Name: target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Denna studie har finansierats av österrikiska Science fond (FWF), projekt-nr. Jag 1220-B19 (att P.S.) som en del av projektet ERANET i translationell Cancer Research (TRANSCAN) ”cirkulerande tumörceller som biomarkör för Minimal Residual sjukdom i prostatacancer (CTC-SCAN)”. Doktorand S.C. var utbildad inom ramen för den PhD Program molekylärmedicin vid medicinska universitetet i Graz. Författarna erkänner tacksamt Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz och Johanna Schiller för deras teknisk experthjälp. Författarna tackar Georg Peinhaupt för grafisk design stöd.

<ol>
	<li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire.">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells.">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li><li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients.">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li><li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples.">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li><li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA.">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li><li>M&#246;hlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH.">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+Release:+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire.">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck.">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li><li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer.">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li><li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer.">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection.">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li><li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer.">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li><li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma.">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells.">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li><li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting.">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622 (2017).</li><li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells:+a+clinical+case+study.">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li><li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer.">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322 (2016).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM.">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li><li>Czy&#380;, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells.">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR.">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li><li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification.">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li><li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., St&#229;hlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification.">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).</li><li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+Challenges+of+Liquid+Biopsies.">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+technologies.">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Protokollet beskrivs syftar till att hämta celler från en functionalized tråd (kallas enhet) för ex vivo encelliga genomisk analys. Vi testade tre EpCAM-positiva cellinjer (HT-29 LNCaP och VCaP), men i princip denna metod kan tillämpas på någon cellinje som uttrycker EpCAM. EpCAM-positiva målceller kan presenteras för enheten som ren cellsuspension (se 2.1.) eller blandad till ett överskott av bakgrunden celler (t.ex. perifera blod, se 2.2.). Särskilt den senare kan användas för att testa isolering kapacitet ovanlig cell villkor, fininställning av antalet celler som bifogas tråd kan göras med den beskrivna låg volymen närma (se 2.3.). Som skillnader mellan cellinjer kan förväntas, hastighet passande cell densiteter för laddning tråd, rotation samt inkubationstiden behöver testas empiriskt genom att utvärdera antalet bifogade celler använder ett immunofluorescens Mikroskop.
För genomisk nedströms tillämpningar på enskild cell nivå WGA, krävs. Metoden WGA val kan variera mellan labs, och vår metod är i princip öppet för alla metoder än kan hantera produktproverna mikromanipulation eller laser lokalt. I detta protokoll använder vi en metod baserad på enzymatiskt fragmenterade DNA på grund av en bättre prestanda jämfört med en värme-fragmentering baserat WGA7. Tillval, enstaka celler kan vidarebefordras till isotermiska WGA så att efterföljande DNA profilering20,21.
