Name: overlapping peptide library to map qa-1 epitopes in a protein
Uploaded: 2017-12-20T12:30:00
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彼女の技術支援とこの原稿の準備、ペネロペ ガルシアに感謝しますこの作品は、(681205-2967) ロマリンダ大学医学部から研究イノベーション助成金 (リグ) と XT に国民の多数硬化の社会 (PP1685) からパイロットの助成金によって支持されました。

すべての実験は、機関動物愛護と動物の世話とテキサス大学エル ・ パソとロマリンダ大学で利用委員会によって承認プロトコルを使用に準拠して行われました。
1. タンパク質の全体の長さをカバー OLP ライブラリの生成
<ol>
	<li>すべてのペプチドが、長さ 15 mer でその後隣接するペプチドを重複 11 アミノ酸 OLP ライブラリを設計します。 注: モグ OLP 研究でモグ前駆?...

<ol>
	<li>Aldrich, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Tap-dependent+leader+peptide+recognized+by+alloreactive+T+cells+specific+for+a+class+Ib+antigen.">Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen.</a> Cell. 79 (4), 649-658 (1994).</li><li>Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD94/NKG2A+is+a+natural+killer+cell+receptor+for+the+nonclassical+major+histocompatibility+complex+(MHC)+class+I+molecule+Qa-1(b).">Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b).</a> J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).</li><li>Oliveira, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonpolymorphic+MHC+Qa-1+mediates+CD8++T+cell+surveillance+of+antigen-processing+defects.">The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects.</a> J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).</li><li>Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+MHC+class+Ib-restricted+cytotoxic+T+cells+monitor+antigen+processing+in+the+endoplasmic+reticulum.">Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum.</a> Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).</li><li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+regulatory+CD8+T+cells+in+Qa-1-deficient+mice.">Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice.</a> Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immunity+by+a+novel+population+of+Qa-1-restricted+CD8alphaalpha+TCRalphabeta++T+cells.">Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells.</a> J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).</li><li>Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+arthritis+through+mobilization+of+peptide-specific+CD8++regulatory+T+cells.">Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells.</a> J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).</li><li>Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+T+cell+regulation+that+enables+self-nonself+discrimination+in+the+periphery.">The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).</li><li>Panoutsakopoulou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+autoimmune+disease+after+vaccination+with+autoreactive+T+cells+that+express+Qa-1+peptide+complexes.">Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes.</a> J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).</li><li>Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-TCR+antibody+treatment+activates+a+novel+population+of+nonintestinal+CD8+alpha+alpha++TCR+alpha+beta++regulatory+T+cells+and+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).</li><li>Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+CD8++Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection.">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Non-classical+Myelin+Epitopes+to+Treat+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Sci Rep. 6, 36064 (2016).</li><li>Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+host+factors+involved+in+the+major+histocompatibility+complex+class+Ib-restricted+presentation+of+Salmonella+Hsp+60:+novel+pathway.">Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway.</a> Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleocapsid+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+is+a+potent+human+CD8++T+cell+antigen+and+elicits+memory+responses.">The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses.</a> PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).</li><li>Schumacher, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+selection+by+MHC+class+I+molecules.">Peptide selection by MHC class I molecules.</a> Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle.">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li><li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity.">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li><li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha+TCRalphabeta++T+cells+with+regulatory+properties.">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li><li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein,+PfAARP.">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457 (2016).</li><li>Kambayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nonclassical+MHC+class+I+molecule+Qa-1+forms+unstable+peptide+complexes.">The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes.</a> J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).</li></ol>

ここでは、蛋白質の Qa 1 エピトープの分析のためのプロトコルを説明しました。このプロトコルに関連していくつかの他の方法は既に報告もしました。まず、同種の CD8+ T 細胞とクローンは Qdm1の識別のために使用されました。第二に、Qdm の解析から推定される Qa-1 結合モチーフは HSP60p216 224 と TCRBV8.1 エピトープ9,18の同?...

