Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Este estudio fue financiado por el fondo austriaco de ciencia (FWF), proyecto no. Me 1220-B19 (para PS) como parte del Proyecto ERANET en cáncer traslacional investigación (TRANSCAN) "Células tumorales de circulación como biomarcador para la enfermedad Residual mínima en cáncer de próstata (CTC-SCAN)". Candidato a doctor S.C. fue entrenado en el marco de la Medicina Molecular del programa de doctorado de la Universidad médica de Graz. Los autores reconocen con gratitud Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz y Johanna Schiller su asistencia técnica experta. Los autores agradecen a Georg Peinhaupt para apoyo de diseño gráfico.

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	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Gorges, T. 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R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Challenges+of+Liquid+Biopsies.">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Ferreira, M. 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Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito tiene como objetivo recuperar las células de un alambre funcionalizado (denominado dispositivo) para análisis genómico ex vivo unicelular. Probamos tres EpCAM positivo las líneas celulares (HT-29, LNCaP y VCaP), pero en principio, este método puede aplicarse a cualquier línea celular expresando EpCAM. Células diana EpCAM positivos pueden presentarse al dispositivo de suspensión celular puro (ver 2.1.) o mezclado en un exceso de células de fondo (por ejemplo. periférico sangre, ver 2.2.). Mientras que sobre todo este último podría utilizarse para probar la capacidad de aislamiento en condiciones raras de la célula, puesta a punto del número de las células conectado al cable puede hacerse usando el bajo volumen descrito acercamiento (ver 2.3.). Como diferencias entre las líneas celulares son de esperarse, densidad celular adecuado para cargar el cable, rotación velocidad, así como tiempo de incubación tiene que comprobarse empíricamente, evaluando el número de células conectados usando un microscopio de inmunofluorescencia.
Para aplicaciones posteriores genómicas a nivel unicelular WGA, se requiere. El método WGA de elección puede diferir entre laboratorios y, en principio, nuestro método está abierto a todos los métodos que puede manejar las muestras obtenidas de Microdisección láser o micromanipulación. En este protocolo, utilizamos un método basado en ADN fragmentado enzimáticamente debido a un mejor rendimiento en comparación con un calor-fragmentación basado en WGA7. Opcionales, solo las células pueden enviarse a WGA isotermo permitiendo posterior DNA profiling20,21.
El protocolo descrito tiene como objetivo recuperar las células intactas después de ser unido a una nueva generación de cables funcionalizados para análisis genómico unicelular. La primera generación de cables funcionalizados, que también representan a los dispositivos de enriquecimiento sólo CE-aprobados en vivo en el mercado hasta ahora, fueron utilizada para la enumeración de CTC en pacientes con metástasis de cáncer. Publicaciones anteriores y nuestros datos sugieren que la técnica de aislamiento en vivo para ser más sensibles en comparación con el estándar de oro actual tecnología2. Así, equipando esta técnica de aislamiento en vivo con una función de recuperación cuando se dio cuenta en el dispositivo permite combinar la alta recuperación CTC con la caracterización a nivel unicelular.
Sin embargo, no se borra el dispositivo para el uso en pacientes, por lo tanto, los datos clínicos no están disponibles. Aplicaciones ex vivo (es decir, aislar CTCs de la sangre periférica después de muestreo) no son recomendables como la tecnología se adapta a la configuración presente del cubital inútil, por ejemplo bajo diámetro del vano (aumento de la probabilidad de directa de contacto entre el CTC y los anticuerpos de captura) y tiempo de retención largo (30 minutos, permitiendo que 2-3 L de sangre pasar el cable). Sin embargo, como se describe en la sección 2.2. las células de blanco también pueden ser aisladas de muestras mixtas7.
Una limitación actual del método es la ineficiente recuperación de células no fijadas después de la separación de los cables. Esto, sin embargo, podría mejorarse mediante un paso de fijación de la célula antes del tratamiento de la separación.