Protokollet beskrivs syftar till att återvinna intakta celler efter att vara ansluten till en ny generation av functionalized ledningar för genomanalys encelliga. Den första generationen av functionalized trådar, som också företräder endast CE-godkända i vivo anrikning enheterna på marknaden hittills, användes för att räkna upp CTCs hos patienter med spridd cancer. Tidigare publikationer och våra egna uppgifter tyder på i vivo isolering tekniken för att vara känsligare jämfört med den nuvarande guldmyntfot teknik2. Således, utrusta denna i vivo isolering teknik med en recovery-funktionen som realiserat i enheten tillåter att kombinera hög CTC återhämtning med karakterisering på enskild cell nivå.
Men enheten rensas inte för användning hos patienter, således kliniska data är inte tillgängliga. Ex vivo applikationer (dvs. isolera CTCs från perifert blod efter provtagningen) rekommenderas inte eftersom tekniken är anpassad till inställningarna som är närvarande i kubiska förgäves, e.g. låg diametern av den fåfänga (ökar sannolikheten för direkt kontakt mellan CTCs och fästande antikroppar) och lång retentionstid (30 min, så att 2-3 L blod att passera tråd). Emellertid, som beskrivs i avsnitt 2.2. målceller kan också isoleras från blandade prover7.
Nuvarande begränsning för metoden är ineffektiva återvinning av ofixerade celler efter avskildhet från ledningarna. Detta kan dock förbättras genom en cell fixering steg före avlossning behandlingen.
Sammanfattningsvis är detta protokoll ett första steg mot den kombinerade användningen av en in-vivo isolering teknik med cell återhämtning för genetiskt kännetecknar enstaka celler. Ytterligare ansträngningar måste ta itu med optimering av cell återhämtning och clearance för dess tillämpning i patienter1,2. Personlig medicin för behandlingsbeslut övervakning och behandling är dock utöver uppräkning av CTCs. Denna metod är således ett första steg mot genomisk CTC karakterisering på enstaka cellnivå.
Program mot encelliga transkriptom analys verkar genomförbart intakta celler skördas. Det återstår emellertid prövas huruvida förfarandet återhämta inverkar på RNA integritet (t.ex. vidarebefordra återvunna enstaka celler till direkt Lys följt av RT-qPCR22). Om det lyckas, kan karakterisering av enstaka celler (t.ex. CTCs) skiftas till transkriptom nivå, så att mer detaljerade analyser. I detta avseende, RNA-seq använder Smart-seq2 ger ett värdefullt verktyg för RNA nedströms analys av enstaka celler som den förförstärkt cDNA (erhålls under RNA-seq bibliotek beredning) kan bli föremål för kvantitativa PCR. Detta gör att en kombinerad mål och screening-baserad analys av återvunna enkelceller22,23.
De nuvarande functionalized kablarna bygger på anti-EpCAM antikroppar som är en allmänt använd epitelial markör för positiva urval av CTCs24. Som flera CTCs kanske downregulate epiteliala markörer såsom typen eller EpCAM25, skulle lägga till antikroppar såsom HER2/nya öka chansen att CTC isolering. Flera antikropp baserat anrikning strategier har utvecklats och granskats av Ferreira et al. i 201626. En blandning av antikroppar orörlig på en tråd kan vara en framtida förbättring av den teknik som leder till isolering av ett högre nummer och ytterligare subtyper av CTCs.
Det är obligatoriskt för alla åtgärder som rör tråd hantering för att hålla den funktionella delen av tråden nedsänkt i lösningen för att bibehålla dess funktionalitet. Vi rekommenderar för att placera tråden i 1 x PBS under utvärderingen (Mikroskop; t.ex. steg 3.1. -3.3.) och lagring. För att undvika olämpliga färgning, rekommenderar vi att använda färska förberedda färglösningen i steg 1.2.1. och 1.2.2. Svagt färgade celler hämmar cellen räknar på tråd och kan leda till en underskattning av de bifoga cellerna.
Det är nödvändigt att undvika att ansluta den Pasteur-pipetten med gummi locket när du sätter i kabeln i den Pasteur-pipetten för efterföljande lastning av cellsuspensionen (steg 2.3.4.). Gummi locket används för att hålla vajern på plats så att den funktionella delen ligger innanför spetsen av den Pasteur-pipetten. Om den gemensamma jordbrukspolitiken är alltför ordentligt kopplad till baksidan av Pasteur pipetten, är lastning av cellsuspensionen inte möjligt. I detta fall lindra den gemensamma jordbrukspolitiken så att luften som är fördrivna av inlästa cellsuspensionen kan lämna pipetten.
Böja tråd är avgörande för dess orientering under cellen räknar steg 3,2. och 3.3. Montera kablarna med tejpen så att den icke-funktionella änden kommer att ligga på ena sidan. Efter skanning av hela längden av den funktionella delen, rullas kabeln 180° så den andra halvan av funktionella tråd kan skannas. Detta steg är viktigt för inledande experiment att bedöma antalet celler på linan. När antalet celler för en viss cell fodrar och procedur utvärderas, proceduren kan upprepas utan att cellen räkna (t.ex. endast kontroll förekomst av celler eller utelämna detta steg). Försiktig pipettering är avgörande att undvika cellförlust när minska volymen av supernatanten i steg 4,8. Kontrollera att pipettering görs smidigt utan att orsaka turbulensen på pelleten.

