Name: modelling zika virus infection of the developing human brain in vitro using stem cell derived cerebral organoids
Uploaded: 2017-09-19T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids at JoVE.com

Författarna tackar Priscilla L. Yang och Dominique J. Burri på Harvard Medical School för hjälp med inledande förökning och kvantifiering av ZIKV. Vi skulle också vilja tacka Nathaniel D. Kirkpatrick för imaging stöd. K.E. stöddes av Stanley Center för psykiatriforskning och Harvard Stem Cell Institute.

1. skapa Cerebral Organoids från iPSC / hESC 2D kultur (dag 0) Obs: detta protokoll förutsätter att stamceller (SC) underhåll utförs i SCMM medium med Aktiebolaget Trav &amp; galopp eller Geltrex substrat. Om du använder en alternativ, proteinrik stamceller odlingsskålar media, är det tillrådligt att övergång SC kulturer till SCMM för minst två passager innan organoid bildandet. Protokollet har inte testats med feeder-baserade metoder för SC kultur.
<ol><li>Med regelbundna SC underhåll metoder 25 , 26, föra kulturer till 50-70% sammanflödet. Detta är vanligtvis 3-4 dagar efter passaging, men detta kan vara beroende av kultur metod och cell linje. 
	Obs: Cirka 2 brunnar från en 6-well platta behövs för att producera en fullständig 96-well platta av organoids.</li>
	<li>Inspektera kulturer via brightfield mikroskopi på 10 X-20 X förstoring att säkerställa hälsosamma kolonin morfologi, utan påvisbara differentiering.</li>
	<li>Ta SCMM till 37 ° C i ett vattenbad, och Tina en 50 µL injektionsflaska 50 mm Y-27632 (Rock-hämmare) och 2 mL av enzymatisk avlossning reagens rumstemperatur.</li>
	<li>Förbereder en ultralåg fastsättning (ULA) U-botten 96 väl platta, en flerkanalspipett P200 och en 25 mL reagens reservoir.</li>
	<li>Alikvotens 45 mL SCMM i en 50 mL konisk slang, och tillsätt 45 µL av 50 mM Y-27632. Blanda noggrant av triturating.</li>
	<li>Vakuum sug ut två brunnarna som innehåller SCs, och lägga till snabbt 1 mL av enzym-fri avlossning reagens till varje brunn med P1000 pipett. Inkubera plattan i en 37 ° C inkubator för 4 min.</li>
	<li>Vakuum sug ut behandlade brunnarna, och tillsätt 1 mL av enzymatisk avlossning reagensmedel till varje brunn med P1000 pipett.
	<ol><li>Inkubera plattan i en 37 ° C inkubator för en ytterligare 5 min.</li>
		<li>Ta bort plattan och undersöka behandlade brunnarna. Knacka försiktigt på plattan att bryta upp aggregerade celler. Om stora cell kluster är fortfarande synliga, inkubera plattan för 2 ytterligare min vid 37 ° C. Upprepa detta steg tills kluster inte längre synliga med blotta ögat.</li>
	</ol></li> <li>När cellerna dissocieras ordentligt, tillsätt 1 mL av SCMM till varje brunn för att inaktivera enzymerna som dissociation. Pool på 4 mL cellsuspension i en 50 mL konisk slang och ta en liten delmängd för cell inventering.
	<ol><li>Returnera eventuella återstående, obehandlade brunnar i underhåll plattan till 37 ° C inkubatorn.</li>
	</ol></li> <li>Och räkna, Centrifugera cellsuspension vid 300 x g för 5 min.</li>
	<li>Bestäm det totala antalet celler och beräkna mängden SCMM + Y-27632 lösning som kommer att behövas för att uppnå en 60 000 celler/mL suspension.</li>
	<li>Noggrant vakuum Aspirera supernatanten och lägga till den beräknade volymen av SCMM + Y-27632 lösning. Blanda 5 - 10 gånger med en 5 mL Pipettera, att säkerställa en enhetlig cellsuspension.</li>
	<li>Omedelbart överföra cellsuspensionen i en reagens reservoir och Pipettera 150 µL till varje brunn av ULA U-botten 96 brunnar plattan med hjälp av en flerkanalspipett P200. Detta ger 96 enskilda organoids, varje initialt bestående av 9 000 celler.</li>
	<li>Centrifugera plattan vid 150 x g i 1 min.</li>
	<li>Placera plattan i en 37 ° C inkubator, och stör inte plattan för 48 h.</li>
</ol> 2. Cerebral Organoid underhåll (dag 2) <ol><li>förbereda 17 mL SCMM med 17 µL av 50 mM Y-27643 i en 50 mL konisk slang. Värm på SCMM + Y-27632 lösning till 37 ° C i ett hett vattenbad.</li>
	<li>Ta organoid plattan ur ruvmaskinen, och med hjälp av en flerkanalspipett P200 anges till 75 µL, långsamt dra upp medium från kanten av brunnen på första raden. När mediet har dragits, snabbt utvisa medium baksida till brunnen för att lyfta upp lösa celler och organoids. Upprepa detta för varje rad. 
	Obs: Denna teknik, hädanefter kallad en &#34; spridning, &#34; lyfter cellulära skräp och organoid till suspension. Organoid sjunker snabbt till botten av brunnen, medan mindre skräp förblir i suspension, så att den kan tas bort med en media förändring. Detta hjälper till att förebygga organoid vilar i cellulära skräp under kultur.
	<ol><li>Efter alla brunnar har varit spridda, vänta 15 s för att säkerställa att organoids har sjunkit till botten av varje brunn.</li>
	</ol></li> <li>Långsamt och försiktigt aspirera 75 µL av medium från varje brunn med hjälp av den P200 flerkanalspipett och fördela i en avfall reservoar. 
	Obs: De flesta användare aspirera ibland en organoid under regelbunden feeds. Detta kan inträffa ungefär 1% av tiden. Vänligen planera därför att säkerställa att tillräckligt organoids överleva till experimentella tidpunkter.</li>
	<li>Transfer SCMM + Y-27632 lösning till en reagens reservoir, och fördela 150 µL i varje organoid väl med hjälp av en flerkanalspipett P200.</li>
	<li>Placera plattan tillbaka i en 37 ° C inkubator.</li>
</ol> 3. Cerebral Organoid underhåll (dag 3) <ol><li>varm 17 mL av SCMM till 37 ° C, denna gången utan Y-27643.</li>
