Name: high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis at JoVE.com

R.V. काम एक Roche Postdoctoral फैलोशिप (2014-2017) द्वारा समर्थित किया गया था ।

<ol>
	<li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maintenance+of+the+BBB.">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, 8-16 (2015).</li><li>Chow, B. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig.">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li><li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer's+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor.">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li><li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier.">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li><li>Gage, G. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging.">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li><li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier:+are+they+related+to+permeability.">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li></ol>

लेखकों Roche द्वारा भुगतान रोजगार के अधीन हैं ।

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल मस्तिष्क मुक्त चल वर्गों, immunofluorescent धुंधला, छवि अधिग्रहण, और विश्लेषण BBB के उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए मापदंडों की तैयारी का वर्णन करता है । यह विधि हाल ही में एंटीबॉडी डिलिवरी प्लेटफार्मों के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है3, BBB17भर में अंतर्जात आईजीजी के परिवहन, और विविधता के BBB नुकसान पर pericyte के18। प्रोटोकॉल में विभिंन चरणों को प्रयोग के विशिष्ट लक्ष्य के अनुकूल बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । सबसे पहले, मोटी (१०० µm) वर्गों के उपयोग immunostaining और बढ़ते प्रक्रियाओं के दौरान उनके हैंडलिंग की सुविधा । यह भी केशिका नेटवर्क, neurovascular इकाई के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, और केशिका और NVU पार वर्गों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । हालांकि, ऊतक वर्गों के भीतर एंटीबॉडी के प्रवेश भिन्न हो सकते हैं और कुछ एंटीबॉडी धुंधला coverslip के करीब ऊतक के सतही परत करने के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल permeabilization कदम के दौरान डिटर्जेंट की एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है और/या permeabilization कदम की लंबाई ऊतक में एंटीबॉडी पैठ में सुधार करने के लिए । दूसरे, छवि गुणवत्ता समझौता किया जा सकता है जब ऊतक के भीतर गहरी छवियों को प्राप्त करने का प्रयास (आमतौर पर 20 से 30 µm सतह के नीचे) प्रकाश बिखरने के कारण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऑप्टिकल वाकया अपवर्तन सूचकांक से बेमेल । इस समस्या को दूर करने के लिए, ऊतक समाशोधन और सक्रिय एंटीबॉडी प्रवेश के लिए नए तरीके20 इस प्रोटोकॉल के साथ छवि को ऊतक की बड़ी मात्रा के लिए जोड़ा जा सकता है । तीसरा, deconvolution छवि अधिग्रहण के बाद किया जाता है छवि के अक्षीय संकल्प में सुधार होगा । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अंधा deconvolution एल्गोरिथ्म का चुनाव (i) उपयोग की अपनी आसानी पर आधारित था, के रूप में कोई पूर्व बिंदु के प्रसार समारोह की गणना की आवश्यकता है, (ii) छवि गुणवत्ता में सुधार के लिए अपनी मजबूती21, और (iii) mIgG पर कलाकृतियों की कमी कार्यांवयन के बाद intracellular संरचनाओं । नमूना में visualized intracellular संरचनाओं के आधार पर, अन्य deconvolution एल्गोरिथ्म उच्च छवि गुणवत्ता में परिणाम हो सकता है । निंनलिखित संदर्भ21,22 के लाभ और छवि deconvolution के लिए अतिरिक्त एल्गोरिदम की सीमाओं पर एक व्यापक चर्चा प्रदान करते हैं । अंत में, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग तीन आयामों में केशिकाओं और intracellular संरचनाओं के विभाजन की अनुमति दी । स्पष्ट रूप से छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल और वैकल्पिक संकुल में वर्णित सॉफ्टवेयर के लिए प्रतिबंधित नहीं है, उदाहरण के संदर्भ में उन पर चर्चा की23, छवियों को खंड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । BBB भर में intracellular संरचनाओं के विश्लेषण के लिए विभिन्न सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों की उपयुक्तता छवि विभाजन की सटीकता का आकलन करके empirically सत्यापित किया जाना चाहिए ।
इस विधि के बाद से निश्चित नमूनों पर आधारित है, यह BBB भर transcytosis की गतिशीलता के बारे में सीधे जानकारी प्रदान नहीं करता है । हालांकि, यह समय के साथ संयुक्त किया जा सकता है पाठ्यक्रम24प्रयोगों, उदाहरण के लिए नसों के द्वारा ब्याज की अणु इंजेक्शन और इंजेक्शन के बाद अलग समय बिंदुओं पर BECs के भीतर अपने संचय को मापने, के कैनेटीक्स पुनर्निर्माण के लिए intracellular परिवहन. इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, के रूप में18में दिखाया गया है, जो वर्तमान में लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण intravital के लिए दुर्गम हैं. प्रोटोकॉल के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम ऊतक निर्धारण की सावधान निगरानी है । 4% पीएफए के साथ निर्धारण नाटकीय रूप से intracellular organelles के immunogenicity को कम कर देता है और अंतर्जात या परिधीय प्रशासित इम्युनोग्लोबुलिन17 (चित्र 1b) । इस प्रोटोकॉल की कमी उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की अपनी आवश्यकता है (यानी, कम गैर विशिष्ट धुंधला, कम पार जेट) इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त । बशर्ते कि ऐसे रिएजेंट उपलब्ध हों, इस विधि से किसी भी प्रोटीन के intracellular स्थानीयकरण की जांच के लिए आवेदन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में lysosomes की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था17. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल के बाद से फोकल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, पार्श्व संकल्प विवर्तन द्वारा सीमित है और संरचनाओं लगभग १७५ २५० एनएम (चित्रा 2) से छोटे हल नहीं कर सकता ।
पिछले अध्ययनों ने फोकल माइक्रोस्कोपी25,26का उपयोग कर neurovascular इकाई के सेलुलर संरचना का विस्तृत विश्लेषण किया है । हालांकि, BBB पर intracellular परिवहन की जांच ज्यादातर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी19,27,28के उपयोग पर निर्भर करता है । जबकि इस विधि intracellular संरचनाओं के उच्चतम पार्श्व संकल्प प्रदान करता है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कम प्रवाह के साथ एक चुनौतीपूर्ण तकनीक बनी हुई है । इसके अलावा, विभिंन आणविक लक्ष्य जो उंहें द्वारा visualized किया जा सकता है की संख्या बहुत सीमित है । इस प्रोटोकॉल BBB पर intracellular परिवहन की जांच करने के लिए एक सुलभ विकल्प प्रदान करता है । पूरी प्रक्रिया, मस्तिष्क संग्रह से छवि विश्लेषण करने के लिए, 5 से 6 दिनों में किया जा सकता है । यदि उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक ही नमूना के भीतर कई सेल प्रकार/अणुओं का एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है । इसके अलावा इस प्रोटोकॉल सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ संयुक्त किया जा सकता है स्थानिक संकल्प29में सीमाओं को दूर । कुल मिलाकर, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल neurovascular इकाई के भीतर ब्याज के प्रोटीन के intracellular स्थानीयकरण में परिवर्तन की ठहराव सक्षम बनाता है । विभिंन आनुवंशिक या औषधीय perturbations के लिए इसका आवेदन vivo मेंBBB के intracellular संरचना और परिवहन कार्यों की जांच की अनुमति देगा ।

रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) astrocytes, pericytes, न्यूरॉन्स, और endothelial कोशिकाओं है कि रक्त परिसंचरण1से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) अलग से गठित एक सतत सेलुलर बाधा है । BBB भर में परिवहन के विनियमन मस्तिष्क homeostasis को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BECs) के विशेष गुण द्वारा मध्यस्थता है. BECs और transcytosis के एक कम बेसल दर के बीच तंग सेलुलर जंक्शनों की उपस्थिति, रक्त जनित अणुओं की paracellular और transcellular परिवहन की सीमा क्रमशः2। हाल ही में, BECs में transcytosis मार्ग मस्तिष्क3,4के लिए चिकित्सकीय बड़े अणुओं की डिलीवरी बढ़ाने के लिए दोहन किया गया है । हालांकि, BBB भर में transcytosis के तंत्र अभी तक पूरी तरह से5,6विशेषता नहीं किया गया है ।
व्यापक काम इन विट्रो में किया गया है करने के लिए सेलुलर और आणविक तंत्र को विनियमित intracellular परिवहन BECs7,8,9,10, 11, लेकिन इस तरह की प्रणालियों neurovascular इकाई (NVU) के जटिल वास्तुकला और फिजियोलॉजी दोहराऊंगा करने में विफल । दूसरी ओर, vivo12में अध्ययन,13 BBB भर में परिवहन दरों पर विस्तृत मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं लेकिन परिवहन के intracellular तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते. इसलिए, vivo और ex vivo में NVU की सेल् फी और intracellular कंपोनेंट्स की जांच14काफी चुनौतीपूर्ण बनी हुई है । केवल एक सीमित संख्या में तकनीक NVU की कोशिकाओं के भीतर उपसेलुलर संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं । अधिकांश अध्ययन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं लेकिन इस तकनीक को उचित ऊतक तैयार करने और नमूना हैंडलिंग के लिए आवश्यक जटिल प्रोटोकॉल द्वारा सीमित है । इसलिए, हम उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोपी के आधार पर एक पद्धति की स्थापना की है कि मस्तिष्क के नमूनों के प्रसंस्करण की सुविधा होगी, विश्लेषण, और NVU की कोशिकाओं के भीतर उपसेलुलर डिब्बों के ठहराव ।
यहाँ, हम सेलुलर और सेलुलर स्तर पर BBB और NVU की मात्रात्मक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए माउस मस्तिष्क मुक्त अस्थायी वर्गों का उपयोग करता है जो एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम परीक्षण और छवि के लिए एंटीबॉडी के एक नंबर की पुष्टि की है और तीन आयामों में NVU पुनर्निर्माण । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल अधिक से अधिक ऑप्टिकल विवर्तन-मस्तिष्क केशिकाओं के भीतर organelles के सीमित संकल्प पर इमेजिंग की अनुमति देता है । छवि विश्लेषण के साथ साथ, इस प्रोटोकॉल के लिए विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत BBB भर में अणुओं के intracellular परिवहन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, neurodegeneration के माउस रोग मॉडल में उदाहरण के लिए ।

