Name: modelling zika virus infection of the developing human brain in vitro using stem cell derived cerebral organoids
Uploaded: 2017-09-19T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids at JoVE.com

Forfatterne takke Priscilla L. Yang og Dominique J. Burri fra Harvard Medical School for hjælp med indledende formering og kvantificering af ZIKV. Vi vil også gerne takke Nathaniel D. Kirkpatrick understøttelse af billedbehandling. K.E. blev støttet af Stanley Center for psykiatrisk forskning og Harvard stamcelle Institute.

1. oprettelse af Cerebral Organoids fra iPSC / menneskelige stamceller 2D kultur (dag 0) Note: denne protokol antages det, at stamceller (SC) vedligeholdelse er udført i SCMM medium med en vitronectin eller Geltrex substrat. Hvis bruger en alternativ, høj-protein stamcelle dyrkning medier, er det tilrådeligt at overgangen SC kulturer til SCMM for mindst to passager før indlede organoid dannelse. Protokollen er ikke blevet testet med feeder-baserede SC kultur metoder.
<ol><li>Ved hjælp af regelmæssig SC vedligeholdelse metoder 25 , 26, bringe kulturer til 50-70% sammenløb. Dette er typisk 3-4 dage efter passaging, selv om dette kan være afhængig af kultur metode og celle linje. 
	Bemærk: Ca. 2 brønde fra en 6-godt plade er nødvendig for at producere en fuld 96-brønd plade af organoids.</li>
	<li>Inspicere kulturer via brightfield mikroskopi på 10 X-20 X forstørrelse at sikre sunde koloni morfologi, med ingen påviselige differentiering.</li>
	<li>Bringe SCMM til 37 ° C i et vandbad, og tø en 50 µL hætteglas med 50 mM Y-27632 (Rock hæmmer) og 2 mL af enzymatisk detachement reagens til stuetemperatur.</li>
	<li>Udarbejde en ultra-lav vedhæftet fil (ULA) U-bunden 96 godt plade, en multikanalpipette P200 og en 25 mL reagens reservoir.</li>
	<li>Alikvot 45 mL af SCMM i en 50 mL konisk slange, og tilføje 45 µL af 50 mM Y-27632. Blandes grundigt ved triturating.</li>
	<li>Vakuum Opsug de to brønde, der indeholder SCs, og tilsættes hurtigt 1 mL af enzym-fri detachement reagens til hver brønd med en P1000 pipette. Inkuber pladen i et 37 ° C inkubator for 4 min.</li>
	<li>Vakuum Aspirér behandlede brøndene, og der tilsættes 1 mL af enzymatisk detachement reagens til hver brønd med en P1000 pipette.
	<ol><li>Incubate plade i et 37 ° C inkubator for en yderligere 5 min.</li>
		<li>Fjerne pladen og undersøge de behandlede brønde. Forsigtigt trykke på pladen til at bryde op aggregerede celler. Hvis store celle klynger er stadig synlige, inkuberes plade for 2 ekstra minut ved 37 ° C. Gentag dette trin indtil klynger er ikke længere synlige med det blotte øje.</li>
	</ol></li> <li>Når cellerne er korrekt adskilles, tilsættes 1 mL SCMM til hver brønd for at deaktivere dissociation enzymer. Pool til 4 mL cellesuspension i en 50 mL konisk slange og tag en lille alikvot til celle optælling.
	<ol><li>Returnere eventuelle resterende, ubehandlet brønde i vedligeholdelse plade til 37 ° C inkubator.</li>
	</ol></li> <li>Mens tælle, centrifugeres cellesuspension ved 300 x g i 5 min.</li>
	<li>Bestemmer antallet af celler, og beregningen af SCMM + Y-27632 løsning, som vil være nødvendige for at opnå en 60.000 celler/mL suspension.</li>
	<li>Omhyggeligt vakuum Aspirér supernatanten og tilføje beregnede mængden af SCMM + Y-27632 løsning. Bland 5 - 10 gange med en 5-mL pipette, at sikre en ensartet cellesuspension.</li>
	<li>Straks overføre cellesuspension til et reagens reservoir, og tilsæt 150 µL i hver brønd af ULA U-bunden 96-brønd plade ved hjælp af en multikanalpipette P200. Dette giver 96 individuelle organoids, hver i første omgang bestående af 9.000 celler.</li>
	<li>Centrifuge plade ved 150 x g i 1 min.</li>
	<li>Læg pladen i et 37 ° C inkubator, og Forstyr ikke pladen for 48 h.</li>
</ol> 2. Cerebral Organoid vedligeholdelse (dag 2) <ol><li>forberede 17 mL SCMM med 17 µL af 50 mM Y-27643 i en 50 mL konisk slange. Varm SCMM + Y-27632 løsning til 37 ° C i et vandbad.</li>
	<li>Tage organoid plade fra rugemaskinen, og ved hjælp af en multikanalpipette, P200 indstillet til 75 µL, langsomt trække op medium fra kanten af brønden på første række. Når mediet er blevet udtrukket, hurtigt udvise den medium tilbage ned i brønden til løft løs celler og organoids. Gentag dette for hver række. 
	Bemærk: Denne teknik, herefter kaldet en &#34; dispersion, &#34; elevatorer celleaffald og organoid i suspension. Organoid synker hurtigt til bunden af brønden, mens de mindre snavs forbliver i suspension, så den kan fjernes med en ændring af medier. Dette medvirker til at forhindre organoid i hvile i celleaffald under kultur.
	<ol><li>Efter alle brønde er blevet spredt, vente 15 s for at sikre, at organoids er sunket til bunds i hver brønd.</li>
	</ol></li> <li>Langsomt og omhyggeligt Aspirér 75 µL af medium fra hver brønd med P200 multikanalpipette og dispensere til en affald reservoir. 
	Bemærk: De fleste brugere Aspirér lejlighedsvis en organoid under regelmæssig feeds. Dette kan forekomme omkring 1% af tiden. Venligst planlægger derfor at sikre, at nok organoids overlever til eksperimentelle tidspunkter.</li>
	<li>Overføre SCMM + Y-27632 løsning til et reagens reservoir, og dispensere 150 µL i hver organoid godt bruge P200 multikanalpipette.</li>
	<li>Pladen anbringes tilbage i et 37 ° C inkubator.</li>
</ol> 3. Cerebral Organoid vedligeholdelse (dag 3) <ol><li>varme 17 mL SCMM til 37 ° C, denne gang uden Y-27643.</li>
