Name: high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis at JoVE.com

R.V. wurde von einem Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017) unterstützt.

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Autoren sind unter Erwerbstätigkeit von Roche.

Die oben beschriebene Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Gehirn frei schwebenden Abschnitte, immunofluorescent Färbung, Bildaufnahme und Analyseparameter für hochauflösende Mikroskopie der BBB. Diese Methode hat vor kurzem verwendet, um die Lokalisierung der Antikörper Lieferung Plattformen3, den Transport von endogenen IgG über die BBB-17und die Heterogenität der BBB auf Pericyte Verlust18zu untersuchen. Verschiedene Schritte im Protokoll können zur Anpassung an die spezifischen Ziel des Experiments geändert werden. Zunächst erleichtert die Verwendung von dicken (100 µm) Abschnitte ihrer Handhabung beim Verfahren Immunostaining und Montage. Es ermöglicht auch für 3D Rekonstruktion des Kapillarnetzes, die neurovaskuläre Einheit und für die Generation der Kapillare und NVU Querschnitte. Allerdings Eindringen von Antikörper innerhalb der Gewebeschnitte variieren und einige Antikörper Färbung auf die oberflächliche Schicht des Gewebes in der Nähe des Deckglases beschränkt werden kann. Das Protokoll kann geändert werden, indem man die Konzentration der Reinigungsmittel während der Permeabilisierung Schritt bzw. die Länge der die Permeabilisierung Schritt zur Verbesserung der Antikörper Eindringen in das Gewebe. Zweitens kann Bildqualität gefährdet sein, wenn Sie versuchen, Bilder tiefer in das Gewebe (in der Regel 20 bis 30 µm unterhalb der Oberfläche) durch Lichtstreuung sowie optische Aberrationen von Brechungsindex Missverhältnis zu erwerben. Um dieses Problem zu überwinden, können neue Methoden für Gewebe, clearing und aktive Antikörper eindringen20 mit diesem Protokoll zu Bild größere Mengen an Gewebe kombiniert werden. Drittens erfolgt Dekonvolution nach der Bildaufnahme, axiale Auflösung des Bildes zu verbessern. Die Wahl des blind Deconvolution Algorithmus verwendet in diesem Protokoll stützte sich auf (i) seine einfache Bedienung, da keine Vorausberechnung der Point-Spread Funktion benötigt wird, (Ii) seine Robustheit für die Verbesserung der Bild Qualität21und (Iii) das Fehlen von Artefakten auf mIgG intrazelluläre Strukturen nach der Implementierung. Abhängig von der intrazellulären Strukturen visualisiert in der Probe führen andere Dekonvolution Algorithmen höhere Bildqualität. Die folgenden Referenzen21,22 geben eine ausführliche Diskussion über die Vorteile und Grenzen der zusätzliche Algorithmen für Bild Dekonvolution. Schließlich erlaubt die Verwendung von einer Bild-Analyse-Software-Paket die Segmentierung der Kapillaren und intrazellulären Strukturen in drei Dimensionen. Klar Bildanalyse beschränkt sich nicht auf die Software, die im Protokoll und alternative Pakete, zum Beispiel die Referenz23ausführlich beschrieben, Segment Bilder genutzt werden. Die Eignung der verschiedenen Software-Programmen für die Analyse der intrazellulären Strukturen über die BBB sollte empirisch überprüft werden, durch die Beurteilung der Genauigkeit der Bild Segmentierung.
Da diese Methode auf festen Proben basiert, bietet es keine direkten Informationen über die Dynamik des Transcytosis über die BBB. Jedoch mit Zeitverlauf Experimente24, z. B. kombinierbar durch intravenös injizieren das Molekül des Interesses und seine Ansammlung innerhalb BECs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion zu rekonstruieren, die Kinetik der Messung intrazellulären Transport. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es für die Analyse von tiefen Hirnregionen wie gezeigt in18, die derzeit für intravitalen live bildgebenden Methoden nicht zugänglich sind. Ein wichtiger Schritt während des Protokolls ist die sorgfältige Überwachung der Gewebe Fixierung. Befestigung mit 4 % PFA drastisch reduziert die Immunogenität des intrazellulären Organellen und des endogenen oder peripher verabreichte Immunglobuline17 (Abbildung 1 b). Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Anforderung der qualitativ hochwertige Antikörper (d.h.niedrige unspezifische Färbung, geringe Kreuzreaktivität) geeignet für Immunfluoreszenz. Sofern solche Reagenzien zur Verfügung stehen, kann das Verfahren angewendet werden, um die intrazelluläre Lokalisation jedes Proteins des Interesses zu untersuchen. Zum Beispiel wurde das Protokoll zur Lysosomen im Gehirn endothelial Zellen17identifizieren. Es sollte auch angemerkt werden, dass da dieses Protokoll auf konfokalen Mikroskopie beruht, die laterale Auflösung durch Beugung begrenzt wird und nicht werden Strukturen, die kleiner als etwa 175 bis 250 aufgelöst kann nm (Abbildung 2).
Frühere Studien haben detaillierte Analyse der zellulären Zusammensetzung der konfokalen Mikroskopie25,26mit neurovaskuläre Einheit durchgeführt. Untersuchung von intrazellulären Transport an der BBB hängt jedoch vor allem auf die Verwendung von Transmission Electron Microscopy19,27,28. Während diese Methode die höchste laterale Auflösung der intrazellulären Strukturen bietet, bleibt Elektronenmikroskopie eine anspruchsvolle Technik mit niedrigem Durchsatz. Darüber hinaus ist die Anzahl der verschiedenen molekularen Ziele, die durch EM visualisiert werden können sehr begrenzt. Dieses Protokoll bietet eine zugängliche Alternative zu intrazellulären Transport an der BBB zu untersuchen. Die komplette Prozedur aus Gehirn Sammlung, Bildanalyse, kann in 5 bis 6 Tagen durchgeführt werden. Wenn geeignete Antikörper vorhanden sind, ermöglicht Immunfluoreszenz simultane Detektion von mehreren Zelle Arten/Moleküle innerhalb der gleichen Probe. Außerdem könnte dieses Protokoll mit Höchstauflösung Mikroskopie-Techniken zur Überwindung der Grenzen in räumlicher Auflösung29kombiniert werden. Insgesamt ermöglicht das oben beschriebene Protokoll die Quantifizierung von Veränderungen in die intrazelluläre Lokalisation innerhalb der neurovaskuläre Einheit interessierender Proteine. Seine Anwendung für verschiedene genetische oder pharmakologische Störungen ermöglicht die intrazellulären Struktur und Transport-Funktionen des BBB in Vivozu untersuchen.

