Name: modelling zika virus infection of the developing human brain in vitro using stem cell derived cerebral organoids
Uploaded: 2017-09-19T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids at JoVE.com

Авторы благодарят за помощь с первоначального распространения и количественной оценки ZIKV Ян л Присцилла и Доминик J. Бурри из Гарвардской медицинской школы. Мы также хотели бы поблагодарить Натаниэль D. Киркпатрик для поддержки визуализации. К.е. поддержали центр Стэнли психиатрических исследований и Гарвардского института стволовых клеток.

1. Создание мозгового Organoids с iPSC / Госкомсанэпиднадзором 2D культуры (день 0) Примечание: этот протокол предполагает, что содержание стволовых клеток (СК) проводится в среде ПКВВ с vitronectin или Geltrex субстрат. При использовании альтернативного, высоким содержанием белка клеточной культивирования СМИ, рекомендуется переход SC культур ПКВВ для по крайней мере два прохода до начала формирования органоид. Протокол не было протестировано на основе подачи SC культуры методами.
<ol><li>Использование регулярных SC обслуживания методы 25 , 26, принести культур до 50% - 70% слияния. Обычно это 3-4 дней после пассированый, хотя это может быть зависимыми от культуры метода и клеток линии. 
	Примечание: Приблизительно 2 скважины от 6-ну пластины необходимо производить полный 96-луночных тарелку organoids.</li>
	<li>Проверить культур через brightfield микроскопии в 10 X-20 крат для обеспечения здорового колонии морфологии, не поддающиеся обнаружению дифференциации.</li>
	<li>Принесите ПКВВ до 37 ° C в ванну с горячей водой и оттепели 50 мкл флаконе 50 мм Y-27632 (ингибитор рок) и 2 мл реагента ферментативные отряд до комнатной температуры.</li>
	<li>Подготовить ультра-низким насадку (Ула) 96 U-дно хорошо пластины, многоканальные пипетки Р200 и водохранилище 25 мл реактива.</li>
	<li>Аликвота 45 мл ПКВВ в 50-мл Конические трубки и 45 мкл 50 мм Y-27632. Смесь тщательно на истирание.</li>
	<li>Вакуумный аспирационная две скважины, содержащих SCs и быстро добавить 1 мл реагента фермента бесплатно отряд в каждой хорошо с помощью пипетки P1000. Инкубировать пластину в инкубаторе 37 ° C на 4 мин</li>
	<li>Вакуумный аспирационная обрабатываемой скважины и добавьте 1 mL реагента ферментативные отряд для каждой скважины с помощью пипетки P1000.
	<ol><li>Инкубировать пластину в инкубаторе 37 ° C для еще 5 минут</li>
		<li>Удалить пластину и изучить обрабатываемой скважины. Осторожно нажмите на пластину порвать агрегированных клетки. Если кластеры больших клеток до сих пор видны, инкубировать пластину для 2 дополнительных минут при 37 ° C. повторить этот шаг до тех пор, пока кластеры больше не видны невооруженным глазом,.</li>
	</ol></li> <li>После того, как клетки правильно отделить, добавить 1 мл ПКВВ каждой скважины для деактивации диссоциации ферментов. Бассейн 4 мл суспензии клеток в 50-мл Конические трубки и взять небольшой аликвота для подсчета клеток.
	<ol><li>Вернуть инкубатора 37 ° C любые оставшиеся, неочищенные скважин в пластину обслуживания.</li>
	</ol></li> <li>Во время подсчета голосов, центрифуга суспензию клеток на 300 g x 5 мин</li>
	<li>Определить общее количество клеток и рассчитать количество ПКВВ + Y-27632 решения, которые будут необходимы для достижения 60 000 клеток/мл суспензии.</li>
	<li>Тщательно вакуум аспирацию супернатант и добавить вычисляемый объем ПКВВ + Y-27632 решения. Смешайте 5 - 10 раз с 5 мл пипетки, обеспечение единой клетки подвеска.</li>
	<li>Немедленно передавать суспензию клеток в водохранилище реагента и Пипетка 150 мкл в каждой скважине ULA U-дно 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов Р200. Это производит 96 отдельных organoids, каждый первоначально состоящий из 9000 клеток.</li>
	<li>Центрифуга пластину на 150 x g за 1 мин</li>
	<li>Установите пластину в инкубаторе 37 ° C и не беспокоить плиты для 48 ч.</li>
</ol> 2. Церебральный органоид обслуживания (день 2) <ol><li>подготовить 17 мл ПКВВ с 17 мкл 50 мм Y-27643 в 50-мл Конические трубки. Теплый ПКВВ + Y-27632 решение до 37 ° C в ванне с горячей водой.</li>