En Resumen, este protocolo es un primer paso hacia el uso combinado de una técnica de aislamiento en vivo con la recuperación de la célula para caracterizar genéticamente las células. Sus esfuerzos tienen que abordar la optimización de la recuperación de la célula y espacio para su aplicación en pacientes de1,2. Sin embargo, la medicina personalizada para las decisiones de control y terapia de tratamiento es más allá de la enumeración de los CTC. Así, este método es un primer paso hacia la caracterización genómica de CTC en el nivel unicelular.
Aplicaciones para análisis de transcriptoma unicelular parecen factibles como se cosechan las células intactas. Sin embargo, queda por evaluar si el procedimiento de recuperación tiene un impacto sobre la integridad del RNA (e.g. expedición recuperado las células a la lisis directa seguida por RT-qPCR22). Si tiene éxito, caracterización de las células (por ejemplo, CTC) puede cambiar de puesto al nivel de transcriptoma, permitiendo análisis más detallados. En este sentido, RNA-seq usando Smart-Sec2 proporciona una herramienta valiosa para posterior análisis del ARN de las células como el cDNA activos (obtenido durante la preparación de la biblioteca de RNA-seq) puede ser sometido a la PCR cuantitativa. Esto permitirá un objetivo combinado y análisis basado en la proyección de las células recuperadas22,23.
Los actuales cables funcionalizados se basan en anticuerpos anti-EpCAM que es un marcador epitelial ampliamente utilizado para la selección positiva de CTC24. Como varios CTC downregulate marcadores epiteliales citoqueratinas como EpCAM25, añadiendo anticuerpos como HER2/nueva aumentaría las posibilidades de aislamiento de la CTC. Varios anticuerpos basado en enriquecimiento de estrategias han sido elaboradas y revisados por Ferreira et al. en el 201626. Una mezcla de anticuerpos inmovilizados en un alambre podría ser una futura mejora de la tecnología líder para el aislamiento de un número más alto y subtipos adicionales de CTC.
Es obligatorio para todos los pasos de alambre manipulación para mantener la parte funcional del alambre sumergido en la solución para mantener su funcionalidad. Le recomendamos que coloque el cable de 1 x PBS durante la evaluación (microscopio; por ej. 3.1 los pasos. -3.3.) y almacenamiento de información. Con el fin de evitar que se manchen inadecuado, recomendamos usar recién preparado solución de tinción en pasos 1.2.1. y 1.2.2. Células débil obstaculizan el celular con el cable y pueden llevar a la subestimación de las células adjuntas.
Es necesario evitar conectar la pipeta Pasteur con el tapón de goma al insertar el cable de la pipeta Pasteur para la posterior carga de la suspensión celular (paso 2.3.4.). El tapón de goma se utiliza para sostener el cable en su lugar para que la parte funcional se encuentra dentro de la punta de la pipeta de Pasteur. Si la tapa se une demasiado firmemente a la parte posterior de la pipeta de Pasteur, carga de la suspensión de células no es posible. En este caso, facilitar la tapa que el aire que es desplazado por la suspensión de células cargadas puede dejar la pipeta.
El cable de la flexión es fundamental para su orientación durante la célula contando pasos 3.2. y 3.3. Monte los cables con la cinta adhesiva, tal que al final no funcional del alambre viene a mentir a un lado. Después de la digitalización de toda la longitud de la parte funcional, el alambre se enrolla 180° por lo que la otra mitad del cable funcional puede digitalizarse. Este paso es importante para los experimentos iniciales determinar el número de células en el alambre. Una vez que se evalúa el número de células de un determinado procedimiento y línea celular, el procedimiento se puede repetir sin contar a la célula (ej. sólo comprobando la presencia de células u omitir este paso). Pipeteo cuidadoso es fundamental para evitar la pérdida de la célula al reducir el volumen del sobrenadante en el paso 4.8. Asegúrese de pipeteo se realiza suavemente sin causar turbulencias a la pelotilla.