	<li>Med den P200 multikanalpipette indstillet til 100 µL, sprede alle pladens huller, organoid (Se trin 2.2). Vent 15 s til at sikre, at organoids er sunket til bunds i deres brønde.</li>
	<li>Udarbejde en affald reservoir og overføre varmede SCMM i en kilde reservoir.</li>
	<li>Omhyggeligt Aspirér 125 µL af medium fra hver brønd, og erstatte med 150 µL af friske SCMM ved hjælp af P200 multikanalpipette.</li>
	<li>Pladen anbringes tilbage i et 37 ° C inkubator.</li>
</ol> 4. Cerebral Organoid vedligeholdelse (dag 4 +) Note: foretage denne regelmæssig vedligeholdelse hver anden dag indtil infektion.
<ol><li>Før du begynder foder på dag 4, forberede neurale induktion (NI) medium.
	<ol><li>Tø en 250 µL alikvot af 2 mg/mL heparin, sammen med en 5 mL hætteglas af 100 X N-2 Supplement. Tilføj de 250 µL af heparin, 5 mL 100 X N-2 og 5 mL af 100 X MEM-NEAA til 500 mL af DMEM / F12 + GlutaMAX. Sterilt filtrere den blandede løsning i en 500 mL filteret. 
		Bemærk: Holde NI ved 4 ° C når den ikke er i brug; NI varer op til to uger før frisk medium bør klargøres.</li>
	</ol></li> <li>Varme 17 mL NI medium til 37 ° C.</li>
	<li>Med den P200 multikanalpipette indstillet til 100 µL, sprede alle pladens huller, organoid (Se trin 2.2). Vent 15 s til at sikre, at organoids er sunket til bunds i deres brønde.</li>
	<li>Udarbejde en affald reservoir og overføre varmede NI til en kilde reservoir.</li>
	<li>Omhyggeligt Aspirér 125 µL af medium fra hver brønd, og erstatte med 125 µL af frisk NI ved hjælp af P200 multikanalpipette.</li>
	<li>Pladen anbringes tilbage i et 37 ° C inkubator.</li>
</ol> 5. Organoid infektion med ZIKV (~ dag 24) NOTE: efter cirka 3 uger af differentiering, der will være store neuroepithelial strukturer og rosetter ses inden for den organoid, der vil være meget modtagelige for ZIKV infektion.
<ol><li>Bringe Earle &#39; s 1 X Balanced Salt løsning (EBSS), 1 X PBS og NI til 37 ° C i et vandbad.</li>
	<li>Dilute ZIKV af kendt koncentration i 1 X EBSS til target infektion mangfoldighed af infektion (MOI). 
	Bemærk: Titreringer af forskellige MOIs anbefales for at opnå en viral dosis-respons. Dette kan variere afhængigt af virusstamme; for ATCC VR-1838 og ATCC VR-1843, typisk MOI værdier ligger mellem 0,1 og 10).</li>
	<li>Fjern forsigtigt alle medium fra organoid godt bruge en enkelt kanal P200 pipette. Hurtigt tilføje 200 µL 1 X PBS til hver brønd med en P200 multikanalpipette for at vaske organoids.</li>
	<li>Fjern forsigtigt alle medium fra organoid godt bruge en enkelt kanal P200 pipette. Hurtigt tilføje 50 µL 1 X EBSS-only (mock infektion) eller ZIKV virus løsning til godt og sikre, at organoid er helt neddykket. Gentag for hver organoid, der er at være smittet for studiet.</li>
	<li>Placerer pladen tilbage i et 37 ° C inkubator for 2 h. 
	Bemærk: Inkubere mock-inficeret organoids for denne varighed ikke bør signifikant indflydelse på deres vækst i forhold til uforstyrret organoids.</li>
	<li>Ca 30 min før viral inkubation er færdigt, alikvot 25 mL af NI i en 50 mL konisk slange, og bringe til 37 ° C i et vandbad.</li>
	<li>Efter viral eksponering er afsluttet, vask organoids med 200 µL 1 X PBS til hver brønd, tillade organoids at nøjes med 15 s, og derefter fjerne 1 X PBS ved hjælp af en enkelt kanal P200 pipette.</li>
	<li>Tilføje 200 µL af frisk NI til hver brønd, og sted tilbage i inkubatoren.
	<ol><li>Valgfrit: For en dag 0 tid pege, organoids kan være afbildet en time efter infektion.</li>
	</ol></li> <li>Fortsæt til kultur ved at erstatte 125 µL NI hver anden dag ved hjælp af metoden dispersion (Se trin 4). Sørg for at korrekt bortskaffelse af brugte medier og tips, da dette indeholder smitsomme ZIKV partikler.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jurado, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+productively+infects+primary+human+placenta-specific+macrophages.">Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages.</a> JCI Insight. 1, 1-6 (2016).</li><li>Quicke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Placental+Macrophages.">Zika Virus Infects Human Placental Macrophages.</a> Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).</li><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).</li><li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly.">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).</li><li>Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+and+Microcephaly.">Zika Virus and Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).</li><li>Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Brain+Abnormalities+and+Zika+Virus:+What+the+Radiologist+Can+Expect+to+See+Prenatally+and+Postnatally.">Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally.</a> Radiology. , 161584 (2016).</li><li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells.">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89, 8880-8896 (2015).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth.">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inhibitors+of+Zika+virus+infection+and+induced+neural+cell+death+via+a+drug+repurposing+screen.">Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen.</a> Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of virology. , 00009-00017 (2017).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).</li><li>Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+(PRVABC59)+Infection+Is+Associated+with+T+cell+Infiltration+and+Neurodegeneration+in+CNS+of+Immunocompetent+Neonatal+C57Bl/6+Mice.">Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice.</a> PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Mice+Causes+Panuveitis+with+Shedding+of+Virus+in+Tears.">Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears.</a> Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).</li><li>Dudley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+macaque+model+of+Asian-lineage+Zika+virus+infection.">A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection.</a> Nat Commun. 7, 12204 (2016).</li><li>Li, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+2016+Clinical+Isolate+of+Zika+Virus+in+Non-human+Primates.">Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates.</a> EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).</li><li>Osuna, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+viral+dynamics+and+shedding+in+rhesus+and+cynomolgus+macaques.">Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques.</a> Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).</li><li>Cugola, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Brazilian+Zika+virus+strain+causes+birth+defects+in+experimental+models.">The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models.</a> Nature. , (2016).</li><li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids.">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352, 816-818 (2016).</li><li>Wells, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Ablation+of+AXL+Does+Not+Protect+Human+Neural+Progenitor+Cells+and+Cerebral+Organoids+from+Zika+Virus+Infection.">Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection.</a> Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Depletes+Neural+Progenitors+in+Human+Cerebral+Organoids+through+Activation+of+the+Innate+Immune+Receptor+TLR3.">Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organized+Formation+of+Polarized+Cortical+Tissues+from+ESCs+and+Its+Active+Manipulation+by+Extrinsic+Signals.">Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501, 373-379 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li><li>Contreras, D., Arumugaswami, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infectious+Cell+Culture+System+and+the+In+Vitro.+Prophylactic+Effect+of+Interferons.">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons.</a> J Vis Exp. , e10-e13 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Der er flere forbehold at overveje, når udnytte menneskelige cerebral organoids at undersøge ZIKV infektion. En vigtig overvejelse er denne organoid dannelse og struktur er meget afhængige af stamcelle linje fra hvilket de er dannet. Vær forsigtig ved sammenligning mellem cellelinjer, herunder isogene manipuleret linjer; Det er bedst at gøre konklusioner ved hjælp af flere subclones, og ideelt set flere stamcellelinjer. Desuden på grund af denne forskel i cellelinjer, pilot forsøg for at sikre, at ordentlig differentiering sker i organoids anbefales. Mens neuroepithelial strukturer er synlige ved brightfield mikroskopi, foreslås det også for at udføre qRT-PCR eller cryosectioning eksperimenter til at lede efter neurale differentiering markører som PAX6 eller phospho-vimentin.
Man bør også forudse betydelig variation blandt organoids inden for den samme cellelinje. På grund af et karakteren af protokollen, kan antallet og størrelsen af neuroepithelial strukturer variere mellem individuelle organoids. Typisk kan man forvente mindst to store (&gt; 200 µm i diameter af D24) neurale rosetter pr. organoid. Af denne grund er longitudinelle studier, såsom observation af ændring i organoid størrelse efter infektion, særligt oplysende. Variation mellem partier kan også forekomme, med den mest sandsynlige årsag til dette at være unøjagtige celle optælling eller såning. Det anbefales at foretage flere tæller og for at sikre cellesuspension er godt blandet før såning på ULA U-bunden 96-brønd plader.
Når dyrkning organoids i ULA U-bunden 96-brønd plader, har plan om at se betydelig fordampning effekter omkring kanterne af pladerne. Det er ideelt at udfylde disse brønde med PBS og kun arbejde med center 60 brønde. På grund af fordampning, vil organoids i de yderste brønde blive udsat for forskellige vilkår end dem i midten, som sandsynligvis vil påvirke deres vækst og differentiering. Venligst overveje dette ved planlægning af antallet organoids, der vil være behov for eksperimenter. Derudover vil organoids begynde at vokse hen over 96-brønds format efter ca 30 dage, som vil være synlig på grund af misfarvning af næringssubstratet. Hvis planer om at tage organoids forbi 30 dagene, anbefales det at overføre en organoids til en ULA 24-godt plade. At gennemføre overførslen, bruge saks til at skære en P1000 tip, så åbningen er meget større end organoids, sig selv, og overføre organoids af pipettering.
Menneskelige cerebral organoids holde stort potentiale i at fremme feltets forståelse af nervesystemets udvikling og sygdom. Forskere opfordres til at ændre protokollen som nødvendigt. For eksempel kunne man gennemføre mønstre faktorer for at forbedre differentiering effektivitet mod bestemte celletyper, får mulighed at udforske de virale virkninger på visse anatomiske områder. Neuro-udviklingsmæssige virkninger af ZIKV er stadig dårligt forstået, men denne nye tilgang vil give forskere en tilgængelig, hurtig og høj overførselshastighed måde at undersøge mekanismerne af infektion.