	<li>Взять органоид пластина из инкубатора и с помощью многоканальных дозаторов Р200 равным 75 мкл, медленно составить среднего от края колодца в первой строке. После того, как был составлен среды, быстро высылать средних обратно в скважину поднять вверх свободные клетки и organoids. Повторите это действие для каждой строки. 
	Примечание: Этот метод, именуемый &#34; дисперсии, &#34; поднимает сотовой мусора и органоид в подвеска. Органоид быстро опускается на дно колодца, в то время как в подвеску, позволяя ему быть удалены с изменением СМИ остается меньше мусора. Это помогает предотвратить органоид от отдыха в сотовой мусора во время культуры.
	<ol><li>После того, как все скважины были разогнаны, подождите 15 s для обеспечения что organoids канули в нижней части каждой скважины.</li>
	</ol></li> <li>Медленно и осторожно аспирационная 75 мкл среды от каждой хорошо с помощью многоканальных дозаторов Р200 и отказаться от отходов водохранилище. 
	Примечание: Большинство пользователей время от времени аспирационная органоид во время регулярных каналов. Это может произойти примерно 1% из времени. Пожалуйста, планируйте соответственно обеспечить, что достаточно organoids дожить до времени экспериментальных точек.</li>
	<li>Передачи ПКВВ + Y-27632 раствора в пласт реагентов и отказаться от 150 мкл в каждой органоид, хорошо с помощью многоканальных дозаторов Р200.</li>
	<li>Место пластину обратно в инкубатора 37 ° С.</li>
</ol> 3. Церебральный органоид техническое обслуживание (3 день) <ol><li>теплый 17 мл ПКВВ до 37 ° C, это время без Y-27643.</li>
	<li>С многоканальные пипетки P200, равным 100 мкл, разогнать все скважины органоид плиты (см. шаг 2.2). Подождите 15 s для обеспечения что organoids канули в нижней части их скважин.</li>
	<li>Подготовить отходов водохранилища и передачи утепленные ПКВВ в источник водохранилище.</li>
	<li>Тщательно аспирационная 125 мкл среды от каждой скважины и заменить 150 мкл свежих ПКВВ, используя многоканальные пипетки Р200.</li>
	<li>Место пластину обратно в инкубатора 37 ° С.</li>
</ol> 4. Церебральный органоид техническое обслуживание (день 4 +) Примечание: проводить это регулярное техническое обслуживание каждый день до инфекции.
<ol><li>Перед началом канала на 4 день, подготовить среднего нейронной индукции (NI).
	<ol><li>Оттепель 250 мкл Алиготе 2 мг/мл гепарина, вместе с 5 мл флакон 100 X N-2 дополнения. Добавьте 250 мкл концентрированного препарата гепарин, 100 X N-2 5 мл и 5 мл 100 X MEM-NEAA в 500 мл DMEM / F12 + GlutaMAX. Стерильными фильтр смешанного решения в фильтре 500 мл. 
		Примечание: Держите NI на 4 ° C, когда не в пользе; NI длится до двух недель, прежде чем свежие среднего должен быть подготовлен.</li>
	</ol></li> <li>Теплый 17 мл NI средних 37 ° C.</li>
	<li>С многоканальные пипетки P200, равным 100 мкл, разогнать все скважины органоид плиты (см. шаг 2.2). Подождите 15 s для обеспечения что organoids канули в нижней части их скважин.</li>
	<li>Подготовка отходов водохранилища и передачи утепленные NI в исходный резервуар.</li>
	<li>Тщательно аспирационная 125 мкл среды от каждой скважины и заменить 125 мкл свежих NI с помощью многоканальных дозаторов Р200.</li>
	<li>Место пластину обратно в инкубатора 37 ° С.</li>
</ol> 5. Органоид инфекции с ZIKV (~ 24 день) Примечание: после приблизительно 3 недели дифференциации, там wiLL быть большой нейроэпителиальных структур и розеток, видимый в пределах органоид, что будет очень чувствительны к инфекции ZIKV.
<ol><li>Принести Эрл &#39; s 1 X сбалансированный соли раствора (EBSS), 1 X PBS и NI до 37 ° C в ванне с горячей водой.</li>
	Кратность <li>развести ZIKV известной концентрации в 1 X EBSS к целевой инфекции инфекции (МВД). 
	Примечание: Титрование различных MOIs рекомендуется для достижения дозу вирусного ответа. Это может варьироваться от штамма вируса; для ATCC VR-1838 и ATCC VR-1843, типичный MOI значения в диапазоне между 0,1 и 10).</li>
	<li>Тщательно удалить все среднего из органоид, хорошо с помощью пипетки Р200 один канал. Быстро добавить 200 мкл ПБС в каждой хорошо с помощью Р200 многоканальные пипетки мыть organoids.</li>
	<li>Тщательно удалить все среднего из органоид, хорошо с помощью пипетки Р200 один канал. Быстро добавьте 50 мкл 1 X EBSS-только (макет инфекции) или ZIKV вирус решение хорошо и убедитесь, что органоид полностью погружены. Повторите эти действия для каждого органоид, который должен быть инфицированы для изучения.</li>