Recientemente, CellCollector DC01, un alambre médico funcionalizado con anticuerpos anti-EpCAM para aislar CTCs de sangre periférica de pacientes con cáncer, fue agregado a la gama metódica de CTC enumeración1,2,3 . En un estudio actualmente en curso en cáncer de próstata no metastásico, este cable funcionalizado divulga a casi dos veces tantos pacientes CTC-positivas y mayor CTC cuenta en CTC-pacientes positivos en comparación con CellSearch, el estándar de oro para enumeración CTC3 . Debido a este alentador desempeño, aislamiento de las células de un alambre médico funcionalizado para el análisis unicelular sería deseable, pero tratamiento enzimático con soluciones de separación celular (por ejemplo, tripsina) ni Microdisección láser permite la recuperación de las células intactas (datos no mostrados).
Para permitir la separación de las células capturadas, una nueva generación de cables funcionalizados fue equipada de un polímero específico. Este polímero, que une a los anticuerpos de captura con el alambre, es susceptible a un tratamiento de buffer de liberación que permite la separación de las células intactas (CellCollector DC03 denominado dispositivo). El nuevo dispositivo funcionalizado, permite el aislamiento de las células de la blanco de varias concentraciones de células de cáncer de la célula línea muestras mezcladas, albúmina de suero bovino (BSA) / fosfato tampón salino (PBS) y sangre periférica, respectivamente.
Para facilitar la detección visual de las células en el dispositivo y después de la recuperación, las células de cáncer blanco son etiquetadas con éster de succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) y una mancha de ADN antes del tratamiento de recuperación (es decir. carga y desmontaje). Los efectos del tratamiento sobre la calidad del ADN de las células previamente fueron evaluados después de WGA por medio de un control de calidad PCR4,5, array-CGH6,7 y dirigido la secuencia7 no mostrando ninguna diferencia comparados con no tratados las células micromanipulated de suspensiones de células7. La ventaja de este método radica en la combinación de enriquecimiento previo rara de célula diana y la recuperación de las células unicelulares análisis aguas abajo (figura 1). El actual dispositivo de recolección con etiqueta CE en vivo es generalmente usado para recuento de CTC en lugar de caracterización molecular de la célula de solo2,8. Sin embargo, análisis más exhaustivo para investigar la heterogeneidad entre los CTCs para análisis a nivel de células individuales (es decir, dirigida la secuencia en el nivel unicelular). Otros métodos basados en la célula se basan en el aislamiento Inmunomagnética de CTC EpCAM positivos y manejo sola célula basado en dielectroforesis para posterior análisis genético molecular9,10. Caracterización molecular de CTC es un requisito importante para su aplicación útil en un ajuste clínico y es igualmente importante en la investigación básica de la cascada metastásica. En paralelo a la CTC, ADN tumoral circulante (ctDNA) se ha convertido en de gran importancia ya que permite el análisis de la DNA de la carga del tumor con mínimo aislamiento técnico procedimientos11,12. Los enfoques de base de la célula podrían servir como un aporte complementario que permite RNA13,14 y proteína15 análisis de la expresión y también para CTC derivan célula culturas o xenoinjertos16, 17. aunque todavía necesitan superar obstáculos tales como recuperación de la célula bajo y espacio para el uso en pacientes, el método de captura y liberación toma un importante paso hacia la caracterización de las células blanco raro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

Células blanco raro pueden ser aisladas de un alto fondo de células no objetivo utilizando anticuerpos específicos para proteínas de la superficie de las células diana. Un método recientemente desarrollado utiliza un alambre médico funcionalizado con anticuerpos de molécula (EpCAM) de adherencia de célula epitelial contra en vivo aislamiento de circulación tumor células (CTC)1. Una cohorte emparejado de paciente en cáncer de próstata no metastásico demostró que la técnica de aislamiento en vivo resultó en un mayor porcentaje de pacientes positivos para CTC, así como mayor CTC cuentas en comparación con el patrón oro en enumeración de CTC. Como las células no pueden ser recuperadas de los dispositivos médicos actuales, fue fabricado un nuevo cable funcionalizado (denominado dispositivo) lo que permite la captura y posterior desprendimiento de las células por tratamiento enzimático. Las células están autorizadas a conectar al dispositivo, visualizados en el microscopio y separada mediante tratamiento enzimático. Las células recuperadas son cytocentrifuged en portaobjetos recubiertos con membrana y cosechan individualmente mediante Microdisección láser o micromanipulación. Sola célula muestras son entonces sometidas a amplificación sola célula genoma permitiendo múltiples análisis aguas abajo como métodos de screening y específico del destino. El procedimiento de aislamiento y recuperación produce alta calidad de ADN de las células y no impide la amplificación del genoma entero posterior (WGA). ADN amplificado de una sola célula puede enviarse a proyección o dirigida análisis de hibridación genómica comparativa de matriz (array-CGH) como secuencia. El dispositivo permite ex vivo aislado de muestras de células raras artificial (es decir 500 células blanco tacon en 5 mL de sangre periférica). Mientras que las tasas de desprendimiento de las células son aceptable (50-90%), la tasa de recuperación de células separadas en diapositivas abarca una amplia gama depende de la línea celular utilizada (< 10 - > 50%) y necesita más atención. Este dispositivo no se despejó para el uso en pacientes.