	<li>Med den flerkanalspipett P200 inställd på 100 µL, skingra alla brunnar i plattan organoid (se steg 2.2). Vänta 15 s att se till att organoids har sjunkit till botten av deras brunnar.</li>
	<li>Förbereder en avfall reservoar och överföra värmde SCMM in en källkod reservoaren.</li>
	<li>Noggrant aspirera 125 µL av medium från varje brunn och ersätter med 150 µL av färska SCMM med hjälp av en flerkanalspipett P200.</li>
	<li>Placera plattan tillbaka i en 37 ° C inkubator.</li>
</ol> 4. Cerebral Organoid underhåll (dag 4 +) Obs: genomföra detta regelbundet underhåll varannan dag tills infektionen.
<ol><li>Innan du börjar fodret på dag 4, förbereda neurala induktion (NI) medium.
	<ol><li>Tina en 250 µL alikvot av 2 mg/mL heparin, tillsammans med en 5 mL injektionsflaska av 100 X n-2 tillägg. Tillsätt de 250 µL av heparin, 5 mL 100 X n-2 och 5 mL 100 X MEM-NEAA till 500 mL DMEM / F12 + GlutaMAX. Steril filtrera blandade lösningen i en 500 mL filter. 
		Obs: Håll NI vid 4 ° C när inte i använda; NI varar upp till två veckor innan färskt medium bör förberedas.</li>
	</ol></li> <li>Varm 17 mL NI medium till 37 ° C.</li>
	<li>Med den flerkanalspipett P200 inställd på 100 µL, skingra alla brunnar i plattan organoid (se steg 2.2). Vänta 15 s att se till att organoids har sjunkit till botten av deras brunnar.</li>
	<li>Förbereder en avfall reservoar och överföra värmde NI in en källkod reservoaren.</li>
	<li>Noggrant aspirera 125 µL av medium från varje brunn och ersätta med 125 µL av färska NI med hjälp av en flerkanalspipett P200.</li>
	<li>Placera plattan tillbaka i en 37 ° C inkubator.</li>
</ol> 5. Organoid infektion med ZIKV (~ dag 24) Obs: efter ca 3 veckor av differentiering, där will vara stora neuroepithelial strukturer och rosetter synliga inom den organoid som kommer att vara mycket mottagliga för ZIKV infektion.
<ol><li>Ta Engdahl &#39; s 1 X balanserad Salt lösning (EBSS), 1 X PBS och NI till 37 ° C i ett hett vattenbad.</li>
	<li>Dilute ZIKV av känd koncentration i 1 X EBSS till målet infektionen multiplicity av infektion (MOI). 
	Obs: Titreringar av olika MOIs rekommenderas en viral dos-respons. Detta kan variera beroende på virusstam; för ATCC VR-1838 och ATCC VR-1843, typiska MOI värden mellan 0,1 och 10).</li>
	<li>Ta försiktigt bort alla medium från organoid väl med enda kanal P200 pipett. Snabbt lägga till 200 µL 1 X PBS till varje brunn med en P200 flerkanalspipett för att tvätta organoids.</li>
	<li>Ta försiktigt bort alla medium från organoid väl med enda kanal P200 pipett. Snabbt Tillsätt 50 µL av 1 X EBSS-bara (mock infektion) eller ZIKV virus lösning väl och se till att organoid är helt nedsänkt. Upprepa för varje organoid som är att vara smittad för studien.</li>
	<li>Placera plattan tillbaka i en 37 ° C inkubator för 2 h. 
	Obs: Ruvning mock-infekterade organoids för denna varaktighet inte bör signifikant inverkan på deras tillväxt jämfört med ostörd organoids.</li>
	<li>Cirka 30 min innan viral inkubation är slutförda, alikvotens 25 mL av NI i en 50 mL konisk röret, och föra till 37 ° C i ett hett vattenbad.</li>
	<li>Efter viral exponering är klar, tvätta organoids med 200 µL 1 X PBS för varje brunn, tillåta organoids att reglera för 15 s, och sedan ta bort 1 X PBS med enda kanal P200 pipett.</li>
	<li>Tillsätt 200 µL av färska NI till varje väl, och placera tillbaka i inkubatorn.
	<ol><li>Tillval: för en dag 0 tid punkt, organoids kan avbildas en timme efter infektion.</li>
	</ol></li> <li>Fortsätt till kultur genom att ersätta 125 µL NI varannan dag med metoden dispersion (se steg 4). Tänk på att kassera förbrukade media och tips, eftersom detta innehåller smittsamma ZIKV partiklar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jurado, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+productively+infects+primary+human+placenta-specific+macrophages.">Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages.</a> JCI Insight. 1, 1-6 (2016).</li><li>Quicke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Placental+Macrophages.">Zika Virus Infects Human Placental Macrophages.</a> Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).</li><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report.">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).</li><li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly.">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).</li><li>Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+and+Microcephaly.">Zika Virus and Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).</li><li>Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Brain+Abnormalities+and+Zika+Virus:+What+the+Radiologist+Can+Expect+to+See+Prenatally+and+Postnatally.">Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally.</a> Radiology. , 161584 (2016).</li><li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells.">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89, 8880-8896 (2015).</li><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth.">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inhibitors+of+Zika+virus+infection+and+induced+neural+cell+death+via+a+drug+repurposing+screen.">Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen.</a> Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of virology. , 00009-00017 (2017).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).</li><li>Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+(PRVABC59)+Infection+Is+Associated+with+T+cell+Infiltration+and+Neurodegeneration+in+CNS+of+Immunocompetent+Neonatal+C57Bl/6+Mice.">Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice.</a> PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infection+in+Mice+Causes+Panuveitis+with+Shedding+of+Virus+in+Tears.">Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears.</a> Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).</li><li>Dudley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+macaque+model+of+Asian-lineage+Zika+virus+infection.">A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection.</a> Nat Commun. 7, 12204 (2016).</li><li>Li, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+2016+Clinical+Isolate+of+Zika+Virus+in+Non-human+Primates.">Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates.</a> EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).</li><li>Osuna, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+viral+dynamics+and+shedding+in+rhesus+and+cynomolgus+macaques.">Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques.</a> Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).</li><li>Cugola, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Brazilian+Zika+virus+strain+causes+birth+defects+in+experimental+models.">The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models.</a> Nature. , (2016).</li><li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids.">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352, 816-818 (2016).</li><li>Wells, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Ablation+of+AXL+Does+Not+Protect+Human+Neural+Progenitor+Cells+and+Cerebral+Organoids+from+Zika+Virus+Infection.">Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection.</a> Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Depletes+Neural+Progenitors+in+Human+Cerebral+Organoids+through+Activation+of+the+Innate+Immune+Receptor+TLR3.">Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).</li><li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids.">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organized+Formation+of+Polarized+Cortical+Tissues+from+ESCs+and+Its+Active+Manipulation+by+Extrinsic+Signals.">Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501, 373-379 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li><li>Contreras, D., Arumugaswami, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infectious+Cell+Culture+System+and+the+In+Vitro.+Prophylactic+Effect+of+Interferons.">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons.</a> J Vis Exp. , e10-e13 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Det finns flera fallgropar att tänka på när utnyttja mänskliga cerebral organoids att undersöka ZIKV infektion. Ett viktigt övervägande är det organoid bildandet och struktur är starkt beroende av raden stamceller som de bildas. Var försiktig när du jämföra mellan cellinjer, inklusive syngena bakåtkompilerade linjer; Det är bäst att göra slutsatser med hjälp av flera subkloner och helst flera stamcellslinjer. Dessutom på grund av denna skillnad i cellinjer, pilot experiment för att säkerställa att korrekt differentiering sker i organoids rekommenderas. Medan de neuroepithelial strukturerna syns av brightfield mikroskopi, föreslås det också för att utföra qRT-PCR eller kryosnitt experiment att leta efter neurala differentiering markörer såsom PAX6 eller phospho-vimentin.
Man bör också förutse stora variationsrikedomen bland organoids inom samma cell linje. Omönstrade pågrund av protokollet, kan antal och storlek av neuroepithelial strukturer variera mellan enskilda organoids. Vanligtvis kan man räkna med minst två stora (&gt; 200 µm i diameter D24) neurala rosetter per organoid. Av denna anledning är longitudinella studier, såsom observation av förändring i organoid storlek vid infektion, särskilt upplysande. Variabiliteten mellan partier kan också förekomma, med den mest troliga orsaken till detta vara felaktig cell räkna eller sådd. Det rekommenderas att genomföra flera räkningar och se till att cellsuspensionen blandas väl före sådd på ULA U-botten 96 brunnar plattorna.
När odling organoids i ULA U-botten 96 brunnar, planera att se betydande avdunstning effekter runt kanterna på plattorna. Det är idealiskt att fylla dessa brunnar med PBS och arbetar endast med center 60 brunnarna. På grund av avdunstning, kommer organoids i yttre brunnarna att utsättas för olika förhållanden än i centrera, som sannolikt kommer att påverka deras tillväxt och differentiering. Tänk på detta när du planerar antalet organoids som kommer att behövas för experiment. Dessutom kommer organoids börja växa över formatet 96 brunnar efter ungefär 30 dagar, som kommer att vara synlig på grund av missfärgning av odlingsmedium. Om du planerar att ta organoids förbi de 30 dagarna, rekommenderas det att överföra organoids till en ULA 24-well platta. Att genomföra överföringen, använd sax för att klippa ett P1000 tips så att öppningen är mycket större än organoids sig och överföra organoids genom pipettering.
Mänskliga hjärnans organoids håll stor potential i avancerad fältets förståelse av neuroutvecklingssjukdomar och sjukdom. Forskare uppmuntras att ändra protokollet som behövs. Man exempelvis kunde genomföra mallning faktorer för att effektivisera differentiering mot specifika celltyper, ger dem möjlighet att utforska de virala effekterna på vissa anatomiska regioner. Nervsystemets effekterna av ZIKV är fortfarande dåligt känd, men denna nya strategi kommer att ge forskare en tillgänglig, snabb och hög genomströmning sätt att undersöka mekanismer för infektion.