	<li>Место пластину обратно в 37 ° C-инкубатор для 2 х. 
	Примечание: Инкубации макет инфицированных organoids за этот срок не должен значительно снижают их роста по сравнению с ненарушенных organoids.</li>
	<li>Около 30 мин до вирусной инкубации завершена, аликвота 25 мл NI в 50-мл Конические трубки и довести до 37 ° C в ванне с горячей водой.</li>
	<li>После завершения вирусных воздействия, мыть organoids с 200 мкл ПБС для каждой скважины, позволяют organoids соглашаться на 15 s, а затем удалить 1 X PBS с помощью пипетки одноканальный Р200.</li>
	<li>Добавить 200 мкл свежие NI для каждой скважины и место обратно в инкубаторе.
	<ol><li>Дополнительно: за сутки 0 время точка, organoids может быть imaged один час после инфекции.</li>
	</ol></li> <li>Продолжать культуры, заменив 125 мкл NI каждый день, с помощью метода дисперсии (см. шаг 4). Не забудьте правильно утилизируйте отработанные средств массовой информации и советов, как это содержит инфекционные частицы ZIKV.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jurado, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+productively+infects+primary+human+placenta-specific+macrophages.">Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages.</a> JCI Insight. 1, 1-6 (2016).</li><li>Quicke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Placental+Macrophages.">Zika Virus Infects Human Placental Macrophages.</a> Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).</li><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).</li><li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly.">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).</li><li>Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+and+Microcephaly.">Zika Virus and Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).</li><li>Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Brain+Abnormalities+and+Zika+Virus:+What+the+Radiologist+Can+Expect+to+See+Prenatally+and+Postnatally.">Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally.</a> Radiology. , 161584 (2016).</li><li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells.">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89, 8880-8896 (2015).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth.">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inhibitors+of+Zika+virus+infection+and+induced+neural+cell+death+via+a+drug+repurposing+screen.">Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen.</a> Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of virology. , 00009-00017 (2017).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).</li><li>Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+(PRVABC59)+Infection+Is+Associated+with+T+cell+Infiltration+and+Neurodegeneration+in+CNS+of+Immunocompetent+Neonatal+C57Bl/6+Mice.">Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice.</a> PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Mice+Causes+Panuveitis+with+Shedding+of+Virus+in+Tears.">Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears.</a> Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).</li><li>Dudley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+macaque+model+of+Asian-lineage+Zika+virus+infection.">A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection.</a> Nat Commun. 7, 12204 (2016).</li><li>Li, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+2016+Clinical+Isolate+of+Zika+Virus+in+Non-human+Primates.">Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates.</a> EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).</li><li>Osuna, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+viral+dynamics+and+shedding+in+rhesus+and+cynomolgus+macaques.">Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques.</a> Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).</li><li>Cugola, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Brazilian+Zika+virus+strain+causes+birth+defects+in+experimental+models.">The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models.</a> Nature. , (2016).