<table style="border-collapse:collapse;width:665pt" width="886">
	<colgroup>
		<col style="width:223pt" width="297" />
		<col style="width:98pt" width="130" />
		<col style="width:93pt" width="124" />
		<col style="width:251pt" width="335" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Novus Biologicals</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MCA2388</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Brain Endothelial Cells 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody against Podocalyxin</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MAB1556</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lumen of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Biotrend</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">BT21-5014-70</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Basement membrane of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Goat polyclonal antibody against CD13</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">AF2335</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels pericytes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl22" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Abcam</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">ab49874</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Astrocytes 
			Use at dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against Iba-1</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Wako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">019-19741</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Microglia 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Fitzgerald</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">10R-CD107BBMSP</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lysosomes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl23" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21203</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21202</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21422</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Filter paper</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">WHA10334347</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Whatman prepleated qualitative filter paper 
			Grade 0858 1/2, grained</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Cyanoacrylate glue</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Roth Carl</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">258.1</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Roti Coll 1</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Fluorescent Mounting medium</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Dako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">S3023</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Dako fluorescent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Adult mice</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">The Jackson Laboratory</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">000664</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">C57BL/6J male or female mice 
			between 9 and 19 months of age</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Vibratome</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">14047235612</td>
			<td class="xl21">Leica VT100S vibrating blade microtome</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Leica TCS SP8 X with HyD detectors 
			and White light laser</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image processing software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Bitplane scientific software</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64</td>
		</tr>
		<tr height="99" style="height:74.25pt">
			<td class="xl18" height="99" style="width:223pt;height:74.25pt" width="297">Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl25" style="width:251pt" width="335">https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science 
			/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) एक गतिशील कोशिकीय इंटरफेस है कि संचलन और मस्तिष्क के बीच अणुओं के परिवहन को नियंत्रित करता है । BBB भर में Transcytosis हार्मोन, चयापचयों, और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के लिए चिकित्सीय एंटीबॉडी के वितरण को नियंत्रित करता है । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि BBB पर endothelial कोशिकाओं के भीतर उपसेलुलर organelles कल्पना करने के लिए लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण के साथ मुक्त अस्थायी वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस को जोड़ती है पेश करते हैं । इस डेटा के संयोजन-3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ सेट अर्द्ध स्वचालित विभाजन और केशिका मात्रा और सतह क्षेत्र के ठहराव के लिए अनुमति देता है, साथ ही संख्या और BBB पर intracellular organelles की तीव्रता । intracellular बुलबुले के भीतर माउस अंतर्जात immunoglobulin (आईजीजी) का पता लगाने और ठहराव पर उनके BBB विधि वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल संभवतः vivo मेंविभिंन अणुओं के BBB transcytosis को नियंत्रित करने के तंत्र की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल से प्राप्त छवियों के प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में यहां वर्णित है, माउस मस्तिष्क वर्गों एंटीबॉडी तहखाने झिल्ली, astrocytes, pericytes, और endothelial कोशिकाओं सहित NVU के विभिंन घटकों को पहचानने के साथ दाग थे (देखें प्रयुक्त विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए सामग्री की तालिका ) (चित्रा 1a, डी, और ई) । इस संकल्प में व्यक्तिगत astrocytic प्रक्रियाओं और अंत पैरों कि केशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में हैं भेद करने के लिए संभव है ।