Las células después de CFSE y tinción nucleicos pueden evaluarse usando un microscopio de inmunofluorescencia equipado con filtros DAPI y FITC. Los núcleos presentan un contraste brillante en el canal DAPI mientras que el citoplasma de las células muestran etiquetado uniforme con CFSE con intensidad de entre célula heterogénea (figura 2A y 2E). Forma y coloración de intensidades similares son esperados de las células conectadas al cable (figura 2B y 2F) así como desprende el cable y recuperados en un portaobjetos (Figura 2D y 2 H).
Las densidades de célula alta (por ejemplo > 1 000 000 células/mL) puede resultar en cobertura total del alambre con las células de carga de los cables. Sin embargo, reducir las densidades de célula, cambios en la velocidad de rotación durante la incubación y el uso de diferentes líneas celulares afectan la eficiencia de aislamiento y deben analizarse por separado. Cuando los cables se incubaron con 5 mL de células HT-29 en el de 100 000 células / mL como se describe en la sección 2.1., una media de 254 ± 103 células (n = 5) fueron capturados en los cables. Con el mismo experimento usando las células LNCaP, una media de 440 ± 319 células (n = 5) por cable se obtuvo.
Presentar células HT-29 500, 5 000 y 50 000 en un fondo de 5 mL de sangre periférica a los cables (según protocolo de sección 2.2.) resultó en la captura de 75 ± 18 células, 25 ± 9 células y células ± 57 47 (n = 3, cada uno), respectivamente. Si el cable está cargado con 15 μl de suspensión celular (1 000 000 células/mL) según el protocolo en la sección 2.3., hasta 1 000 (HT-29) las células pueden unir a un cable.
Eficiencias de separación osciló entre el 81% en las células HT-29 de la célula (gama 54,9% y 93.2% y n = 5) al 81% (gama 63.51% - 92.87%, n = 6) y el 91% (rango de 84,7% y 95,3%, n = 6) en LNCaP y VCaP células, respectivamente. Del mismo modo, la recuperación de células separadas difiere entre líneas celulares: una media de 28% de células HT-29 chalets fueron recuperados por citocentrifugación. Mientras que la tasa de recuperación de LNCaP fue inferior al 10%, la tasa de recuperación media para las células VCaP fue 55%.