Zika virus (ZIKV) har hurtigt spredt sig i Mikronesien, Fransk Polynesien og Amerika, og har for nylig vist sig at krydse placentamembranen1,2 for at inficere udvikle føtal hjernen, fører til udviklingsforstyrrelser sygdomme, sådan som mikrocefali3,4,5,6 . Den langsigtede virkning på disse patienters liv, og den nuværende mangel på behandling, har ført forskere og klinikere til kamp for en bedre forståelse af mekanismerne bag ZIKV infektion og replikering. Tidligere studier har undersøgt ZIKV infektion af in vitro- systemer i en bred vifte af fysiologisk relevante celle typer7,8,9, samt in vivo10 med immunkompetente og immunkompromitterede mus11,12,13 og ikke-menneskelige primater14,15,16. Ud over disse mere konventionelle teknikker, har flere grupper gennemført stamcelle-afledt cerebral organoids at forstå mere om ZIKV infektion i udviklingslandene menneskehjernen. Disse grupper har udnyttet menneskelig cerebral organoids for at bekræfte mikrocefali fænotype17,18, undersøge receptorer knyttet til virus posten19, undersøge fysiologiske svar til infektion20 , 21, og potentielt skærmen for drug kandidater22. Her beskrives en teknik til hurtigt producere og inficere stamcelle-afledt cerebral organoids, som vist tidligere19, at forbedre forståelsen af ZIKV infektion i udviklingslandene menneskehjernen.
Da organoids dannes fra standard pluripotente stamceller (PSC) kulturer, denne teknik giver mulighed for en række videnskabelige spørgsmål besvares om viral infektion i udviklingslandene hjernen. For eksempel, kan CRISPR teknik bruges til at ændre disse PSC linjer før organoid infektion i et hurtigere tempo end de fleste i vivo genetiske undersøgelser19. Desuden, i modsætning til i standard to-dimensionelle (2D) differentiering kulturer, organoids udviser den komplekse cellulære arkitektur, der er afgørende for corticogenesis, og nyere undersøgelser har vist, at denne arkitektur kan forstyrres ved infektion 21. Endelig, den relativt lave omkostninger til at generere organoids giver mulighed for højere overførselshastighed eksperimenter og screening i forhold til i vivo modeller. På den anden side er der nogle ulemper til udnyttelsen af organoids til at studere ZIKV. Mens organoids er langt mere biologisk relevante end 2D kulturer, er der ekstra udfordringer i vurdering af organoids på grund af deres tre-dimensionelle (3D) karakter. Billedbehandling og dissociation af organoids tendens til at inddrage mere udstyr og en større investering af ressourcer end i standard 2D kulturer. Derudover mangler organoids vaskulatur og immunologiske komponenter, der er til stede i i vivo modeller, så forskere interesseret i disse aspekter af virusinfektion rådes til at søge en alternativ protokol.
Der er en række teknikker til frembringelse af menneskelige organoids og neurospheres i kultur, og de falder typisk inden for kategorierne mønstret eller unpatterned . Mønstrede metoder gennemføre faktorer for at regulere Wnt, BMP, TGFβ og andre signaling veje for at skubbe differentiering mod specifikke lineages23. Et metoder, som beskrevet her, drage fordel af tilbøjelighed til induceret pluripotente stamceller (iPSCs) og humane embryonale stamceller (hESCs) at differentiere mod en neuroectodermal slægt af standard24. Efter ca. tre uger af differentiering består de resulterende organoids af store, biomimetiske neuroepithelial strukturer, der indeholder flere celletyper, der er observeret i den tidlige udvikling hjernen.
Teknik til at producere organoids af standard, feeder-gratis PSC kulturer, og inficere disse organoids med ZIKV præsenteres i sin helhed. For vejledning om de dyrkningsbaserede metoder til feeder-fri PSC'er, henvises til tidligere metoder publikationer25,26. Desuden anvende ensartet beløb af virus til flere forsøg, er det vigtigt at beregne MOI før tid. Dette gøres ved at gennemføre en infektion af Vero celler, efterfulgt af behandling med overlay medium og inkubering immunfarvning. Beskrivelser og metoder af denne teknik har været tidligere beskrevet19,27.
Når PSC kultur når målet sammenløbet af 50% - 70%, er cellerne derefter adskilles og samles i ultra-lav 96-brønd monteringsbeslag. Cellerne er opretholdt i 3 dage i xeno-fri stamcelle vedligeholdelse medier (SCMM) og derefter konverteres til et neurale induktion medier til resten af kulturen. Når organoids har differentieret i 3 uger, kan infektionen gennemføres. Ved rutinemæssigt at tage billeder i løbet af den uge efter infektion, vil forskere observere progressive celledød og forstyrrelse af organoid. Forskere kan også adskille organoids på denne tid til at gennemføre transcriptional eller proteom profilering. Metoderne Cryosectioning og lightsheet anbefales til billedbehandling, og forskere kan forvente at se høje niveauer af infektion og viral replikation især inden for de neurale stamceller (NPC) cellepopulationer i organoids. I sidste ende, denne teknik giver forskere hurtigt undersøge mekanismerne for viral infektion af den menneskelige hjerne med lave omkostninger og begrænset udstyr.