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine kontinuierliche zellulären Barriere bilden Astrozyten, Perizyten, Neuronen und Endothelzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) aus dem Blutzirkulation1trennt. Die Regulierung der Transport über die BBB spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und wird durch spezielle Eigenschaften des Gehirns Endothelzellen (BECs) vermittelt. Das Vorhandensein von enge interzelluläre Verbindungen zwischen BECs und eine niedrige basale Transcytosis begrenzen den parazellulär und intrazelluläre Transport von Blut übertragbare Molekülen, bzw.2. Vor kurzem hat Transcytosis Weg in BECs genutzt, um Lieferung von therapeutischen große Moleküle an das Gehirn3,4zu erhöhen. Jedoch wurden die Mechanismen der Transcytosis über die BBB vollständig charakterisierten5,6noch nicht.
Umfangreiche Arbeit geleistet in Vitro zu entziffern, die zellulären und molekularen Mechanismen intrazellulären Transport über BECs7,8,9,10, 11, aber solche Systeme nicht die komplexe Architektur und Physiologie des Referats neurovaskuläre (NVU) rekapitulieren. Auf der anderen Seite Studien in Vivo12,13 enthalten detaillierte quantitative Informationen zu Frachten über die BBB aber keine Einblicke in die intrazellulären Mechanismen des Verkehrs. Untersuchung der zellulären und intrazellulären Komponenten der NVU bleibt in Vivo und ex Vivo daher sehr anspruchsvoll14. Nur eine begrenzte Anzahl von Techniken sind zugänglich, subzelluläre Strukturen in den Zellen der NVU zu analysieren. Die meisten Studien verwenden Elektronenmikroskopie, aber diese Technik ist begrenzt durch die komplexe Protokolle erforderlich für die ordnungsgemäße Gewebe Vorbereitung und Probenbehandlung. Daher haben wir eine Methode basiert auf hochauflösenden konfokalen Mikroskopie, die die Verarbeitung von Gehirn-Proben, die Analyse und Quantifizierung der subzelluläre Kompartimente innerhalb der Zellen von der NVU erleichtern würde.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das nutzt Maus Gehirn frei schwebenden Abschnitte um quantitative Bildgebung des BBB und NVU auf zellulärer und subzellulärer Ebene durchzuführen. Wir haben getestet und validiert eine Anzahl von Antikörpern gegen Bild und NVU in drei Dimensionen zu rekonstruieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokolls Bildgebung mit der maximalen optischen Beugung begrenzte Auflösung des Organellen innerhalb Gehirn-Kapillaren. Zusammen mit Bildanalyse kann dieses Protokoll verwendet werden, um den intrazellulären Transport von Makromolekülen in der BBB unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, zum Beispiel in Mausmodellen Krankheit der Neurodegeneration zu untersuchen.

