Name: high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis at JoVE.com

Работа р.в. был поддержан Roche докторантура стипендий (2014-2017 годы).

<ol>
	<li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maintenance+of+the+BBB.">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, 8-16 (2015).</li><li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier.">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li><li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle.">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li><li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates.">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).</li><li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier.">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier.">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li><li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+receptor+(TfR)+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants.">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li><li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding.">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System.">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990 (2015).</li><li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding,+uptake,+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier.">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li><li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells.">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li><li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig.">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li><li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer's+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor.">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li><li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier.">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+uptake+of+tau/pS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li><li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier.">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658 (2016).</li><li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss.">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li><li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).</li><li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).</li><li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis.">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li><li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging.">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li><li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier:+are+they+related+to+permeability.">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li></ol>

Авторы являются по найму Рош.

Протокол, изложенные выше описывается подготовка мозга свободно плавающего секций, immunofluorescent окрашивание, захвата изображений и анализа параметров для высокого разрешения микроскопии BBB. Расследовать локализации антитела доставки платформы3, транспорт эндогенных IgG через BBB17и неоднородность BBB по перицит потери18недавно использовался этот метод. Различные шаги в протоколе могут быть изменены для адаптации к конкретной цели эксперимента. Во-первых использование толстые разделов (100 мкм) облегчает их обработки во время процедуры иммуноокрашивания и монтаж. Она также позволяет для 3D-реконструкции капиллярной сети, блок нервно-сосудистого и для поколения капилляров и сечения NVU. Однако проникновение антител в разделах ткани могут различаться и некоторые Пятнать антитела могут быть ограничены в поверхностный слой ткани, недалеко от coverslip. Протокол может быть изменен путем увеличения концентрации моющего средства на этапе permeabilization и/или длина permeabilization шагом для улучшения антитела проникновения в ткани. Во-вторых качество изображения может быть нарушена при попытке получить изображения глубже в ткани (обычно 20-30 мкм ниже поверхности) из-за рассеяния света, а также оптические аберрации от преломления несоответствие. Для преодоления этой проблемы, новые методы для очистки тканей и активные антитела проникновения20 может сочетаться с настоящим Протоколом для изображения больших объемов ткани. В-третьих деконволюции выполняется после захвата изображений для повышения осевой разрешение изображения. Выбор алгоритма слепой Деконволюция, используемые в настоящем протоколе был основан на (i) ее простота в использовании, как не предварительный расчет точки распространения функция требуется, (ii) его надежности для улучшения качества изображения21и (iii) отсутствие артефактов на mIgG внутриклеточные структуры после осуществления. В зависимости от внутриклеточных структур, визуализируется в образце другие алгоритмы деконволюция может привести к более высокое качество изображения. Следующие ссылки21,22 обеспечивают широкое обсуждение на преимущества и ограничения дополнительных алгоритмов для изображения деконволюции. Наконец использование пакет программного обеспечения анализа изображений допускается сегментации капилляров и внутриклеточных структур в трех измерениях. Явно анализ изображений не ограничивается программное обеспечение, описанное в протокол и альтернативных пакетов, например те, которые обсуждаются в ссылку23, может использоваться для сегмента изображения. Пригодности различных программ для анализа внутриклеточных структур через BBB должны быть проверены эмпирически оценки точности сегментации изображений.
Поскольку этот метод основан на фиксированных выборок, он не предоставляет прямую информацию о динамике Трансцитоз через BBB. Однако она может сочетаться с24-курс экспериментов, например внутривенно инъекционных молекулы интерес и оценки его накопления в ящики в разных временных точках после инъекции, чтобы реконструировать кинетика внутриклеточный транспорт. Преимуществом этого подхода является, что он позволяет для анализа глубоких мозга регионов, как показано в18, в которой в настоящее время недоступны для прижизненной визуализации живой подходов. Важнейшим шагом в ходе протокол является тщательный контроль фиксации ткани. Фиксация с 4% PFA резко уменьшает иммуногенности внутриклеточных органелл и эндогенного или периферийно управляемых иммуноглобулины17 (рис. 1B). Ограничением данного протокола является его требование высокого качества антител (то есть, низкий неспецифичный пятнать, низкий перекрестной реактивности) подходит для иммунофлюоресценции. Условии, что такие реагенты доступны, метод может применяться для расследования внутриклеточной локализации любого протеина интереса. Например протокол использовался для выявления лизосом в эндотелиальных клеток мозга17. Следует также отметить, что, поскольку этот протокол основан на confocal микроскопии, латеральное разрешение ограничены дифракцией и не удается разрешить структур меньше приблизительно 175 до 250 Нм (рис. 2).
Предыдущие исследования провели подробный анализ клеточного состава нервно-сосудистого блока с помощью конфокальной микроскопии25,26. Однако расследование внутриклеточного транспорта на уровне BBB опирается главным образом на использование передачи электронной микроскопии19,27,28. Хотя этот метод предлагает высокое разрешение боковых внутриклеточных структур, электронной микроскопии остается сложной техники с низкой пропускной способностью. Кроме того количество различных молекулярных целей, которые могут быть визуализированы EM является весьма ограниченным. Этот протокол предлагает альтернативу доступной расследовать внутриклеточного транспорта на уровне BBB. Полная процедура, от мозга коллекции для анализа изображений, может быть выполнена в 5-6 дней. Если имеются подходящие антитела, иммунофлюоресценции позволяет одновременное обнаружение нескольких клеток типы/молекул в пределах того же образца. Кроме того этот протокол может сочетаться с суперразрешением микроскопии методов для преодоления ограничений в пространственное разрешение29. В целом описанные выше протокол позволяет количественная оценка изменения внутриклеточной локализации протеинов интереса в блоке нервно-сосудистых. Его применение для различных генетических или фармакологических возмущений позволит расследовать внутриклеточные структуры и транспортные функции BBB в естественных условиях.