<table style="border-collapse:collapse;width:1358pt" width="1811">
	<colgroup>
		<col style="width:317pt" width="423" />
		<col style="width:158pt" width="211" />
		<col style="width:134pt" width="178" />
		<col style="width:749pt" width="999" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="width:317pt;height:26.25pt" width="423">Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8</td>
			<td class="xl19" style="width:158pt" width="211">StemCell Technologies</td>
			<td class="xl19" style="width:134pt" width="178">5940</td>
			<td class="xl19" style="width:749pt" width="999">Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton.&#160; Store at 4 &#7506;C for up to two weeks after prepared from individual components</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR</td>
			<td class="xl19">StemCell Technologies</td>
			<td class="xl19">5873</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Enzymatic Detachment Reagent, Accutase</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">A11105-01</td>
			<td class="xl19">Store aliquoted at -20 &#7506;C, do not keep thawed for longer than necessary</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Y-27632</td>
			<td class="xl19">Selleck Chem</td>
			<td class="xl19">S1049</td>
			<td class="xl19">Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 &#7506;C in 50&#181;L aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td class="xl19">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">D2650-100ML</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">10565-018</td>
			<td class="xl19">(+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">N-2 Supplement (100X)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">17502-048</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">11140-050</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Heparin</td>
			<td class="xl19">Sigma-Adrich</td>
			<td class="xl19">H4784-1G</td>
			<td class="xl19">Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 &#7506;C in 250&#181;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
			<td class="xl19">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td class="xl19">SH30029.02</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Stericup Filter (500mL)</td>
			<td class="xl19">Millipore</td>
			<td class="xl19">220009-140</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom</td>
			<td class="xl19">Corning</td>
			<td class="xl19">7007</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL)</td>
			<td class="xl19">Integra</td>
			<td class="xl19">4312</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td>
			<td class="xl19">Rainin</td>
			<td class="xl19">17013810</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible</td>
			<td class="xl19">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75007210</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Culture Plate Centrifuge Rotor</td>
			<td class="xl19">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75005706</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Vero Cells</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">CCL-81</td>
			<td class="xl19">For virus expansion, if necessary</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Zika Virus (Uganda Strain)</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">VR-1838</td>
			<td class="xl19">Other strains may be used</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Zika Virus (Puerto Rico Strain)</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">VR-1843</td>
			<td class="xl19">Other strains may be used</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">phospho-vimentin</td>
			<td class="xl19">MBL</td>
			<td class="xl19">D076-3</td>
			<td class="xl19">mouse polyclonal,&#160; 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">TBR2</td>
			<td class="xl19">Abcam</td>
			<td class="xl19">ab23345</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">MAP2</td>
			<td class="xl19">Novus</td>
			<td class="xl19">NB300-213</td>
			<td class="xl19">chicken polyclonal, 1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">GFAP</td>
			<td class="xl19">Cell Signaling Technologies</td>
			<td class="xl19">CST12389S</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">D1-4G2 flavivirus envelope protein</td>
			<td class="xl19">EMD Millipore</td>
			<td class="xl19">MAB10216</td>
			<td class="xl19">mouse monoclonal, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">cleaved caspase-3</td>
			<td class="xl19">Cell Signaling Technologies</td>
			<td class="xl19">9661</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">488 anti-mouse IgG</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-11001</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">594 anti-rabbit IgG</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-11037</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">647 anti-chicken IgY</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-21449</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modelling zika virus infection of the developing human brain in vitro using stem cell derived cerebral organoids

