøre WGA produkter spenner fra 0,1 til > 1 kb (4 figur, toppanelet) og 2) tre eller fire band i 4plex kvaliteten kontroll PCR (Figur 4, nedre panelet) . WGA produkter benyttes for 1) matrise-CGH profilering møte kvalitetskriterier for enkeltceller matrise-CGH profiler 6,7 og 2) målrettet NGS etter re forsterkning WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figur 1: arbeidsflyt for isolering og gjenoppretting målcellene for én celle analyse. (A) celler er kultivert til 90% confluency, og (B) høstet for å få en enkeltcelle suspensjon. Etter farging med CFSE og kan flekken, (C) functionalized ledningen er ruges i nærvær av cellene i et volum på 5 mL bruker reaksjon rør eller et lavt volum bruker et Pasteur pipette tips. Sistnevnte gir anvendelse av cellen suspensjon volumer så lite som 15 µL. (D) celler må kobles innen 4 timer etter lading. Derfor plasseres wire i en 1,5 mL reaksjon rør fylt med utgivelsen buffer. Etter 15 min incubation rocker og 10 min sentrifugering, wire fjernes, og cellen suspensjon er centrifuged for å pellets cellene. (E) gjenopprettet celler enten overført til et glass lysbilde for én celle micromanipulation (øverst) eller cytocentrifuged på en membran-belagt lysbilde og sendt for å laser microdissection (nederst). (F) til slutt høstet enkeltceller er forsterket med hele genomet forsterkning (WGA). WGA-produkter er kompatible med array-CGH og målrettet NGS nedstrøms analyse. EpCAM epitope: grønn sirkel celleoverflaten. Functionalized ledning: enhet, grå trippel-spiralformede ledninger. Polymer: lilla linjer. Anti-EpCAM antistoffer: oransje. Slipp buffer aktivitet: rød pil. Fett merke å holde celle suspensjon på plass: mørk blå ellipse. Gjenopprettet celle suspensjon: lys blå. Kapillær for micromanipulation: svart linje. Forstørrelse: gjenopprettede celle høstet av micromanipulation, cytospin på membran-dekket Skyv inneholder gjenopprettede celler (grå fylt ellipse). Forstørrelse: gjenopprettede cellen blir laser microdissected (grå sirkulær linje: membranen fra membranen lysbilde som ryggraden for laser microdissection), objektiv med laserstrålen (blå linje nærmer membran lysbildet nedenfor). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figur 2: visualisere merkede celler. (A, E) Celler før lading: celler er merket med CFSE og counterstained med en DNA intercalating fargestoff viser et utvalg av CFSE (grønn) signal intensitet. (B,F) Merkede celler på ledningen. (C,G) Wire etter celle-avdeling. (D,H) Celler løsrevet fra wire og av cytocentrifugation på et lysbilde. CFSE: FITC kanal (grønn). DNA flekk: DAPI kanal (blå). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figur 3: Wire og lagringen avlukke. (A) deler av ledningen. (B) detaljer av functionalized. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figur 4: kvalitetskontroll av WGA produkter innhentet fra enkelt micromanipulated celler. Topp panel: WGA produkter fra enkeltceller vanligvis resulterer i DNA celleprøver mellom 0,2 kb > 1.0 kb med en topp intensitet rundt 0,5 kb. Prøver nummer 1, 7 og 13 (angitt med stjernene) Vis suboptimal eller ingen DNA smøres utover. Nedre panelet: WGA produktene er av tilstrekkelig kvalitet hvis 4plex PCR gir tre eller fire av fire PCR-produkter (på 100, 200, 300 og 400 bp). Prøver 1, 7, 10 og 13 vise færre enn tre bånd og ekskluderes fra videre analyse. Lane M inneholder en 100 bp stige og stjernene indikerer prøvene av utilstrekkelig WGA produktkvalitet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer sekvens</td>
			<td>MERK</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3</td>
			<td>100 bp frem primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3</td>
			<td>100 bp omvendt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tgg agc kneble gct agc-3</td>
			<td>200 bp frem primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3</td>
			<td>200 bp omvendt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3</td>
			<td>300 bp frem primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-tcc handle aac cag tca gcg tc-3</td>
			<td>300 bp omvendt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-aca gtc katten gcc atc handle gc-3</td>
			<td>400 bp frem primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 '-gct tga caa agt ggt cgt vs-3</td>
			<td>400 bp omvendt primer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Primer sekvenser for 4plex kvalitetskontroll PCR

Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Denne protokollen er å komme seg og forberede sjeldne målcellene fra en blanding med ikke-mål bakgrunn celler for molekylær genetisk karakterisering på encellede nivå. DNA kvalitet er ikke behandlet enkeltceller og tillater encellede program (begge screening basert og målrettet analyse).

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakteristikk av cellemembranen utvidelser og studere deres roller i kreft celle vedheft Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flowcytometri med fluorescerende celle Barcoding for enkelt celle signalisering analyse og biomarkør oppdagelsen

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur og kryopreservering av Esophageal Adenocarcinoma Organoider: Fordeler og ulemper for fordøyelsen med én celle

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisk tumor organoid narkotika screening ved hjelp av Widefield Live-Cell Imaging for bulk og single-organoid analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed Barcoding bildeanalyse for immunprofilering og romlig kartlegging karakterisering i enkeltcelleanalyse av parafinvevsprøver

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...