Zikaviruset (ZIKV) har snabbt spridit sig i Mikronesien, franska Polynesien och Amerika, och har nyligen visat att passera placentabarriären1,2 för att infektera utveckla fostrets hjärnan, leder till nervsystemets sjukdomar sådan som mikrocefali3,4,5,6 . De långsiktiga effekterna på dessa patienters liv, och den nuvarande bristen på behandling, har lett forskare och kliniker att förvränga för en bättre förståelse för mekanismerna bakom ZIKV infektion och replikering. Tidigare studier har undersökt ZIKV infektion av in vitro- system i en mängd olika fysiologiskt relevanta cell typer7,8,9, samt i vivo10 med immunkompetenta och immunsupprimerade möss11,12,13 och icke-mänskliga primater14,15,16. Utöver dessa mer konventionella tekniker genomfört flera grupper stamceller-derived cerebral organoids att förstå mer om ZIKV infektion i hjärnans utveckling mänskliga. Dessa grupper har utnyttjat människors cerebral organoids för att bekräfta de mikrocefali fenotyp17,18, undersöka receptorer kopplade till virus posten19, undersöka fysiologiska reaktioner till infektion20 , 21, och potentiellt skärmen för drogen kandidater22. Här beskrivs en teknik för att snabbt producera och infekterar stamceller härstammar cerebral organoids, som visas tidigare19, att förbättra förståelsen av ZIKV infektion i hjärnans utveckling mänskliga.
Eftersom organoids bildas från standard pluripotenta stamceller (PSC) kulturer, möjliggör denna teknik en mängd vetenskapliga frågor besvaras angående virusinfektion i hjärnans utveckling. CRISPR engineering kan exempelvis användas för att ändra dessa PSC rader före organoid infektion i en snabbare takt än de flesta i vivo genetiska studier19. Dessutom, till skillnad från i standard två dimensionella (2D) differentiering kulturer, organoids uppvisar den komplexa cellulära arkitektur som är kritiska för corticogenesis, och nyligen genomförda studier har visat att denna arkitektur kan störas vid infektion 21. Slutligen, den relativt låga kostnaden för generera organoids möjliggör högre genomströmning experimenterande och screening jämfört med i vivo modeller. Däremot, finns det några nackdelar att utilizationen av organoids att studera ZIKV. Medan organoids är långt mer biologiskt relevant än 2D kulturer, finns det ytterligare utmaningar i bedömningen av organoids på grund av deras tredimensionella (3D)-natur. Imaging och dissociation av organoids tenderar att involvera mer utrustning och en större investering av resurser än i vanlig 2D kulturer. Dessutom saknar organoids vaskulatur och immunologiska komponenter som finns i i vivo modeller, så forskare intresserade av de aspekterna av virusinfektion uppmanas att söka ett alternativa protokoll.
Det finns ett antal tekniker för bildandet av mänskliga organoids och neurospheres i kultur och de vanligtvis faller inom kategorierna mönstrad eller omönstrad . Mönstrad metoder genomföra faktorer för att reglera Wnt, BMP, TGFβ och andra signalvägar för att driva differentiering mot specifika härstamningar23. Omönstrade metoder, såsom den som beskrivs här, dra nytta av benägenheten för inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och mänskliga embryonala stamceller (hESCs) att skilja mot en neuroektodermala härstamning av standard24. Efter cirka tre veckor av differentiering består de resulterande organoids av stora, biomimetiska neuroepithelial strukturer som innehåller flera celltyper som observeras i hjärnans tidiga utveckling.
Tekniken för att producera organoids från standard, feeder-fri PSC kulturer, och angriper dessa organoids med ZIKV presenteras i sin helhet. För vägledning om de culturing metoder som behövs för feeder-fri PSC, hänvisas till föregående metoder publikationer25,26. Dessutom kunna tillämpas konsekvent mängder virus för flera experiment, är det viktigt att beräkna MOI före tid. Detta görs genom att bedriva en infektion i Vero-celler, följt av behandling med overlay medium, inkubation och immunfärgning. Beskrivningar och metoder för denna teknik har varit tidigare beskrivna19,27.
När PSC kulturen når målet sammanflödet av 50% - 70%, cellerna sedan skiljas och samman till ultralåg fastsättning 96 brunnar. Cellerna är upprätthålls 3 dagar i xeno-fri stamceller underhållsmassmedia (SCMM), och sedan omvandlas till en neurala induktion media för återstoden av kulturen. När organoids ha differentierade i 3 veckor, kan infektionen genomföras. Genom att rutinmässigt ta bilder under veckan efter infektion, kommer att forskare Observera progressiva celldöd och störningar av organoid. Forskare kan också skilja organoids vid denna tid att genomföra transkriptionell eller proteomiska profilering. Kryosnitt och lightsheet metoder rekommenderas för imaging och forskare kan förvänta sig höga halter av infektion och virusreplikation bestämt inom de neurala stamceller cellpopulationer (NPC) i organoids. Slutligen, denna teknik tillåter forskare att snabbt undersöka mekanismerna bakom virusinfektion i den mänskliga hjärnan med låg kostnad och begränsad utrustning.