Den nylige fremkomst af Zika virus (ZIKV) i modtagelige befolkninger har ført til en brat stigning i mikrocefali og andre neurologiske udvikling betingelser i nyfødte spædbørn. Mens myggene er den væsentligste overførselskilde viral, har det også vist at spredes via seksuel kontakt og lodret moderen til fosteret transmission. I dette sidstnævnte tilfælde af transmission, på grund af den unikke virale tropisme af ZIKV, menes virussen overvejende mål de neurale stamceller (NPC) af udvikle hjernen.
Her en metode til modellering af ZIKV infektion og den deraf følgende mikrocefali, der opstår, når menneskelige cerebral organoids udsættes for levende ZIKV er beskrevet. Organoids viser høje niveauer af virus inden for deres neurale stamfader befolkning, og udviser alvorlige celledød og mikrocefali over tid. Denne tre-dimensionelle cerebral organoid model gør det muligt for forskere at udføre arter-matchede eksperimenter for at observere og potentielt gribe ind med ZIKV infektion i at udvikle menneskelige hjerne. Modellen giver forbedret relevans over todimensional standardmetoder og indeholder menneskelige-specifikke cellulære arkitektur og protein udtryk, der ikke er muligt i dyremodeller.

I løbet af dagen af organoid dannelse bør SC kulturer i den log-vækst fase, hvor de er 50% - 70% sammenflydende, som vist i figur 1(A-C). Kulturer bør danne afrundede kolonier med forskellige kanter, og brøndene må være klar differentiering figur 1(D-E). Hvis differentiering sker, anbefales det at foretage en pick at fjerne for at rense de ramte områder inden for pladerne mindst én dag før oprettelse af organoids. Hvis en stor del af kulturen er differentieret, kan det være nødvendigt at foretage en ekstra passage, tø en ny hætteglas eller ændre stamcelle kultur teknikker for at sikre, at organoids dannes af ren stamcelle kulturer.
Dissociation af en kombination af enzym-fri og enzymatiske detachement reagenser behandling bør føre til for det meste enkelt celler, selvom der muligvis stadig små aggregater af celler observeret under optælling. Tilstedeværelsen af små aggregater synes ikke at forstyrre organoid dannelse, selvom det kan påvirke tælle nøjagtighed. Det anbefales at flere tæller er foretaget pr. prøve, og hvis tæller varierer med over 20%, kan det være nødvendigt at øge dissociation tid til at singularize celler yderligere.
Når cellerne er seedet og spundet ned i en ULA U-bunden 96-brønd plade (fig. 2A), vil de vises som en flad, tætte ark af celler i bunden af hver brønd. Cellerne vil langsomt samlet over de næste to dage. Det er bedst ikke at forstyrre pladen i løbet af disse 48 timer, som mekaniske kræfter kan forstyrre aggregeringen løst dannet. De første 10 dage, organoid vil forblive det meste sfærisk, og vil vokse fra ~ 300 µm til 600-800 µm (figur 2B). Flere observerbare strukturer begynder at dukke op i organoid mellem 10 og dag 20 (figur 2C-E). Ved dag 24, bør forskere kunne observere roset-lignende strukturer via brightfield mikroskopi (figur 2F). Samtidig med kulturen, kan disse neuroepithelial strukturer stige i antal og størrelse over flere dage (fig. 2G). Under feeds, vil forskeren bemærke betydelige mængder snavs indsamling på bunden af hver brønd, især i de første 2 uger af kultur. Spredning teknik beskrevet taktfast 2.2 fjerner de fleste af denne celleaffald at forhindre apoptotiske snavs fra akkumulere over flere feeds (fig. 3A). Dette snavs kan forstyrre imaging, det kan gøre det mere udfordrende at observere og kvantificere infektion-induceret celledød, og det kan give asymmetrisk signalerer til de omkringliggende organoid, der kan påvirke differentiering. Hvis spredning teknik er korrekt udført, dette bør blive reduceret (fig. 3B-C, 3D-E).
Det anbefales at foretage snit frosset organmateriale eller lightsheet imaging for at inspicere den kortikale struktur danner i organoids. I dag 25 organoids er roset strukturer og ventrikulær zoner klart synlig i DAPI (figur 4A) og phospho-vimentin (fig. 4B) farvning. Tilstedeværelsen af TBR2 (fig. 4C) angiver at mellemliggende stamfaderen danner, med en morfologi, der tyder på passiv migration. MAP2 + (figur 4D) neuroner udfylde de ydre regioner af hver roset. Fra disse proteiner, kan man visualisere ventrikulær zone (VZ), subventricular zone (SVZ), mellemliggende zone (IZ) og cortical plade (CP) inden for hver roset (figur 4E, 4E'). Man kan fortsætte med at kultur disse organoids for at observere senere stadier af udvikling. Mens kortikale lagdeling ikke er så fremtrædende i denne type af organoid, forekommer meget naturlige skifte til gliogenesis, som det gør i vivo. Dette kan ses i dag 108 organoids, hvor en stor del af cellerne udtrykke enten MAP2 eller GFAP (figur 4F-jeg).
Brugerne kan forvente at se forskelle i organoid størrelse af ca 3 dage efter ZIKV infektion, afhængig af den virale MOI anvendt til organoids (figur 5A-B). Efter disse 3 dage, kommer der en stigning i cellular vragdele i inficerede brøndene sammenlignes med forlorne brøndene. Denne forskel i organoid størrelse vil stige i den følgende uge, indtil de inficerede organoids begynder at bryde fra hinanden (figur 5C-D). En bred vifte af assays kan anvendes på dette punkt at undersøge infektion mekanismer, herunder viral RNA udvinding og cryosectioning (anbefalet antistoffer rapporteret i tabel materialer). Ved cryosectioning, vil brugere observere en stor forekomst af virus i den apikale region af neuroepithelial strukturer, hvilket tyder på en modtagelighed af neurale stamceller (NPC) til at ZIKV infektion (figur 6). Immunfluorescens af sektioneret organoids viser også en stigning i kløvet caspase-3 udtryk i den inficerede organoids (figur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig1.jpg"> 