<table style="border-collapse:collapse;width:665pt" width="886">
	<colgroup>
		<col style="width:223pt" width="297" />
		<col style="width:98pt" width="130" />
		<col style="width:93pt" width="124" />
		<col style="width:251pt" width="335" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Novus Biologicals</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MCA2388</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Brain Endothelial Cells 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody against Podocalyxin</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MAB1556</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lumen of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Biotrend</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">BT21-5014-70</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Basement membrane of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Goat polyclonal antibody against CD13</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">AF2335</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels pericytes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl22" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Abcam</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">ab49874</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Astrocytes 
			Use at dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against Iba-1</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Wako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">019-19741</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Microglia 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Fitzgerald</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">10R-CD107BBMSP</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lysosomes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl23" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21203</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21202</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21422</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Filter paper</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">WHA10334347</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Whatman prepleated qualitative filter paper 
			Grade 0858 1/2, grained</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Cyanoacrylate glue</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Roth Carl</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">258.1</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Roti Coll 1</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Fluorescent Mounting medium</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Dako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">S3023</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Dako fluorescent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Adult mice</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">The Jackson Laboratory</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">000664</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">C57BL/6J male or female mice 
			between 9 and 19 months of age</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Vibratome</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">14047235612</td>
			<td class="xl21">Leica VT100S vibrating blade microtome</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Leica TCS SP8 X with HyD detectors 
			and White light laser</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image processing software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Bitplane scientific software</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64</td>
		</tr>
		<tr height="99" style="height:74.25pt">
			<td class="xl18" height="99" style="width:223pt;height:74.25pt" width="297">Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl25" style="width:251pt" width="335">https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science 
			/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische mehrzelligen Schnittstelle, die den Transport von Molekülen zwischen den Kreislauf und das Gehirn reguliert. Transcytosis über die BBB regelt die Lieferung von Hormonen, Metaboliten und therapeutische Antikörper, die in Anwesenheit von. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Immunfluoreszenz frei schwebenden Abschnitte mit Laser kombiniert-scanning-konfokalen Mikroskopie und Bildanalyse subzellularen Organellen innerhalb von Endothelzellen an der BBB zu visualisieren. Kombination dieser Datensatz mit 3D Bildanalyse-Software ermöglicht für die semi-automatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kapillare Volumen und Fläche, sowie die Anzahl und Intensität von intrazellulären Organellen an der BBB. Die Erkennung der Maus endogenen Immunglobulin (IgG) in intrazellulären Vesikeln und deren Quantifizierung an der BBB wird verwendet, um die Methode zu veranschaulichen. Dieses Protokoll kann potenziell auf die Untersuchung der Mechanismen Steuern BBB Transcytosis von unterschiedlichen Molekülen in Vivoangewendet werden.