Nyligen lades CellCollector DC01, en medicinsk tråd functionalized med anti-EpCAM antikroppar för att isolera CTCs från perifert blod av cancerpatienter, till metodiskt spectrumen av CTC uppräkning1,2,3 . I en pågående studie med icke-metastaserande prostatacancer, denna functionalized tråd rapporterar nästan dubbelt så många patienter att vara CTC-positiv och högre CTC räknar i CTC-positiva patienter jämfört med CellSearch, guldmyntfoten i CTC uppräkning3 . På grund av detta uppmuntrande resultat, isolering av celler från en functionalized medicinsk tråd för encelliga analys vore önskvärt, men varken enzymatisk behandling med cell avlossning lösningar (t.ex. trypsin) eller laser lokalt tillåter återvinning av intakta celler (inga data anges).
För att möjliggöra avskildheten av fångade celler, var en ny generation av functionalized ledningar utrustad med en specifik polymer. Denna polymer, som länkar de fånga antikropparna till tråd, är mottagliga för en release buffert behandling möjliggör avlossning av intakta celler (CellCollector DC03 kallas enhet). Den nya functionalized enheten, kan isolering av målceller från olika koncentrationer av cancerceller cell linje spetsade in bovint serumalbumin (BSA) / fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och perifert blod, respektive.
För att lindra visuell upptäckt av celler på enheten och efter återhämtning, mål cancercellerna är märkta med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) och en DNA fläcken innan den återhämtar sig behandlingen (dvs. laddning och ta loss). Behandlingens effekter på DNA kvaliteten på enstaka celler har tidigare utvärderats efter WGA med hjälp av en kvalitetskontroll PCR-4,5, array-CGH6,7 och riktade sekvensering7 visar ingen skillnad jämfört med icke-behandlade celler micromanipulated från cell suspensioner7. Fördelen med denna metod ligger i kombinationen av sällsynta målcellen före berikning och återvinning av celler för encelliga nedströms analys (figur 1). Den aktuella CE-märkt i vivo samling enheten används i allmänhet för uppräkning av CTCs istället för encelliga molekylär karakterisering2,8. Dock mer omfattande analys för att undersöka heterogenitet bland CTCs länge för analys på enskild cellnivå (dvs. riktade sekvensering på enskild cell nivå). Andra cellbaserade metoder baseras på immunmagnetisk isolering av EpCAM-positiva CTCs och encelliga hantering utifrån dielectrophoresis för efterföljande molekylära genetiska analyser9,10. Molekylär karakterisering av CTCs är en viktig förutsättning för deras användbara genomförande i en klinisk miljö och är lika viktigt i grundforskning i metastaserande kaskad. Parallellt till CTCs har cirkulerande tumör DNA (ctDNA) blivit av stor betydelse eftersom det tillåter DNA-analys av tumören bördan med minimal teknisk isolering förfaranden11,12. De cellbaserade metoderna kan fungera som ett kompletterande bidrag eftersom det ger RNA13,14 och protein15 uttryck analys och även för CTC härleds cell kulturer eller xenograft16, 17. även om hinder såsom lågt återhämtning och clearance för användning hos patienter fortfarande behöver övervinnas, fånga och släpp metoden tar ett viktigt nästa steg mot karakterisering av sällsynta målceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gilupi Release Buffer</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL083</td>
			<td>Used to detach cells from the wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>S11-001</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5A Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0018-100</td>
			<td>Supplement for McCoy&#39;s 5a Modified Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0950-100</td>
			<td>Cell detachment solution (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>Type 1003</td>
			<td>Used for prewarming solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to incubate cells (cell culture)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reaction tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixer</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td>SRT6D</td>
			<td>Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Used to label living cells (cytoplasmic label)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Used to stain DNA (nucleic counterstain)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>Used for pelleting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td></td>
			<td>Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td>Used for coating glass/plastic surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS1 Minishaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z404039</td>
			<td>Used for vortexing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450 (or 366480)</td>
			<td>Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor CANCER03 DC03</td>
			<td>Gilupi</td>
			<td>GIL003</td>
			<td>Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&#38;release, C&#38;R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles (G20)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0554</td>
			<td>Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&#38;R to lead through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T729.1</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes 150 mm</td>
			<td>Volac</td>
			<td>D810</td>
			<td>Used for the low-volume application of cells to the C&#38;R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used on glass slides to hold cell suspension in place</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td>For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delfia PlateShaker</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1296-003</td>
			<td>Used for agitation during cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30,125,150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampli1 WGA Kit</td>
			<td>Silicon Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>To be ordered via Silicon Biosystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario</td>
			<td>Zeiss/Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use micromanipulation at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries (25 &#181;m in diameter), CustomTip Type I</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001201</td>
			<td>Used for micromanipulating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>710920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytocentrifuge and equippment</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Universal 32</td>
			<td>Use cytocentrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>DNA Engine Dyad</td>
			<td>Every thermo cycler with heated lid can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CX73.1</td>
			<td>Use desk-top centrifuge at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PET</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415101-4401-050</td>
			<td>Membrane-coated glass slides used for laser microdissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 1800</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400072</td>
			<td>Use DNA cross linker at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard PCR reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Use gel loading dye at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>N0551G</td>
			<td>Use 100 bp ladder at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electorphoresis station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>Use electrophoresis system at hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