Figur 1 : Stem cell koloni morfologi før organoid dannelse. Kolonier bør være 50-70% sammenflydende på tidspunktet for dissociation til at producere et stort antal ensartet organoids. (A) sparsomme, for nylig seedet kulturer har endnu ikke nået log-vækst fase, og vil ikke producere mange organoids. (B) når cellerne når ordentlig sammenløbet, de er klar til dissociation. Det er også vigtigt, at disse kolonier inspiceres for at sikre, at de er klart af differentiering. (C) kolonier, der er taget for langt vil nå over sammenløbet og anbefales ikke til organoid dannelse. Kulturer i denne tilstand er mere tilbøjelige til at indeholde differentiering celler. (D) koloni kanter bør være adskilte, med konsekvent celle morfologi af afrundede celler i midten, og lidt aflange celler mod kanterne. (E) Minimal differentiering bør være til stede i kulturerne. Hvis større, fladtrykte celler er observeret i centre eller kanter af kolonier (hvid pilespidser) og udgør mere end ca. 1% af kulturen, anbefales det, at pick at fjerne eller ekstra passager er udført for at danne et ensartet stamcelle befolkning.<a href="//ecsourc href=""></a href="//ecsourc>e.Jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig1large.jpg"target ="_blank"> Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig2.jpg"> 
Figur 2 : Cerebral organoid vækst over tid. 
(A) et diagram til produktion af cerebral organoids fra 2D PSC'er vedligeholdes i xeno-fri, feeder-frit medium. (B) i de første 8 dage, organoids forbliver det meste sfæriske med nogle påviselige funktioner. Diameteren af organoid vil variere fra ca. 300 µm til 500 µm. (C-E) på dagen 10, klarere regioner vil begynde at kunne påvises rundt i periferien af organoids, og de vil miste deres kugleform. De vil fortsætte med at stige i størrelse til ca 1 mm i diameter, i høj grad afhængig af linjen celle bliver brugt til at producere organoids. (F) efter ca 20 dage med differentiering, brugere vil observere dannelsen af neuroepithelial strukturer (sort pilespidser) i de fleste organoids klart perifere regioner. Disse har en ring-lignende morfologi, med apikale og basale strukturer efterligne dem af udvikle cortex. (G) disse neuroepithelial strukturer vil fortsætte med at vokse og tiltage i størrelse til cirka 20-30 dage. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig3.jpg"> 
Figur 3 : Clearing af celleaffald via dispersion feed teknik. Under organoid vækst, en stor mængde af celledød er forventeligt, og kan føre til ophobning af celleaffald omkring bunden af organoid. (A) den afbillede spredning teknik giver forskere til at fjerne det meste af dette snavs under hver foder. For at gøre dette, ved hjælp af en multikanalpipette P200 langsomt udarbejder den anvendte medium og hurtigt udvise for at løfte den organoid og celle debris i suspension. Organoid vil hurtigt falde til bunden af brønden, på hvilket tidspunkt en regelmæssig foder kan gennemføres. Eksempler på en dag 6 organoid før (B) og efter (C) dispersion fodring viser betydelig vragrester reduktion. Dette fortsætter i flere uger, som det fremgår af en dag 18 organoid før (D) og efter (E) dispersion fodring. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig4.jpg"> 
Figur 4 : Karakterisering af cerebral organoids via Immunhistokemi. Lightsheet billeder af cerebral organoids er vist at give et eksempel på det cellulære arkitektur, der danner. På dag 25, DAPI (A) og fosfor-Vimentin (B) angive individuelle rosetter og de ventrikulære zoner, henholdsvis. (C) TBR2 etiketter mellemliggende stamfaderen, der overflytter udad og MAP2 (D) etiketter neuroner, der har dannet i den kortikale plade. (E, E') Kombinationen af disse proteiner viser tydeligt sammenfatning af kortikale udvikling i cerebral organoid modeller. (F-jeg) Af dagen 108 opstod gliogenesis med en blanding af GFAP + og MAP2 + celler fylde meget af organoid. VZ = ventrikulær zone, SVZ = subventricular zone, IZ = mellemliggende zone, CP = kortikale plade. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig5.jpg"> 
Figur 5 : Nedbrydning af inficerede organoids. 
(A) lysfelt billeder af Mock og ZIKV-inficerede cerebral organoids på MOI = 0,1 og 10. Billeder blev taget umiddelbart efter infektion (dag 0), samt 3 og 6 dage efter infektionen. (B-C) Brightfield billeder af celle debris omkring (B) mock og (C) ZIKV-inficeret på MOI = 10 cerebral organoids 3 dage efter infektionen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig6.jpg"> 
Figur 6 : Cryosection og immunfluorescens af inficeret organoids. Dag 24 organoids blev udsat for ZIKV på MOI = 0,1 og cryosectioned 6 dage senere. På dette stadium er der en klar tilstedeværelsen af virus i de ventrikulære, subventricular og mellemliggende zoner i organoid, hvor neurale stamceller og radial glia bor. (A) Via nukleare farvning, disse neuroepithelial områder er klart synlig grund (hvide pile) til den høje tæthed af kerner, der danner ring-lignende strukturer omkring den apikale overflade. (B) ved farvning for den virale kuvert, kan man iagttage en relativt høj forekomst af virus i disse roset strukturer (hvid pilespidser). Bemærk at der er en lille mængde af virus til stede i forskellige uidentificerede perifere celler. (C-D) MAP2 eller andre neuron-specifik pletter viser, at der neuroner i de kulturer, der ikke synes at blive inficeret af virus når belagt med viral pletten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig7.jpg"> 
Figur 7 : Kløvet caspase-3 immunfluorescens af inficerede organoid. Efter infektion, kan man bruge apoptotiske indikatorer til at efterforske de mekanismer af celledød, der forekommer inden for organoids. I dette eksempel, dag 24 organoids blev udsat for ZIKV på MOI = 0,1 og cryosectioned 6 dage senere. (A) ikke-inficerede organoids viser ingen virale kuvert (4 g 2 protein), og en minimal mængde af kløvet caspase-3 på grund af homeostatiske apoptose forekommer i vævet. (B) inficerede rosetter begynder at vise øget niveauer af apoptose. (C) rosetter, der viser alvorlig infektion via 4 g 2 farvning også tendens til at udstille høje niveauer af kløvet caspase-3 i disse regioner. Der er en direkte sammenhæng mellem infektion sværhedsgrad og kløvet caspase-3 udtryk inden for de inficerede rosetter. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids at JoVE.com