Repräsentative Beispiele von Bildern aus dem hier beschriebenen Protokoll abgerufen, Maus Gehirn Abschnitte waren voller Flecken mit Antikörpern, die verschiedene Komponenten der NVU, einschließlich die Basalmembran, die Astrozyten, die Perizyten zu erkennen sowie endothelialen Zellen (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Antikörper verwendet) (Abbildung 1A, D und E). Bei dieser Auflösung ist es möglich, den astrocytic Einzelprozesse und Ende-Füße, die in direktem Kontakt mit Kapillaren sind zu unterscheiden.
Um die Eignung dieses Protokolls zur Erkennung von intrazellulären Strukturen hervorzuheben, wurden Gehirn Teile von Tieren, die am Rande mit den menschlichen Anti-Tau-mAb86 Antikörper16 injiziert mit einem Fluoreszent markierten Anti-Human-Antikörper ( gefärbt. Abbildung 1B). mAb86 ist speziell Ziel Neuronen mit dem Ausdruck einer pathologischen Form der Tau16bekannt. Hierin beschriebene Protokoll verwenden, wurde mAb86 mit Beugung begrenzte Auflösung innerhalb der einzelnen vesikuläre Strukturen innerhalb der Neuronen (Abbildung 1B-C) erkannt. Darüber hinaus war endogenen Maus IgG in intrazellulären Strukturen innerhalb der Endothelzellen, aber nicht in Perizyten (Abbildung 1-D-E und Abbildung 2) erkannt.
Der Erwerb von hochauflösenden konfokalen Z-Stapel des Gehirns Gefäßsystems ermöglicht dreidimensionale Segmentierung der Kapillaren und intrazellulären Vesikeln an der BBB. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für den Prozess der Rendern und Segmentierung eine Kapillare beschriftet mit CollagenIV und Maus IgG-positiven intrazellulären Vesikeln. Durch Quantifizierung der vollständigen Dataset segmentierte Bilder, zum Beispiel durch die Anzahl der Bläschen pro Kapillare Volumen messen, ist es möglich, Veränderungen in intrazelluläre Transportprozesse unter verschiedenen Bedingungen zu studieren. Abbildung 3 B-C zeigt die Unterschiede in mIgG Vesikel Anzahl und Fluoreszenz Intensität entsprechend mIgG bei der in Anwesenheit von, bzw. nach Erschöpfung der Pericyte im Mausmodell Pdgf-bret/ret als zuvor gemeldeten 17. der gleiche Ansatz wurde auch vor kurzem verwendet, um Änderungen in intrazellulären Transport an der BBB zwischen verschiedenen Regionen18zu analysieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Kennzeichnung von mehreren Zelltypen und subzelluläre Strukturen der neurovaskuläre Einheit Repräsentative Bilder der neurovaskuläre Einheit (A und D) und intrazellulären Vesikeln enthaltenen Neuronen (B) oder Endothelzellen (E) erhalten mit diesem Protokoll. Die maximale Intensität Projektionsbild in A (oben) zeigt die Verteilung der Astroglia-positiven Astrozyten (rot) umgebenden Kapillaren vom CollagenIV (grün) gekennzeichnet. Pfeile zeigen auf astrocytic Einzelprozesse. Maßstabsleiste = 20 µm. Bei dieser Auflösung sind die einzelnen Astrozyten Prozesse und Ende-Füße deutlich sichtbar, wie im gezoomten Bild die boxed Region (unten) dargestellt. Pfeilspitzen zeigen auf astrocytic Ende-Füße. Maßstabsleiste = 10 µm. Das Bild in B zeigt die Anhäufung von einem peripher injiziert Antikörper, mAb86 (grün), innerhalb einer hippocampal Neuronen. Pfeilspitzen zeigen, individuelle mAb86-positiven Vesikeln. Maßstabsleiste = 10 µm. Die Grafik in C zeigt die Linie Profil Intensität eines einzigen Vesikels. Die Vesikelgröße wurde aus die volle Breite am halben Maximum von einem "glockenförmig" Anfall (schwarze durchgezogene Linie) von der Intensitätskurve (grüne Linie und Kreis) geschätzt. Die Bilder in D zeigen eine dreidimensionale Rekonstruktion einer endothelial Zelle (grün), umgeben von einer Pericyte (rot) innerhalb der Basallamina (CollagenIV, grau). Die unteren Platten zeigen die einzelnen Fluoreszenz-Kanäle. Maßstabsleiste = 10 µm. Die Bilder in E zeigen die Lokalisierung von mIgG (rot) in