target cell pre-enrichment and whole genome amplification for single cell downstream characterization

Sällsynt målceller kan isoleras från en hög bakgrund av icke-målarter celler med antikroppar som är specifika för ytbehandlaproteinerna av målceller. En nyligen utvecklad metod använder en medicinsk tråd functionalized med anti epitelial cell adhesion molekyl (EpCAM) antikroppar i vivo isolering av cirkulerande tumör celler (CTCs)1. En patient-matchat kohort i icke-metastaserande prostatacancer visade att isolering i vivo tekniken resulterade i en högre procentandel av patienter som är positiva för CTCs samt högre CTC räknas jämfört med nuvarande guldmyntfoten i CTC uppräkning. Som cellerna inte kan återställas från nuvarande medicinska enheter, tillverkades en ny functionalized tråd (kallas enhet) så att fånga och efterföljande avlossning cellintervall genom enzymatisk behandling. Celler tillåts att ansluta till enheten, visualiseras på ett mikroskop och fristående med enzymatisk behandling. Återvunna celler cytocentrifuged på membran-belagd diabilder och skördas individuellt med hjälp av laser lokalt eller mikromanipulation. Enskild cell prover utsätts sedan för encelliga hela genomet förstärkning så att flera efterföljande analys inklusive screening och target-specifika strategier. Förfarandet för isolering och återhämtning ger hög kvalitet DNA från enstaka celler och försämra inte efterföljande hela genomet amplifiering (WGA). En enda cell amplifierade DNA kan vidarebefordras till screening och/eller riktad analys såsom array jämförande genomet hybridisering (array-CGH) eller sekvensering. Enheten tillåter ex vivo isolering från konstgjorda ovanlig cellprover (dvs. 500 målceller spetsade in 5 mL av perifert blod). Medan avlossning av celler är acceptabel (50-90%), återvinningsgraden av fristående celler på diabilder spänner över ett brett sortiment som är beroende av den cellinje som används (< 10 - > 50%) och behöver några ytterligare uppmärksamhet. Denna enhet rensas inte för användning till patienter.