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

Denne protokol beskriver en teknik, der anvendes til at modellere Zika virusinfektion i at udvikle menneskelige hjerne. Brug vildtype eller manipuleret stamcellelinjer, kan forskere bruge denne teknik til at afdække de forskellige mekanismer eller behandlinger, der kan påvirke tidlige hjernen infektion og deraf følgende microcephalus i Zika virus-inficerede embryoner.

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Vurdering af cellecyklusprogression af neurale stam-og stamcelle i Mouse hjernens udvikling efter Genotoksisk Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging mitosens i udviklingslandene mus embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Udvikling af HiPSC-afledte serumfrit embryoidorganer til undersøgelse af 3-D stamcellerkulturer ved anvendelse af fysiologisk relevante analyser

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

3D-billeddannelse i høj opløsning af rabies virus infektion i et solvent renset hjernevæv

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Analyse af oversættelse i den udviklende musehjerne ved hjælp af polysom profilering

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Transplantation af humant induceret pluripotent stamcelleafledt mikroglia i immunkompetente mushjerne via ikke-invasiv transnasal vej

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust og meget reproducerbar generation af kortikale hjerneorganoider til modellering af hjernens neuronale ældning in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

Robust Tissue Fabrication for Long-Term Culture of iPSC-Derived Brain Organoids for Aging Research

Robust vævsfabrikation til langsigtet kultur af iPSC-afledte hjerneorganoider til aldringsforskning

The currently available animal and cellular models do not fully recapitulate the complexity of changes that take place in the aging human brain. A recent ...