<table style="border-collapse:collapse;width:1358pt" width="1811">
	<colgroup>
		<col style="width:317pt" width="423" />
		<col style="width:158pt" width="211" />
		<col style="width:134pt" width="178" />
		<col style="width:749pt" width="999" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="width:317pt;height:26.25pt" width="423">Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8</td>
			<td class="xl19" style="width:158pt" width="211">StemCell Technologies</td>
			<td class="xl19" style="width:134pt" width="178">5940</td>
			<td class="xl19" style="width:749pt" width="999">Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton.&#160; Store at 4 &#7506;C for up to two weeks after prepared from individual components</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR</td>
			<td class="xl19">StemCell Technologies</td>
			<td class="xl19">5873</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Enzymatic Detachment Reagent, Accutase</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">A11105-01</td>
			<td class="xl19">Store aliquoted at -20 &#7506;C, do not keep thawed for longer than necessary</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Y-27632</td>
			<td class="xl19">Selleck Chem</td>
			<td class="xl19">S1049</td>
			<td class="xl19">Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 &#7506;C in 50&#181;L aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td class="xl19">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">D2650-100ML</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">10565-018</td>
			<td class="xl19">(+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">N-2 Supplement (100X)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">17502-048</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td>
			<td class="xl19">Gibco</td>
			<td class="xl19">11140-050</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Heparin</td>
			<td class="xl19">Sigma-Adrich</td>
			<td class="xl19">H4784-1G</td>
			<td class="xl19">Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 &#7506;C in 250&#181;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
			<td class="xl19">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td class="xl19">SH30029.02</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Stericup Filter (500mL)</td>
			<td class="xl19">Millipore</td>
			<td class="xl19">220009-140</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom</td>
			<td class="xl19">Corning</td>
			<td class="xl19">7007</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL)</td>
			<td class="xl19">Integra</td>
			<td class="xl19">4312</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td>
			<td class="xl19">Rainin</td>
			<td class="xl19">17013810</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible</td>
			<td class="xl19">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75007210</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Culture Plate Centrifuge Rotor</td>
			<td class="xl19">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75005706</td>
			<td class="xl19"></td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Vero Cells</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">CCL-81</td>
			<td class="xl19">For virus expansion, if necessary</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Zika Virus (Uganda Strain)</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">VR-1838</td>
			<td class="xl19">Other strains may be used</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">Zika Virus (Puerto Rico Strain)</td>
			<td class="xl19">ATCC</td>
			<td class="xl19">VR-1843</td>
			<td class="xl19">Other strains may be used</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">phospho-vimentin</td>
			<td class="xl19">MBL</td>
			<td class="xl19">D076-3</td>
			<td class="xl19">mouse polyclonal,&#160; 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">TBR2</td>
			<td class="xl19">Abcam</td>
			<td class="xl19">ab23345</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">MAP2</td>
			<td class="xl19">Novus</td>
			<td class="xl19">NB300-213</td>
			<td class="xl19">chicken polyclonal, 1:1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">GFAP</td>
			<td class="xl19">Cell Signaling Technologies</td>
			<td class="xl19">CST12389S</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">D1-4G2 flavivirus envelope protein</td>
			<td class="xl19">EMD Millipore</td>
			<td class="xl19">MAB10216</td>
			<td class="xl19">mouse monoclonal, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">cleaved caspase-3</td>
			<td class="xl19">Cell Signaling Technologies</td>
			<td class="xl19">9661</td>
			<td class="xl19">rabbit polyclonal, 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">488 anti-mouse IgG</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-11001</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">594 anti-rabbit IgG</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-11037</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="35" style="height:26.25pt">
			<td class="xl19" height="35" style="height:26.25pt">647 anti-chicken IgY</td>
			<td class="xl19">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">A-21449</td>
			<td class="xl19">goat polyclonal, 1:1000 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modelling zika virus infection of the developing human brain in vitro using stem cell derived cerebral organoids