Celler efter CFSE och nucleic färgning kan utvärderas med hjälp av ett immunofluorescens Mikroskop utrustat med filter för DAPI och FITC. Atomkärnor presenterar med en ljusa motfärg i DAPI kanalen medan cytoplasman i celler visar enhetlig märkning med CFSE med heterogena mellan cell intensitet (figur 2A och 2E). Liknande form och färgning stödnivåer är förväntat från celler som bifogas tråd (figur 2B och 2F) samt fristående från tråden och återvinns på en bild (figur 2D och 2 H).
Hög cell tätheter (t.ex. > 1 000 000 unika celler/mL) kan leda till total täckning av tråd med celler när laddning trådarna. Dock sänka cell tätheter, förändringar i rotationshastighet under inkuberingen, och användningen av olika cellinjer påverka isolering effektiviteten och måste testas separat. När trådarna inkuberades med 5 mL av HT-29 celler till 100 000 celler / mL som beskrivs i avsnitt 2.1., ett medelvärde på 254 ± 103 celler (n = 5) fångades på trådarna. Med samma experimentera med LNCaP celler, ett medelvärde på 440 ± 319 celler (n = 5) per tråd erhölls.
Presenterande 500, 5 000, och 50 000 HT-29 celler i en bakgrund av 5 mL av perifert blod till ledningar (enligt protokollet avsnitt 2.2.) resulterade i gripandet av 75 ± 18 celler, 25 ± 9 celler och 47 ± 57 celler (n = 3, varje), respektive. Om tråden debiteras med 15 µL cellsuspension (1 000 000 unika celler/mL) enligt protokollet i avsnitt 2.3., upp till 1 000 (HT-29) celler kan bifoga till en tråd.
Cell avlossning effektivitetsvinster varierade från 81% i HT-29 celler (range 54,9% - 93,2% och n = 5) till 81% (intervall 63.51-92,87%, n = 6) och 91% (intervall 84,7% - 95,3%, n = 6) i LNCaP och VCaP celler, respektive. Likaså, återvinning av fristående celler skiljer sig mellan cellinjer: genomsnitt 28% av fristående HT-29 celler var täckta av cytocentrifugation. Återvinningsgraden för LNCaP var lägre än 10%, var den genomsnittliga återhämtningshastigheten för VCaP celler 55%.
Cirka 75% av enstaka celler utsätts för WGA avkastning högkvalitativa WGA produkter: Detta är 1) utstryk av WGA produkter från 0,1 till > 1 kb (figur 4, övre panelen) och (2) tre eller fyra band i 4plex kvalitet kontroll PCR (figur 4, nedre panelen) . WGA produkter kan användas för 1) array-CGH profilering uppfyller kvalitetskriterierna för encelliga array-CGH profiler 6,7 och 2) riktade NGS efter förnyad förstärkning WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figur 1: arbetsflöde för att isolera och återställa målceller för encelliga analys. (A) celler odlas till 90% konfluens och (B) skördas för att erhålla en encellig suspension. Efter färgning med CFSE och nucleic fläcken, (C) functionalized tråd inkuberas i närvaro av cellerna i en volym på 5 mL använda reaktionsrören eller i en låg volym med en Pasteur pipettspetsen. Det senare möjliggör applicering av cell suspension volymer så låg som 15 µL. (D) celler behöver vara fristående inom 4 h efter laddning. Därför placeras tråden i en 1,5 mL reaktionsröret fylld med release buffert. Efter 15 min inkubering på en rocker och 10 min centrifugering, tråden tas bort och cellsuspensionen centrifugeras för att pressa samman cellerna. (E) återvunna celler antingen överförs till en glasskiva för encelliga mikromanipulation (överst) eller cytocentrifuged på ett objektglas med membran-belagda och vidarebefordras för att laser lokalt (nederst). (F) slutligen skördade enstaka celler förökas med hjälp av hela genomet amplifiering (WGA). WGA produkter är kompatibla med array-CGH och riktade NGS nedströms analys. EpCAM epitop: grön cirkel på cellytan. Functionalized tråd: enhet, grå triple-spiralformade ledningar. Polymer: lila linjer. Anti-EpCAM antikroppar: orange. Släppa buffert aktivitet: röd pil. Fett markör att hålla cellsuspension på plats: Mörk blå ellips. Återvunna cellsuspension: ljusblå. Kapillär för mikromanipulation: svart linje. Förstoring: återvunna cell skördas av mikromanipulation, cytospin på membran-täckt Skjut som innehåller återvunna celler (grå fylld ellips). Förstoring: återvunna cell att laser microdissected (grå cirkellinje: membran från membran bild som fungerar som stamnät för laser lokalt), objektiv med laserstråle (blå linje närmar sig i membranet bilden nedan). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figur 2: visualisera märkta celler. (A, E) Celler innan laddningen: celler är märkt med CFSE och counterstained med en DNA infoga färgämne som visar ett urval av CFSE (grön) signalintensitet. (B,F) Märkt celler fångas på linan. (C,G) Wire efter cell-avlossning förfarande. (D,H) Celler som lossnat från tråd och återkrävas av cytocentrifugation på ett objektglas. CFSE: FITC kanal (grön). DNA fläcken: DAPI kanal (blå). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figur 3: Wire och förvaringsfack. (A) fack av tråd. (B) detalj av functionalized delen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figur 4: kvalitetskontroll av WGA produkter erhålls från enda micromanipulated celler. Övre panelen: WGA produkter som erhållits från enstaka celler normalt resultat i DNA utstryk alltifrån 0.2 kb till > 1,0 kb med en maximal intensitet på cirka 0,5 kb. Prov nummer 1, 7 och 13 (indikeras med asterisker) Visa suboptimal eller ingen DNA cellprov. Nedre panelen: WGA produkter är av tillräcklig kvalitet om 4plex PCR ger tre eller fyra av fyra PCR-produkter (på 100, 200, 300 och 400 bp). Prov 1, 7, 10 och 13 Visa färre än tre band och skulle undantas från ytterligare analys. Lane M innehåller 100 bp stege och asterisker visar proverna på otillräcklig WGA produktkvalitet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer sekvens</td>
			<td>OBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-gtt cca ata tga ttc cac cc-3′</td>
			<td>100 bp framåt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3′</td>
			<td>100 bp reverse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-agg tgg agc gag gct agc-3′</td>
			<td>200 bp framåt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′</td>
			<td>200 bp reverse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′</td>
			<td>300 bp framåt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-tcc agera aac cag tca gcg tc-3′</td>
			<td>300 bp reverse primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-aca gtc katt gcc atc agera gc-3′</td>
			<td>400 bp framåt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′</td>
			<td>400 bp reverse primer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Primer sekvenser för 4plex kvalitetskontroll PCR