intrazellulären Vesikeln innerhalb endothelial Zellen (CD31 in grün-Panel links) aber nicht im Perizyten (rechte Abbildung, CD13 in grün). In allen Bildern DAPI gefärbt Kerne sind in blau dargestellt. Maßstabsleiste = 5 µm. Platten D und E von Referenz17geändert wurden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Dreidimensionale Darstellung der Kapillaren und intrazellulären Vesikeln an der Blut - Hirn-Schranke. Mit dem beschriebenen Protokoll erwarb hochauflösende konfokale Bilder von CollagenIV-Positive Kapillaren (grün) und Maus IgG intrazelluläre Vesikeln (rot) wurden (A). Die linke Tafel zeigt einen optischen Bereich mit Querschnitten. Die Pfeile verweisen auf einzelne mIgG-positiven Vesikeln innerhalb Gehirn endothelial Zellen. Das Gremium für die rechts zeigt die 3D Rekonstruktion des Z-Fullstack mit image-Processing-Software (siehe Tabelle der Materialien). Die Kapillare Volumen (B) und einzelne Vesikel (C) wurden in drei Dimensionen gerendert und quantifiziert mit Bildbearbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). In allen Bildern DAPI gefärbt Kerne sind in blau dargestellt. Skalieren von Balken = 5 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Quantifizierung von mIgG intrazelluläre Lokalisation an der BBB. Repräsentative Bilder zeigen (A) dreidimensionale Rekonstruktionen der Kapillaren (beschriftet mit CollagenIV, grüne) und die Verteilung von mIgG (rot) bei C57BL/6 Mäusen und Pdgf-bret/ret Pericyte erschöpft Mäuse zuvor beschrieben im19. Skalieren von Balken = 10 µm. Die Bilder in B zeigen die Segmentierung von intrazellulären Vesikeln innerhalb der CollagenIV-Maske. The Graphen in B zeigt die Quantifizierung und Vergleich von mIgG Vesikel Anzahl pro Volumen der Kapillare. Jeder Punkt entspricht Messungen aus einzelnen Kapillaren Blöcken. Die durchgezogene Linie zeigt den Mittelwert und die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der Daten. Die Bilder in C zeigen die mIgG Fluoreszenzsignal außerhalb der CollagenIV-Maske. Ebenso zeigt das Diagramm in C die Quantifizierung und Vergleich der Fluoreszenzintensität mIgG in das Gehirn Parenchym zwischen C57BL/6 Mäusen und Pdgf-bret/ret Pericyte erschöpft Mäuse. Fluoreszenz-Intensität-Einheiten wurden von der durchschnittlichen mIgG Parenchym Intensität gemessen an allen C57BL/6 Mäusen normalisiert. Diese Zahl wurde von Referenz17geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

Hier präsentieren wir eine Mikroskopie-basiertes Protokoll für hochauflösende Bildgebung und eine dreidimensionale Rekonstruktion der Maus neurovaskuläre Einheit und Blut - Hirn-Schranke mit Gehirn frei schwebenden Abschnitten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung, Analyse und Quantifizierung der intrazellulären Organellen an der BBB.

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Forschung

Neurowissenschaften

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Hohe Auflösung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Manuelle Segmentierung Protokoll für Menschen Hippocampus Teilfelder Verwenden von 3T Kernspintomographie

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Hochauflösende Strukturkernspintomographie des menschlichen Subcortex<I&gt; In-vivo-</I&gt; Und Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

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Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Hochauflösende Volume Imaging von Neuronen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Ausschluss Methode und mikrofluidischen Geräten gewidmet

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Ein hochdurchsatzgesteuertes, stereotaktisches Neuronavigations- und fokussiertes Ultraschallsystem für die Öffnung der Blut-Hirn-Barriere bei Nagetieren

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...