Senaste uppkomsten av zikaviruset (ZIKV) i mottagliga populationer har lett till en plötslig ökning av mikrocefali och andra utvecklingsrelaterade tillstånd hos nyfödda barn. Myggor är huvudvägen för virusöverföring, har det också visat sig sprids via sexuella kontakter och vertikal mor-till-foster överföring. I detta sistnämnda fall av överföring, på grund av den unika viral tropism av ZIKV, tros viruset huvudsakligen mål de neurala stamceller (NPC) av hjärnans utveckling.
Här en metod för modellering ZIKV infektion, och den resulterande mikrocefali, som uppstår när mänskliga cerebral organoids utsätts för att leva ZIKV beskrivs. Organoids uppvisar höga nivåer av virus inom deras neurala stamceller befolkning och uppvisar allvarliga celldöd och mikrocefali över tid. Denna tredimensionella cerebral organoid modell tillåter forskare att genomföra arter-matchade experiment för att observera och potentiellt ingripa med ZIKV infektion i hjärnans utveckling mänskliga. Modellen ger ökad relevans över tvådimensionell standardmetoder, och innehåller mänskliga-specifika cellulära arkitektur och proteinuttryck som inte går i djurmodeller.

Under dagen för organoid bildandet bör SC kulturer i log-tillväxtfasen, där de är 50-70% konfluenta, som visas i figur 1(A-C). Kulturer bör bilda rundade kolonier med tydliga kanter och brunnarna bör vara tydliga differentiering figur 1(D-E). Om differentiering sker, rekommenderas det att utföra en pick-att ta bort för att rengöra de drabbade områdena inom plattorna minst en dag innan du skapar organoids. Om en stor del av kulturen är differentierat, kan det vara nödvändigt att genomföra en extra passage, Tina en ny injektionsflaska eller förändra stamceller kultur tekniker för att säkerställa att organoids som bildas av ren stamceller kulturer.
Dissociation av en kombination av enzym-fri och enzymatisk avlossning reagenser behandling bör leda till mestadels enstaka celler, men det kan fortfarande finnas små aggregat av celler som observerats under inventering. Förekomsten av små mängder verkar inte störa organoid formation, men det kan påverka räknande noggrannhet. Det rekommenderas att flera räkningarna görs per prov, och om räkningarna varierar med över 20 procent, det kan vara nödvändigt att öka dissociation tid att singularize celler ytterligare.
När cellerna är seedade och snurrade ner i en ULA U-botten 96 brunnar plattan (figur 2A), visas de som en platt, tät ark celler nedtill på varje brunn. Cellerna kommer att sakta samla över de kommande två dagarna. Det är bäst att inte störa plattan under dessa 48 timmar, som mekaniska krafter kan störa den löst-bildade sammanlagt. För de första 10 dagarna, organoid förblir oftast sfärisk, och kommer att växa från ~ 300 µm till 600-800 µm (figur 2B). Mer observerbara strukturer börja visas i organoid mellan dag 10 och dag 20 (figur 2C-E). Dag 24 bör forskare kunna observera rosett-liknande strukturer via brightfield mikroskopi (figur 2F). Samtidigt fortsätter kulturen, kan dessa neuroepithelial strukturer öka i mängd och storlek över flera dagar (figur 2G). Under flöden märker forskaren betydliga mängder skräp samlar på undersidan av varje brunn, särskilt under de första 2 veckorna av kultur. Spridning tekniken som beskrivs i steg 2.2 tar bort de flesta av denna cellulära skräp att förhindra apoptotiska skräp ansamlas över flera feeds (figur 3A). Detta skräp kan störa imaging, kan det göra det svårare att observera och kvantifiera infektion-inducerad celldöd och det kan ge asymmetrisk signalering till den närliggande organoid som kan påverka differentiering. Om spridning tekniken genomförs korrekt, bör detta vara minskat (figur 3B-C, 3D-E).
Det rekommenderas att utföra kryosnitt eller lightsheet imaging att inspektera kortikala struktur bildar inom organoids. I dag 25 organoids är rosett strukturer och ventrikulära zoner tydligt synliga i DAPI (figur 4A) och phospho-vimentin (figur 4B) färgning. Förekomsten av TBR2 (figur 4C) indikerar att mellanliggande föräldraparets bildar, med en morfologi som tyder på avflyttning. MAP2 + (figur 4D) nervceller befolka de yttersta regionerna i varje rosett. Från dessa proteiner, kan man visualisera den ventrikulära zon (VZ), subventrikulära zonen (SVZ), mellanliggande zon (IZ) och kortikala plattan (CP) inom varje rosett (figur 4E, 4E'). Man kan fortsätta till kultur dessa organoids för att observera senare stadier av utveckling. Kortikala skiktning är inte lika framträdande i denna typ av organoid, uppstår naturliga övergången till gliogenesis mycket som det gör i vivo. Detta kan observeras i dag 108 organoids, där en stor del av cellerna som uttrycker antingen MAP2 eller Fredsgenomförande (figur 4F-jag).
Användarna kan förvänta sig att se skillnader i organoid storlek av cirka 3 dagar efter ZIKV infektion, beroende på den virala MOI som tillämpas på organoids (figur 5A-B). Efter dessa 3 dagar blir det också en ökning i cellulära skräp i infekterade brunnarna jämfört med mock brunnarna. Denna skillnad i organoid storlek kommer att öka under den följande veckan, tills de infekterade organoids börja bryta isär (figur 5C-D). En mängd analyser kan användas på denna punkt att undersöka infektion mekanismer, inklusive viral RNA-extraktion och kryosnitt (rekommenderas antikroppar som redovisas i tabell av material). Vid kryosnitt, kommer att användare följa en stor förekomst av virus i apikala regionen av neuroepithelial strukturer, vilket tyder på en infektionskänslighet av neurala stamceller (NPC) ZIKV (figur 6). Immunofluorescens av sektionerad organoids kommer också att visa en ökning i klyvs kaspas-3 uttryck i den infekterade organoids (figur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig1.jpg"> 