</li><li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids.">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352, 816-818 (2016).</li><li>Wells, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Ablation+of+AXL+Does+Not+Protect+Human+Neural+Progenitor+Cells+and+Cerebral+Organoids+from+Zika+Virus+Infection.">Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection.</a> Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Depletes+Neural+Progenitors+in+Human+Cerebral+Organoids+through+Activation+of+the+Innate+Immune+Receptor+TLR3.">Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organized+Formation+of+Polarized+Cortical+Tissues+from+ESCs+and+Its+Active+Manipulation+by+Extrinsic+Signals.">Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501, 373-379 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li><li>Contreras, D., Arumugaswami, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infectious+Cell+Culture+System+and+the+In+Vitro.+Prophylactic+Effect+of+Interferons.">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons.</a> J Vis Exp. , e10-e13 (2016).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Есть несколько моментов, нужно учитывать при использовании человеческого мозга organoids расследовать ZIKV инфекции. Одно из важных соображений является что органоид формирование и структура сильно зависит от линии стволовых клеток, из которых они формируются. Соблюдайте осторожность при сравнении между клеточных линий, включая isogenic инженерных линий; Это лучше сделать выводы, используя несколько subclones и в идеале несколько линий стволовых клеток. Кроме того благодаря этой разнице в клеточных линий, рекомендуется экспериментальные опыты для обеспечения надлежащего разграничения происходит в organoids. В то время как нейроэпителиальных структуры видны brightfield микроскопии, предлагается также проводить эксперименты qRT ПЦР или cryosectioning искать нейронных дифференциация маркеры например PAX6 или фосфо виментин.
Следует также ожидать значительной изменчивости среди organoids в пределах одной и той же линии клеток. Из-за неупорядоченный характер протокола количество и размер нейроэпителиальных структур может варьироваться между отдельными organoids. Как правило, можно ожидать по крайней мере две большие (&gt; 200 мкм в диаметре D24) Нейронные розетки за органоид. По этой причине продольного исследования, например, наблюдение изменений в размер органоид после инфекции, особенно поучительный. Изменчивость между партиями возможны также, с наиболее вероятной причиной для этого неточной клеток подсчета или посев. Рекомендуется проводить несколько графов и убедиться, что суспензию клеток хорошо перемешивается перед посевом на ULA U-дно 96-луночных пластин.
При культивировании organoids в ULA U-дно 96-луночных пластины, план увидев последствия значительного испарения по краям пластин. Это идеальное место для заполнения этих скважин с PBS и работать только с 60 скважин центр. Из-за испарения organoids в наружной скважин будет подвергаться воздействию различных условиях, чем те, в центре, который скорее всего будет влиять на их рост и дифференцировку. Пожалуйста, учитывайте это при планировании количество organoids, которые будут необходимы для экспериментов. Кроме того organoids начнет зарастают 96-луночных формат после примерно 30 дней, которые будут видны благодаря окраске питательной среды. Если планируете принимая organoids за последние 30 дней, рекомендуется передать organoids пластины 24-ну Ула. Для осуществления перевода, используйте ножницы, чтобы вырезать кончик P1000, так что открытие гораздо больше, чем organoids сами и передача organoids закупорить.
Человеческого мозга organoids держать большой потенциал в развитии понимания области нейроразвития и болезней. Исследователи, предлагается изменить протокол при необходимости. Например один может реализовать патронирования факторы повышения эффективности дифференциация к типы конкретных клеток, позволяя им исследовать вирусных воздействия на определенных анатомических областей. Эффекты нервной ZIKV все еще плохо поняты, но этот новый подход даст исследователи доступным, быстрый и высок объём способ изучения механизмов инфекции.