Watch this Scientific Journal Video about Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization at JoVE.com

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Detta protokoll är att återhämta sig och förbereda sällsynta målceller från en blandning med icke-målorganismer bakgrund celler för molekylär genetisk karakterisering på enskild cell nivå. DNA kvalitet är lika med icke-behandlade enstaka celler och möjliggör encelliga ansökan (båda screening baserat och riktad analys).

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The overall goal of this procedure is to isolate cells from cell suspension in order to make them available for single cell downstream analysis. This method can help answering key questions in the context of liquid biopsies and cellular heterogeneity. The main advantage of this technique is that it allows antibody-based isolation of single cells and their recovery for subsequent molecular genetic analysis at the single-cell level.Once cleared for its use in patients, this technique will enable characterization of circulating tumor cells from cancer patients. As this method can provide insight into heterogeneity among single cells, it can be applied to all kinds of cell suspensions containing subpopulations such as blood samples, samples from cell cultures, or disassociated tissues and organs. We first had the idea for this method when we used an in vivo enrichment device not capable for releasing cells for the purpose of downstream analysis.Visual demonstration of this method is critical as the steps for harvesting single cells using laser microdissection or micromanipulation are difficult to perform successfully because the process of harvesting single cells is prone to cell loss and requires a high level of expertise. In one milliliter of prewarmed cell culture medium, resuspend the HT-29 CFSE-labeled cells and let them regenerate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. To harvest the cells, centrifuge at 300 g for three minutes.Then, resuspend the cell pellet in one milliliter of ready-to-use Hoechst 33342 DNA staining solution at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Next, centrifuge the cell suspension at 300 g for three minutes. Then, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in four milliliters of 1X phosphate-buffered saline.Then, count the number of cells using a hemocytometer and check for fluorescence labeling with fluorescence microscope. Next, centrifuge the cells at 300 g for three minutes, discard the supernatant, and resuspend the pellet at approximately 500, 000 cells per milliliter and place the cells on ice. In five milliliters of peripheral blood, add about 500 to 500, 000 cells and then mix by inverting the tube.After removing the wire from the storage compartment, remove the rubber cap that holds the wire and wash the wire in 1X phosphate-buffered saline and mount it in the cap of the tube. Then, incubate the tube on a tilted roller mixer at five rotations per minute for 30 minutes at room temperature. After incubation, rinse the wire in 1X phosphate-buffered saline thrice.Then, store the wire in a 15-milliliter tube containing 1X phosphate-buffered saline in the dark. Draw a rectangle area on a glass slide using a grease pen, then add 500 microliters of 1X phosphate-buffered saline onto it. To immerse the functional part of the wire in 1X phosphate-buffered saline, bend the non-functional part of the wire and place it on the glass slide.To count the number of captured cells, visually inspect both sides of the wire. After inspecting, transfer the wire back in the 15-milliliter tube with 1X phosphate-buffered saline and keep in the dark. In one milliliter of 1X phosphate-buffered saline, dissolve four milligrams of the release buffer component, then filter the solution through 0.2 micrometer sterile filter to obtain the ready-to-use buffer.Next, warm the release buffer at 37 degrees Celsius for five minutes. Once warmed, transfer 1.6 milliliters of release buffer to completely fill a 1.5-milliliter reaction tube. Next, incubate the functional part of the wire in the release buffer at 37 degrees Celsius in a water bath for 20 minutes.After the incubation, place the wire on a shaker at 500 rotations per minute for 15 minutes. Then, centrifuge the wire at 300 g for 10 minutes. Once the centrifugation is over, displace the wire from the tube, close the cap, and centrifuge the tube again at 300 g for 10 minutes.To decrease the volume of cell suspension, discard all but 100 microliters of supernatant for micromanipulation or 300 microliters for subsequent cytocentrifugation and laser microdissection. Then, quickly proceed to single-cell sampling. For