Figur 1 : Stamceller kolonin morfologi innan organoid bildandet. Kolonierna bör vara 50-70% konfluenta vid tidpunkten för dissociation att producera ett stort antal konsekvent organoids. (A) Sparse, nyligen-seedade kulturer har ännu inte nått log-tillväxt fas och kommer inte att producera många organoids. (B) när cellerna når korrekt sammanflödet, de är redo för dissociation. Det är också viktigt att dessa kolonier inspekteras för att säkerställa att de är tydliga differentiering. (C) kolonier som tas för långt kommer att nå över sammanflödet och rekommenderas inte för organoid bildandet. Kulturer i detta tillstånd är mer benägna att innehålla särskiljande celler. (D) kolonin kanter bör vara tydlig, med konsekvent cellmorfologi rundade celler i mitten, och något avlånga celler mot kanterna. (E) Minimal differentiering bör vara närvarande i kulturer. Om större, tillplattad celler observeras i centra eller kanterna av kolonier (vit pilspetsar) och utgör mer än ungefär 1% av kulturen, rekommenderas det att plocka-att ta bort eller ytterligare passager genomförs för att bilda en enhetlig stamceller befolkning.<a href="//ecsourc href=""></a href="//ecsourc>e.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig1large.jpg ”target =” _blank ”> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig2.jpg"> 
Figur 2 : Cerebral organoid tillväxt över tid. 
(A) ett diagram för produktion av cerebral organoids från 2D PSC underhålls i xeno-fri, feeder-fri medium. (B) för de första 8 dagarna, organoids förblir oftast sfärisk med några påvisbara funktioner. Diametern på organoid kommer att variera från cirka 300 µm till 500 µm. (C-E) på dag 10, tydligare regioner börjar upptäckas runt periferin av organoids och de kommer att förlora sin sfärisk form. De kommer att fortsätta att öka i storlek till ca 1 mm i diameter, beroende till stor del på den cellinje som används för att producera organoids. (F) efter cirka 20 dagar av differentiering, användare kommer att följa bildandet av neuroepithelial strukturer (svarta pilar) i de flesta organoids tydliga perifera regioner. Dessa har en ring morfologi med apikala och basala strukturer härma de av den framkallande cortexen. (G) dessa neuroepithelial strukturer kommer att fortsätta att växa och öka i storlek i cirka 20-30 dagar. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig3.jpg"> 
Figur 3 : Röjning av cellulära skräp via spridning foder teknik. Under organoid tillväxt, en stor mängd celldöd kan förväntas, och kan leda till ansamling av cellulära skräp runt basen av organoid. (A) avbildade spridning tekniken tillåter forskare att ta bort de flesta av detta skräp under varje foder. För att göra detta, med hjälp av en flerkanalspipett P200, långsamt utarbeta används medlet och snabbt utvisa att lyfta organoid och cell skräp i suspension. Organoid kommer att snabbt sjunka till botten av brunnen, då en ordinarie foder kan genomföras. Exempel på en dag 6 organoid före (B) och efter (C) dispersion utfodring visar betydande skräp minskning. Detta fortsätter i flera veckor, vilket framgår av en dag 18 organoid innan (D) och efter (E) dispersion utfodring. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig4.jpg"> 
Figur 4 : Karakterisering av cerebral organoids via immunohistokemi. Lightsheet bilder av cerebral organoids visas att ge ett exempel på den cellulära arkitektur som bildar. På dag 25, DAPI (A) och fosfor-Vimentin (B) ange enskilda rosetter och ventrikulära zonerna, respektive. (C) TBR2 etiketter mellanliggande stamfäder som migrerar utåt och MAP2 (D) etiketter nervceller som har bildats i kortikala plattan. (E, E') Kombinationen av dessa proteiner visar tydligt sammanfattningen av kortikala utveckling i de cerebrala organoid modellerna. (F-jag) Av dag 108, har gliogenesis uppstått, med en blandning av både + och MAP2 +-celler vid ifyllning av mycket av organoid. VZ = ventrikulära zon, SVZ = subventrikulära zonen, IZ = mellanliggande zon, CP = kortikala plattan. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig5.jpg"> 
Figur 5 : Nedbrytning av infekterade organoids. 
(A) ljusa fält bilder av Mock och ZIKV-infekterade cerebral organoids på MOI = 0,1 och 10. Bilder togs omedelbart efter infektion (dag 0), samt 3 och 6 dagar efter infektionen. (B-C) Brightfield bilder av de cellfragment som omger (B) mock och (C) ZIKV-infekterade på MOI = 10 cerebral organoids 3 dagar efter infektion. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig6.jpg"> 
Figur 6 : Cryosection och immunofluorescens av infekterade organoids. Dag 24 organoids utsattes för ZIKV på MOI = 0,1 och cryosectioned 6 dagar senare. I detta skede finns det en tydlig närvaro av virus i ventrikulära, subventrikulära och intermediate zonplanerar av organoid, där neurala stamceller och radiella glia bosatta. (A) Via nukleär färgning, dessa neuroepithelial regioner syns tydligt på grund (vita pilar) till hög tätheten av kärnor som bildar ringliknande strukturer runt den apikala ytan. (B) genom färgning för virala kuvertet, en kan observera en relativt hög förekomst av virus inom dessa rosett strukturer (vit pilspetsar). Observera att det finns en liten mängd virus förekommer i olika oidentifierade perifera celler. (C-D) MAP2 eller andra neuron-specifika fläckar Visa att det finns nervceller i de kulturer som inte verkar vara smittad av viruset när överdrog med viral fläcken. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig7.jpg"> 
Figur 7 : Avspjälkar kaspas-3 immunofluorescens av infekterade organoid. Efter infektion, kan man använda apoptotiska indikatorer för att undersöka mekanismer för celldöd som uppstår inom organoids. I det här exemplet dag 24 organoids utsattes för ZIKV på MOI = 0,1 och cryosectioned 6 dagar senare. (A) icke-infekterade organoids visar inga virala kuvert (4 g 2 protein), och en minimal mängd klyvs kaspas-3 på grund av homeostatiska apoptos uppstår i vävnaden. (B) infekterade rosetter börja Visa ökade nivåer av apoptos. (C) rosetter som visar svår infektion via 4 g 2 färgning också tenderar att uppvisar höga nivåer av klyvs kaspas-3 i dessa regioner. Det finns ett direkt samband mellan infektion svårighetsgrad och klyvs kaspas-3 uttryck inom de infekterade rosetter. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids at JoVE.com