Зика вирус (ZIKV) быстро распространился в Микронезии, Французская Полинезия и Америки и недавно было показано, чтобы пересечь плацентарный барьер1,2 , чтобы заразить развивающегося мозга плода, приводит к заболеваниям нервной такого микроцефалия3,4,5,6 . Долгосрочное воздействие на жизнь этих пациентов и отсутствие лечения, в настоящее время привела исследователей и клиницистов карабкаться для лучшего понимания механизмов за ZIKV инфекции и репликации. Предыдущие исследования изучили ZIKV инфекции в vitro систем в различных физиологически соответствующие ячейки типов,78,9, а также в естественных условиях10 с иммунокомпетентных и ослабленным мышей11,12,13 и нечеловеческих приматов14,,1516. Помимо этих более традиционные методы несколько групп осуществили стволовых клеток мозга organoids понять больше о ZIKV инфекции развивающегося человеческого мозга. Эти группы использовали человеческого мозга organoids для подтверждения микроцефалия фенотип17,18, расследовать рецепторы, связанные с вирусом запись19, изучать физиологические реакции на инфекции20 , 21и, возможно, экран для наркотиков кандидатов22. Здесь описана методика для быстрого производства и заражение мозга organoids стволовых клеток, полученных, как показано ранее19, чтобы улучшить понимание ZIKV инфекции развивающегося человеческого мозга.
Так как organoids формируются из стандартных плюрипотентных стволовых клеток (PSC) культур, эта техника позволяет для различных научных вопросов ответы относительно вирусной инфекции развивающегося мозга. Например ТРИФОСФАТЫ инженерия может использоваться для изменения эти PSC линии до органоид инфекции более быстрыми темпами, чем большинство в vivo генетических исследований19. Кроме того в отличие от стандартных двух размеров (2D) дифференциация культур, organoids экспонат комплекса сотовой архитектуры, которая имеет решающее значение для corticogenesis, и недавние исследования показали, что эта архитектура может быть нарушена при инфекции 21. Наконец относительно низкая стоимость генерации organoids позволяет выше пропускная способность экспериментов и скрининга по сравнению с моделями в естественных условиях . С другой стороны есть некоторые недостатки использования organoids учиться ZIKV. В то время как organoids биологически гораздо более актуальными, чем 2D культур, есть дополнительные проблемы в оценке organoids ввиду их трехмерные (3D). Изображений и диссоциации organoids стремится привлекать больше оборудования и больших инвестиционных ресурсов, чем стандартные 2D культур. Кроме того organoids отсутствие сосудистую и иммунологические компонентов, которые присутствуют в естественных условиях модели, поэтому исследователей, заинтересованных в те аспекты вирусной инфекции рекомендуется искать альтернативный протокол.
Существует ряд методов для формирования человека organoids и neurospheres в культуре, и они обычно подпадают под рисунком или неупорядоченный категории. Узорные методы реализуют факторы регулирования Wnt, BMP, TGFβ и других сигнальных путей, добиваться дифференциации сторону конкретных линий23. Неупорядоченный такие методы, как один описаны здесь, воспользуйтесь склонность к индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) дифференцировать сторону нейроэктодермальная линии по умолчанию24. После примерно трех недель дифференциации результирующий organoids состоят из больших, biomimetic нейроэпителиальных структур, которые содержат несколько типов клеток, которые наблюдаются в начале развивающегося мозга.
Техника для производства organoids от стандартных, фидер бесплатно PSC культур и заражение этим organoids с ZIKV представлена в полном объеме. Руководство по культивирования методы, необходимые для подачи Бесплатный уик обратитесь к предыдущим методы публикации25,26. Кроме того для того, чтобы применить последовательное количество вируса для нескольких экспериментов, важно рассчитать MOI впереди времени. Это делается путем проведения инфекцию клеток Веро, следуют обращения с среднего оверлея, инкубации и иммуноокрашивания. Описания и методов этой техники были ранее описанных19,27.
PSC культуры при достижении целевого объекта слияния 50-70%, клетки затем отделить и агрегированы в ультра-низким насадку 96-луночных пластины. Клетки для 3 дней в средствах массовой информации содержание xeno бесплатно стволовых клеток (ПКВВ) и затем преобразуется в нейронной индукции СМИ на оставшуюся часть культуры. Как только organoids имеют дифференцированные за 3 недели, инфекция может проводиться. Регулярно принимая изображения в течение недели после инфицирования, исследователи будут соблюдать прогрессивного клеточной смерти и нарушение органоид. Исследователи также может отделить organoids в это время проводить транскрипционный анализ или proteomic профилирования. Методы Cryosectioning и lightsheet рекомендуются для обработки изображений, и исследователи могут ожидать высокий уровень инфекции и вирусной репликации, особенно в пределах нейронных прогениторных клеток (NPC) населения в organoids. В конечном счете эта техника позволяет исследователям быстро изучить механизмы вирусной инфекции мозга человека с низкой стоимостью и ограниченным оборудования.