micromanipulation, transfer the entire 100 microliters of cell suspension onto a glass slide.Then, place the glass slide on a microscope equipped with a micromanipulator and allow the cells to settle for five minutes. Then, in 0.2-milliliter PCR tubes, pipette two microliters of cell lysis master mix and transfer on ice. Use the micromanipulator to collect a single cell in one microliter of 1X phosphate-buffered saline.Then, transfer the cell directly into two microliters of cell lysis master mix. Use a desktop microfuge to quickly spin down the samples at 2, 000 g for three seconds to collect the liquid at the bottom of the tube. Then, transfer the sample on ice and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Aspirate only one cell using one microliter of buffer at maximum. When transferring the cell into the lysis solution, make sure you see bubbles arising from the solution, indicating that all the aspirated volume has been transferred. For laser microdissection, cytocentrifuge the entire 300 microliters of cell suspension onto a membrane-coated slide at 300 g for five minutes.Then, place the membrane-coated slide on a microscope capable of laser microdissection. Next, pipette 4.5 microliters of cell lysis master mix into the cap of the 0.2-milliliter PCR tube. Place the cap above the sample and harvest a single cell by laser microdissection.Directly thereafter, check for isolated cells in the PCR cap, remove the PCR tube from the laser microdissection microscope and close the tube. Collect all the liquid at the bottom of the tube with a short spin. Transfer the sample on ice, and proceed to adapter-linker based whole genome amplification.Make sure you recover the laser microdissected cell. Therefore, it is important to cover the entire tube cap with the lysis solution. After microdissection, check the tube cap for the presence of the cell.To show cells that are stained with CFSE and Hoechst 33342, immunofluorescence imaging was done before charging the wire, during the cells being attached to the wire, then detached from the wire, and finally on the slide. The immunofluorescence images of cells before charging show bright nucleic stain in blue, whereas the cytoplasm of the cells show green CFSE stain with heterogeneous inter-cell intensity. Similar staining pattern is also observed for cells that are attached and subsequently detached from the wire.To check the quality of the whole genome amplification products, a 1%agarose gel was run. The agarose gel shows a DNA smear ranging from 0.2 to greater than 1 kilobase for the PCR products of whole genome amplification. The 4plex quality control PCR products obtained from the single cell yields products of 100, 200, 300, and 400 base pairs.Products that show fewer than three bands are excluded from further analysis. Once mastered, this technique allows isolation of single cells from cell suspensions in four hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to keep the cells submerged in buffer, especially during the time the cells are attached to the wire to avoid harming the cells.Following this procedure, analysis methods like area-comparative genomic hybridization, next-generation sequencing, and target-specific PCR can be performed in order to characterize single cells based on copy number variations and mutations. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate and recover cells from cell suspensions using a functionalized wire and how to sample single cells for multiple downstream molecular genetic analysis. Don't forget that working with human blood poses the possibility of infection, so wearing gloves and a lab coat are mandatory while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Karakterisering av cellmembranet tillägg och studera deras roller i Cancer Cell Adhesion Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flödescytometri med fluorescerande Cell streckkodning för enstaka Cell signalering analys och biomarkör identifiering

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation av cirkulerande tumör celler för nedströms molekylär analys och metastatisk potentiell bedömning

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur och kryokonservering av esofagusadenokarcinomorganoider: Fördelar och nackdelar för encellsförtunning

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisk tumörorganoid läkemedelsscreening med hjälp av Widefield Live-Cell Imaging för bulk- och enorganoidanalys

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexerad streckkodande bildanalys för immunprofilering och karakterisering av rumslig kartläggning vid encellsanalys av paraffinvävnadsprover

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...