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

Det här protokollet beskriver en teknik som används för att modellera Zika virusinfektion av hjärnans utveckling mänskliga. Med vildtyp eller konstruerade stamcellslinjer, kan forskare använda denna teknik för att avslöja de olika mekanismer eller behandlingar som kan påverka tidiga hjärninfektion och resulterande mikrocefali hos Zika virus-infekterade embryon.

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Uppskatta cellcykelprogression av neurala stam och progenitorceller i musen framkallande hjärnan efter genotoxisk stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Utveckling av HiPSC-härledda serumfria embryoidorgan för undersökning av 3-D stamceller med användning av fysiologiskt relevanta analyser

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Högupplöst 3D-avbildning av rabies virus infektion i Lösningsmedelsrensade hjärnvävnad

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Analys av översättning i den utvecklande mushjärnan med polysome profilering

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Transplantation av human inducerad pluripotent stamcells-härledd mikroglia i immunkompetenta mösshjärna via icke-invasiv transnasal väg

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust och mycket reproducerbar generation av kortikala hjärnorganoider för modellering av hjärnans neuronala åldrande in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

Robust Tissue Fabrication for Long-Term Culture of iPSC-Derived Brain Organoids for Aging Research

Robust vävnadstillverkning för långsiktig odling av iPSC-härledda hjärnorganoider för åldrandeforskning

The currently available animal and cellular models do not fully recapitulate the complexity of changes that take place in the aging human brain. A recent ...