<table style="border-collapse:collapse;width:1358pt" width="1811">
	<colgroup>
		<col style="width:317pt" width="423" />
		<col style="width:158pt" width="211" />
		<col style="width:134pt" width="178" />
		<col style="width:749pt" width="999" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="width:317pt;height:26.25pt" width="423">Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8</td>
			<td class="xl19" style="width:158pt" width="211">StemCell Technologies</td>
			<td class="xl19" style="width:134pt" width="178">5940</td>
			<td class="xl19" style="width:749pt" width="999">Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton.&#160; Store at 4 &#7506;C for up to two weeks after prepared from individual components</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR</td>
			<td class="xl19">StemCell Technologies</td>
			<td class="xl19">5873</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Enzymatic Detachment Reagent, Accutase</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">A11105-01</td>
			<td class="xl19">Store aliquoted at -20 &#7506;C, do not keep thawed for longer than necessary</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Y-27632</td>
			<td class="xl19">Selleck Chem</td>
			<td class="xl19">S1049</td>
			<td class="xl19">Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 &#7506;C in 50&#181;L aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td class="xl19">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">D2650-100ML</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">10565-018</td>
			<td class="xl19">(+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">N-2 Supplement (100X)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">17502-048</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">11140-050</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Heparin</td>
			<td class="xl19">Sigma-Adrich</td>
			<td class="xl19">H4784-1G</td>
			<td class="xl19">Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 &#7506;C in 250&#181;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
			<td class="xl19">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td class="xl19">SH30029.02</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Stericup Filter (500mL)</td>
			<td class="xl19">Millipore</td>
			<td class="xl19">220009-140</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom</td>
			<td class="xl19">Corning</td>
			<td class="xl19">7007</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL)</td>
			<td class="xl19">Integra</td>
			<td class="xl19">4312</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td>
			<td class="xl19">Rainin</td>
			<td class="xl19">17013810</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible</td>
			<td class="xl19">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75007210</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Culture Plate Centrifuge Rotor</td>
			<td class="xl19">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75005706</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Vero Cells</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">CCL-81</td>
			<td class="xl19">For virus expansion, if necessary</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Zika Virus (Uganda Strain)</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">VR-1838</td>
			<td class="xl19">Other strains may be used</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Zika Virus (Puerto Rico Strain)</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">VR-1843</td>
			<td class="xl19">Other strains may be used</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">phospho-vimentin</td>
			<td class="xl19">MBL</td>
			<td class="xl19">D076-3</td>
			<td class="xl19">mouse polyclonal,&#160; 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">TBR2</td>
			<td class="xl19">Abcam</td>
			<td class="xl19">ab23345</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">MAP2</td>
			<td class="xl19">Novus</td>
			<td class="xl19">NB300-213</td>
			<td class="xl19">chicken polyclonal, 1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">GFAP</td>
			<td class="xl19">Cell Signaling Technologies</td>
			<td class="xl19">CST12389S</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">D1-4G2 flavivirus envelope protein</td>
			<td class="xl19">EMD Millipore</td>
			<td class="xl19">MAB10216</td>
			<td class="xl19">mouse monoclonal, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">cleaved caspase-3</td>
			<td class="xl19">Cell Signaling Technologies</td>
			<td class="xl19">9661</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">488 anti-mouse IgG</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-11001</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">594 anti-rabbit IgG</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-11037</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">647 anti-chicken IgY</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-21449</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modelling zika virus infection of the developing human brain in vitro using stem cell derived cerebral organoids