Aproximadamente el 75% de las células sometidas a productos de WGA WGA rendimiento de alta calidad: esto es 1) borrón de transferencia de productos WGA desde 0.1 a > 1 kb (figura 4, panel superior) y 2) tres o cuatro bandas de calidad 4plex controlan PCR (figura 4, panel inferior) . Productos WGA se pueden utilizar para 1) array-CGH perfiles cumplen con los criterios de calidad para single-cell array-CGH perfiles 6,7 y NGS 2) objetivo después de la amplificación WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figura 1: flujo de trabajo para aislar y la recuperación de las células de la blanco para el análisis unicelular. (A) las células se cultivan para el 90% de confluencia y (B) cosechadas para obtener una suspensión unicelular. Después de la tinción con CFSE y mancha de nucleico, (C) el cable funcionalizado se incuba en presencia de las células en un volumen de 5 mL en tubos de reacción o en un volumen bajo, utilizando una pipeta Pasteur. Este último permite para aplicación de volúmenes de suspensión celular tan bajas como 15 μl. (D) células necesitan ser separadas dentro de 4 h después de la carga. Por lo tanto, el cable se coloca en un tubo de reacción de 1,5 mL con buffer de liberación. Después de la incubación de 15 minutos en un eje de balancín y centrifugación de 10 minutos, se retira el cable y la suspensión se centrifuga para que sedimenten las células. (E) recuperan las células son o transfiere a un portaobjetos de vidrio para micromanipulación unicelular (arriba) o cytocentrifuged un portaobjetos recubierto de membrana y remitió a láser microdissection (abajo). (F) finalmente, las células recolectadas se amplifican por medio de la amplificación del genoma (WGA). Productos WGA son compatibles con el array-CGH y objetivo análisis descendente de NGS. EpCAM epitopo: círculo verde en la superficie de la célula. Funcionalizados cable: dispositivo, de alambres helicoidal triple gris. Polímero: líneas moradas. Anticuerpos anti-EpCAM: naranja. Liberar la actividad buffer: flecha roja. Marcador de grasa para mantener la suspensión de células en su lugar: elipse azul oscuro. Recuperado de suspensión celular: azul claro. Capilares para micromanipulación: Negro línea. Ampliación: celular recuperado por micromanipulación, cytospin en membrana diapositiva que contienen células recuperadas (elipse llena gris). Ampliación: celular recuperado siendo láser microdissected (línea circular gris: membrana de diapositiva de membrana que sirven como columna vertebral para Microdisección láser), objetivo con láser (línea azul a la diapositiva de la membrana de abajo). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figura 2: visualización de las células con. (A, E) Las células antes de la carga: las células son etiquetadas con CFSE y contratinción con un ADN intercalando tinte mostrando una intensidad de señal del rango de CFSE (verde). (B,F) Etiquetado células capturadas en el alambre. (C,G) De alambre después de procedimiento de separación celular. (D,H) Las células desprendidas de alambre y recuperaron por citocentrifugación en una diapositiva. CFSE: FITC el canal (verde). Tinción de DNA: canal DAPI (azul). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figura 3: alambre y conservación compartimiento conservación. (A) los compartimientos del alambre. (B) detalle de la parte funcionalizada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figura 4: control de calidad de productos WGA obtenida de células micromanipulated solo. Panel superior: productos WGA obtenidos de células típicamente resultado en ADN los borrones de transferencia que van desde 0,2 kb > 1,0 KB con una intensidad de pico en alrededor de 0,5 kb. Frotis de muestras número 1, 7 y 13 (indicadas con asteriscos) Mostrar subóptima o no ADN. Panel inferior: WGA productos son de calidad suficiente si la PCR 4plex produce tres o cuatro de cuatro productos PCR (100, 200, 300 y 400 bp). Las muestras 1, 7, 10 y 13 muestran menos de tres bandas y sería excluidas de su análisis posterior. Carril M contiene una escalera de bp 100 y los asteriscos indican las muestras de calidad de producto insuficiente de WGA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Secuencia de primer</td>
			<td>NOTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '</td>
			<td>primer avance de 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-ctc ctg gaa gat ggt Tag gg-3 '</td>
			<td>primer revés de 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mordaza de 5′-agg tgg agc TCG agc-3 '</td>
			<td>primer avance de 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-ttt ggt tgc gga aat gtc ct-3′</td>
			<td>primer revés de 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-agg tga gac att ctt gct gg-3 '</td>
			<td>primer avance de 300 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-tcc ley aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>300 cartilla reversa de bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-aca gtc gato gcc atc ley gc-3 '</td>
			<td>primer avance de 400 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 '</td>
			<td>primer revés de 400 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias de la cartilla para control de calidad 4plex PCR

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Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subcultivo y criopreservación de organoides del adenocarcinoma esofágico: pros y contras para la digestión unicelular

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Análisis de imágenes de código de barras multiplexadas para inmunoperfilado y caracterización de mapeo espacial en el análisis unicelular de muestras de tejido de parafina

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...