Qa 1 はマウス (MHC Ib) 分子非古典的な主要な組織適合性の複雑な 1 b のグループに属しています。その人間の相同物 HLA-E のです。証拠はこれまでは、Qa 1 分子が生体の重要な機能であることを示しています。まず、Qa 1 分子構造と機能の整合性のための細胞の調査で重要な役割を果たします。この点、Qa 1 分子は、細胞の正常な機能を監視するいくつかの戦略を進化してきました。このような戦略の 1 つは、Qa 1 分子加工のリーダー ペプチド (エピトープ)、すなわちQa 1 決定修飾子 (Qdm) 小胞体1古典的 MHC Ia 分子から処理されると錯形成できます。これら後の Qa-1/Qdm の複合体は細胞の表面に表示され、アクティビティ2を殺す NK を抑制する NK 細胞の抑制性 NKG2A 受容体にバインドします。Ia MHC 分子の発現が失われた場合 (例えば悪性細胞) は2を殺す NK に敏感になります。その他の方法により、タップ (抗原処理に関連付けられているトランスポーター) に欠けている細胞の表面の新しい Qa 1/抗原複合体を形成する Qa 1 分子3および/または ERAAP (小胞体アミノペプチダーゼに関連付けられています。抗原処理)4 (両方の欠陥はしばしば悪性細胞に発生します)。これらの新しい Qa 1/抗原複合体を表現する細胞認識およびエピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限によって除去できる+ T 細胞。第二に、Qa 1 分子免疫制御5を誘発します。この点、Qa 1/抗原複合体は、CD8 を刺激するために示されている+自己組織6,7,8 の免疫介在性損傷の防止にとって重要な細胞 (Treg) T、9,10。第三に、Qa 1 制限 CD8+ Treg 細胞はウイルス感染11に対する免疫応答を制限する示されています。
したがって、エピトープ特異 Qa 1 点 CD8 の特定豊胸+ T 細胞は異常細胞の排除、免疫制御の強化との大きさの制御可能性のある有望な戦略ウイルスによる免疫応答。一方、それかどうか決定されていない豊胸エピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限の+ T 細胞は免疫監視を強化でき、ウイルスによる免疫応答を制限、研究所施設、その他ことが明らかQa 1 エピトープと予防接種は CD8 の Qa 1 制限の機能を増やすことが+ Treg 細胞病原性自己免疫性 cd4 陽性の特定+ T 細胞、CD4 の効率的な管理に至る+で T 細胞による自己免疫疾患、さまざまな動物モデルの実験的アレルギー性脳脊髄炎 (人間多発性硬化症の動物モデル)6,10、コラーゲン誘導関節炎 (ひと関節リウマチの動物モデル)7などと非肥満の糖尿病 (ヒト 1 型糖尿病の動物モデル)8。さらに、我々 は免疫組織固有の Qa 1 エピトープが CD8 の増強によってその組織の免疫炎症の特定のコントロールにつながることを発見した+ Treg 細胞12。前臨床試験の上記の成功が Qa 1 エピトープ免疫組織特異免疫介在性疾患の治療のため、潜在的タップの欠陥に関連付けられている他の疾患の治療のための完全な評価の必要性を示すとERAAP。
したがって、蛋白質の Qa 1 エピトープを確実かつ迅速に分析できる技術の需要があります。この点では、生物学的に重要な Qa 1 エピトープの限られた数が記載されています。これら Qa 1 エピトープのほとんどは CD8 の研究中に偶然に識別された+ T 細胞の反応惹起6、原因になるセル セル ERAAP4、欠損、タップ3欠損細胞細菌13 9。したがって、高スループット方法が定義されたタンパク質の生物学的に重要な Qa 1 エピトープの同定のため望ましいです。以下では、マップを使用して Qa 1 resrticted CD8 蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープ重複のペプチド (OLP) ライブラリ戦略について述べる+ T 細胞ライン OLP プール (OLP_pool) 蛋白質のために特定します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>The protein to be analyzed</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence of the protein can be obtained from NCBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: D2650 SIGMA</td>
			<td>DMSO should be sterile and cell culture tested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kb-/-Db-/- mice</td>
			<td>The Lackson Laboratory</td>
			<td>Stock#: 019995</td>
			<td>We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM V Serum Free Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11333D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel P-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat#: 150-4171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trasfer pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>Mfg#: 137238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#: 315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well tissue culture plates</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>Cat#: CC7682-7548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: Z372129 Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml deep 06-well PP plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>Item#: 1896-1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#: 212-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-7</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>Cat#L: 217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capture anti-IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: S2EM004M99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1R</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Cat#: ATCC CRL-1993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1R.Qa-1b</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qa-1 lentiviral vector</td>
			<td>GeneCopoeia</td>
			<td>Product#: Mm02955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection anti-IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#: P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: BD557630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEC substrate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat#: 551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot</td>
			<td></td>
			<td>Any immunoSpot analyer should work for this purpose.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overlapping peptide library to map qa-1 epitopes in a protein

Qa-1 (人間の HLA E) は、(MHC Ib) 分子をクラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b グループに属する。最近のデータでは、Qa 1 分子が細胞の構造と機能の整合性を調査、免疫調節の誘導、ウイルス感染に対する免疫応答を制限することにおいて重要な役割を果たすことを示唆しています。また、CD8 の Qa 1 制限の機能増強+ T 細胞エピトープを通じて予防接種がいくつかの自己免疫疾患動物モデル、例えば実験的アレルギー性脳脊髄炎、治療効果を示しています。コラーゲン誘発関節炎と非肥満の糖尿病。したがって、蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープを効率的かつ迅速に識別できる方法のための緊急の必要性があります。ここでは、CD8 の Qa 1 制限を利用するプロトコルについて述べる+ T 細胞の蛋白質の Qa 1 エピトープを決定するための重複のペプチド (OLP) ライブラリの特定行。この OLP ライブラリを含む 15 mer 重複するペプチド、蛋白質の全体の長さをカバーする、11 のアミノ酸によって隣接するペプチドを重ねます。このプロトコルを使用して、我々 は最近ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 9 mer Qa 1 エピトープを識別しました。この新しくマップされたモグ Qa 1 エピトープはエピトープ固有の Qa 1 制限 CD8 を誘導するために示された+ T 細胞その強化されたミエリン特異免疫調節。したがって、このプロトコルは、将来における新たな標的と CD8 の Qa 1 制限の機能に便利+ T 細胞。

蛋白質の全体の長さをカバー OLP ライブラリのデザイン
15 アミノ酸 (15 mer) タンパク質の N 末端から始まる、各ペプチドです。したがって、最初のペプチド 15 の位置に 1 の位置に します。2 番目のペプチドの N 末端は 11 アミノ酸によって最初のペプチドの C 末端と重複します。したがって、2 番目のペプチドにまたがる位置 ...

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Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

Qa-1 (人間の HLA E) は、クラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b 分子のグループに属しています。Qa-1 結合エピトープと予防接種はティッシュ特定の免疫制御が強化され、いくつかの自己免疫疾患を改善するのに示されています。本蛋白質の Qa 1 エピトープの同定のため重複のペプチド ライブラリ戦略について述べる。

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

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ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

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