Недавнее появление Зика вируса (ZIKV) в восприимчивых групп населения привело к резкое увеличение микроцефалия и других условий психомоторного развития у новорожденных. Хотя комаров являются основные пути передачи вируса, оно также было показано для распространения через половой контакт и вертикальной передачи матери и плода. В этом последнем случае передачи, благодаря уникальной вирусный тропизм ZIKV вирус считается преимущественно целевой нейронных прогениторных клеток (НПС) развивающегося мозга.
Здесь метод для моделирования ZIKV инфекции и результирующая микроцефалия, которые возникают, когда человеческого мозга organoids подвергаются жить ZIKV описано. Organoids отображения высокий уровень вируса в пределах их нейронных прародитель населения и тяжелой клеточной смерти и микроцефалия с течением времени. Эта модель трехмерной мозгового органоид позволяет исследователям проводить эксперименты, подобранных видов, наблюдать и потенциально вмешаться с ZIKV инфекцией развивающегося человеческого мозга. Модель обеспечивает улучшение релевантности над стандартной двумерной методами и содержит специфичные для человека сотовой архитектуры и выражение протеина, не возможны в животных моделях.

Watch this Scientific Journal Video about Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids at JoVE.com

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Моделирования Зика вирус развивающегося мозга человека в пробирке с помощью стволовых клеток получены мозгового Organoids

Этот протокол описывает метод, используемый для моделирования Зика вирусной инфекции развивающегося человеческого мозга. С помощью wildtype или инженерных стволовых клеточных линий, исследователи могут использовать эту технику для раскрыть различные механизмы или процедуры, которые могут повлиять на ранней инфекции головного мозга и полученный микроцефалия Зика вирусом эмбрионов.

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Оценка клеточного цикла Прогрессирование нервных стволовых и клеток-предшественников в развивающемся мозге мыши после Генотоксические стресса

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Разработка HiPSC-продуцированных сывороточных свободных эмбриоидных тел для опроса трехмерных культур стволовых клеток с использованием физиологически релевантных анализов

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Высокое разрешение 3D Изображение бешенства вирусной инфекции в Solvent-очищенных мозговой ткани

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Анализ перевода в развивающемся мозге мыши с использованием полисомного профилирования

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Трансплантация индуцированной человеком плюрипотентной микроглии, полученной из стволовых клеток, в мозг иммунокомпетентных мышей неинвазивным трансназальным путем

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Надежная и высоковоспроизводимая генерация органоидов кортикального мозга для моделирования старения нейронов головного мозга in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

Robust Tissue Fabrication for Long-Term Culture of iPSC-Derived Brain Organoids for Aging Research

Надежное тканевое производство для долгосрочного культивирования органоидов мозга, полученных из iPSC, для исследований старения

The currently available animal and cellular models do not fully recapitulate the complexity of changes that take place in the aging human brain. A recent ...