intracellular संरचनाओं का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयुक्तता को उजागर करने के लिए, परिधीय रूप से मानव विरोधी ताऊ mAb86 एंटीबॉडी16 के साथ इंजेक्शन जानवरों से मस्तिष्क वर्गों एक फ्लोरोसेंट बला विरोधी मानव एंटीबॉडी के साथ दाग थे ( चित्रा 1बी) । mAb86 विशेष रूप से ताऊ16के एक रोग के रूप में व्यक्त ंयूरॉंस लक्ष्य के लिए जाना जाता है । इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, mAb86 विवर्तन के साथ पता लगाया गया था-vesicular संरचनाओं के भीतर न्यूरॉन्स के भीतर सीमित संकल्प (चित्रा 1बी सी). इसके अलावा, endothelial कोशिकाओं के भीतर intracellular संरचनाओं में अंतर्जात माउस आईजीजी का पता लगाया गया था लेकिन pericytes में नहीं (चित्रा 1डी-ई और चित्रा 2) ।
उच्च संकल्प फोकल जेड के अधिग्रहण के ब्रेन vasculature के ढेर केशिकाओं और intracellular बुलबुले के BBB में तीन आयामी विभाजन के लिए अनुमति देता है । चित्रा 2 प्रतिपादन और एक केशिका CollagenIV और माउस आईजीजी-सकारात्मक intracellular बुलबुले के साथ लेबल खंड की प्रक्रिया का एक उदाहरण से पता चलता है. द्वारा विभाजित छवियों का एक पूर्ण डेटासेट को बढ़ाता है, उदाहरण के लिए केशिका मात्रा प्रति बुलबुले की संख्या को मापने के द्वारा, यह विभिन्न स्थितियों के तहत intracellular परिवहन प्रक्रियाओं में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए संभव है. चित्र 3 बी सी mIgG पुटिका संख्या में मतभेद और प्रतिदीप्ति तीव्रता मस्तिष्क पैरेन्काइमा में mIgG के लिए इसी से पता चलता है, क्रमशः, pericyte में कम करने पर pdgf में कमी -बी/ माउस मॉडल के रूप में पहले की रिपोर्ट 17. इसी दृष्टिकोण से भी हाल ही में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों18के बीच BBB में intracellular परिवहन में परिवर्तन का विश्लेषण किया गया था.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
चित्र 1: neurovascular इकाई के एकाधिक कक्ष प्रकारों और उपसेलुलर संरचनाओं की लेबलिंग । neurovascular इकाई (ए और डी) और intracellular बुलबुले के प्रतिनिधि छवियों न्यूरॉन्स के भीतर निहित (ख) या endothelial कोशिकाओं (ई) इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त की. A (शीर्ष) में अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन छवि GFAP-धनात्मक astrocytes (लाल) CollagenIV (हरा) द्वारा लेबल की गई केशिकाओं के वितरण को दिखाती है । तीर व्यक्तिगत astrocytic प्रक्रियाओं को इंगित करते हैं । स्केल बार = 20 µm । इस रिज़ॉल्यूशन पर, व्यक्तिगत astrocyte प्रक्रियाओं और अंत-चरणों को स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं, जैसा कि बॉक्स्ड क्षेत्र (नीचे) की ज़ूम की गई छवि में दिखाया गया है. ऐरोहेड पॉइंट टू astrocytic एंड-फीट । स्केल बार = 10 µm । B में छवि एक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन के भीतर, एक बाह्य इंजेक्शन एंटीबॉडी, mAb86 (हरा) के संचय से पता चलता है । ऐरोहेड बिंदु करने के लिए व्यक्तिगत mAb86-सकारात्मक बुलबुले । स्केल बार = 10 µm । C में ग्राफ़ किसी एकल पुटिका की रेखा प्रोफ़ाइल तीव्रता दिखाता है । पुटिका आकार पूरी चौड़ाई से एक गाऊसी फिट (काले ठोस लाइन) की तीव्रता वक्र (हरी लाइन और हलकों) की आधी अधिकतम पर अनुमान लगाया गया था । D में मौजूद छवियां एक endothelial कक्ष (हरा) का तीन-आयामी पुनर्निर्माण दिखाती है जो बेसल लेमिना (CollagenIV, धूसर) के भीतर pericyte (लाल) से घिरा होता है । निचले पैनलों व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति चैनल दिखाते हैं । स्केल बार = 10 µm । ई में छवियों endothelial कोशिकाओं के भीतर intracellular बुलबुले में mIgG (लाल) के स्थानीयकरण दिखाने (बाएँ पैनल, CD31 हरे रंग में) लेकिन pericytes में नहीं (दाएँ पैनल, हरे रंग में CD13). सभी छवियों में, DAPI दाग नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल बार = 5 µm. पैनलों D और E संदर्भ से संशोधित किया गया है17। <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
चित्र 2 : रक्त मस्तिष्क बाधा पर केशिकाओं और intracellular बुलबुले के तीन आयामी प्रतिपादन । प्रोटोकॉल के साथ वर्णित, उच्च संकल्प CollagenIV की फोकल छवियां-सकारात्मक केशिकाओं (हरा) और माउस आईजीजी intracellular बुलबुले (लाल) (A) का अधिग्रहण किया गया । बायां पैनल क्रॉस-सेक्शन के साथ एकल ऑप्टिकल अनुभाग दिखाता है । तीर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के भीतर व्यक्तिगत mIgG-सकारात्मक बुलबुले के लिए बिंदु । सही पर पैनल पूर्ण z के 3 डी पुनर्निर्माण से पता चलता है छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ढेर ( सामग्री की तालिकादेखें) । केशिका मात्रा (ख) और व्यक्तिगत बुलबुले (ग) तीन आयामों और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रा में प्रदान की गई ( सामग्री की तालिकादेखें) । सभी छवियों में, DAPI दाग नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल बार्स = 5 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
चित्र 3 : ठहराव of mIgG intracellular स्थानीयकरण BBB. प्रतिनिधि छवियां (एक) दिखा रहा है केशिकाओं के तीन आयामी पुनर्निर्माण (collagenIV, हरे रंग के साथ लेबल) और C57BL में mIgG (लाल) के वितरण/6 चूहों और में pdgf-बीरेत/ pericyte घट चूहों पहले19में वर्णित है । स्केल पट्टियां = 10 µm । B में मौजूद छवियां CollagenIV मास्क के भीतर intracellular बुलबुले के विभाजन को दिखाती हैं । गुबी में ई ग्राफ ठहराव और केशिका की मात्रा प्रति mIgG पुटिका संख्या की तुलना से पता चलता है । प्रत्येक बिंदु व्यक्तिगत केशिका क्षेत्रों से माप का प्रतिनिधित्व करता है । ठोस पंक्ति माध्य दिखाता है और त्रुटि पट्टियां डेटा के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । C में छवियां CollagenIV मास्क के बाहर mIgG प्रतिदीप्ति संकेत दिखाती हैं । इसी तरह, सी में ग्राफ ठहराव और C57BL के बीच मस्तिष्क पैरेन्काइमा में mIgG प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना से पता चलता है/6 चूहों और pdgf-बीरेत/ pericyte घट चूहों । प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों औसत mIgG पैरेन्काइमा सभी C57BL/6 चूहों में मापा तीव्रता से सामान्यीकृत थे । यह आंकड़ा संदर्भ17से संशोधित किया गया है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

रक्त मस्तिष्क बाधा के उच्च संकल्प फोकल इमेजिंग: इमेजिंग, 3 डी पुनर्निर्माण, और Transcytosis के ठहराव

यहां हम उच्च संकल्प इमेजिंग और एक तीन आयामी माउस neurovascular इकाई और रक्त मस्तिष्क बाधा मस्तिष्क मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों का उपयोग कर के पुनर्निर्माण के लिए एक सूक्ष्म आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि के दृश्य, विश्लेषण, और BBB पर intracellular organelles के ठहराव के लिए अनुमति देता है ।

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

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