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является непрерывной сотовой барьер формируется астроциты, pericytes, нейроны и эндотелиальных клеток, отделяющий центральной нервной системы (ЦНС) от циркуляции крови1. Правила транспорта через BBB играет решающую роль в поддержании гомеостаза головного мозга и опосредовано специализированные свойства эндотелиальных клеток мозга (ящики). Присутствие плотные межклеточные соединения между ящики и низкий уровень базальной Трансцитоз ограничить перевозки кровь молекул, соответственно2в параклеточный и transcellular. Недавно Трансцитоз путь в ящики были использованы для улучшения доставки терапевтического больших молекул до мозга3,4. Однако механизмы Трансцитоз через BBB еще не были полностью характеризуется5,6.
Была проделана обширная работа в vitro расшифровать молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих внутриклеточного транспорта через ящики7,8,9,10, 11, но таких систем не повторить сложные архитектуры и физиологии нервно-сосудистого подразделения (NVU). С другой стороны исследования в vivo12,13 представить подробную количественную информацию о транспортных ставок через BBB, но не обеспечивают понимание внутриклеточных механизмов транспорта. Таким образом расследование сотовой и внутриклеточных компонентов NVU in vivo и ex vivo остается весьма сложной14. Только ограниченное количество методов для анализа внутриклеточных структур внутри клетки NVU. Большинство исследований использования электронной микроскопии, но эта техника ограничивается сложные протоколы, необходимые для подготовки надлежащего ткани и пробами. Таким образом мы создали методологию, основанную на конфокальная микроскопия высокого разрешения, которая облегчит обработку образцов мозга, анализа и количественной оценки субцеллюлярные отсеков в ячейках NVU.
Здесь мы описываем протокол, который использует свободно плавающего секции мозга мыши для выполнения количественных изображений BBB и NVU на клеточном и субклеточном уровнях. Мы протестировали и проверить количество антител к изображения и реконструировать NVU в трех измерениях. Кроме того этот протокол позволяет изображений на Максимальное оптическое разрешение дифракционный органелл в пределах капилляров мозга. Вместе с анализа изображений этот протокол может использоваться для изучения внутриклеточного транспорта макромолекул через BBB в различных экспериментальных условиях, например в мыши нейродегенеративные болезни модели.

<table style="border-collapse:collapse;width:665pt" width="886">
	<colgroup>
		<col style="width:223pt" width="297" />
		<col style="width:98pt" width="130" />
		<col style="width:93pt" width="124" />
		<col style="width:251pt" width="335" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Novus Biologicals</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MCA2388</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Brain Endothelial Cells 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody against Podocalyxin</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MAB1556</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lumen of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Biotrend</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">BT21-5014-70</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Basement membrane of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Goat polyclonal antibody against CD13</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">AF2335</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels pericytes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl22" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Abcam</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">ab49874</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Astrocytes 
			Use at dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against Iba-1</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Wako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">019-19741</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Microglia 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Fitzgerald</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">10R-CD107BBMSP</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lysosomes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl23" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21203</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21202</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21422</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Filter paper</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">WHA10334347</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Whatman prepleated qualitative filter paper 
			Grade 0858 1/2, grained</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Cyanoacrylate glue</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Roth Carl</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">258.1</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Roti Coll 1</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Fluorescent Mounting medium</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Dako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">S3023</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Dako fluorescent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Adult mice</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">The Jackson Laboratory</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">000664</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">C57BL/6J male or female mice 
			between 9 and 19 months of age</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Vibratome</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">14047235612</td>
			<td class="xl21">Leica VT100S vibrating blade microtome</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Leica TCS SP8 X with HyD detectors 
			and White light laser</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image processing software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Bitplane scientific software</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64</td>
		</tr>
		<tr height="99" style="height:74.25pt">
			<td class="xl18" height="99" style="width:223pt;height:74.25pt" width="297">Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl25" style="width:251pt" width="335">https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science 
			/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) — это динамический многоклеточных интерфейс, который регулирует транспорт молекул между распространением и мозг. Трансцитоз через BBB регулирует доставку гормонов, метаболитов и терапевтических антител к паренхимы мозга. Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе иммунофлюоресценции свободно плавающего секций с лазерного сканирования конфокальная микроскопия и анализ изображений для визуализации внутриклеточных органелл в эндотелиальных клеток на уровне BBB. Сочетание этого набора данных с 3D изображений программное обеспечение для анализа позволяет для полуавтоматических сегментации и количественной оценки капиллярного объема и площади поверхности, а также числа и интенсивности внутриклеточных органелл в BBB. Чтобы проиллюстрировать метод используется обнаружение мыши эндогенного иммуноглобулина (IgG) в пределах внутриклеточных везикулы и их количественная оценка на уровне BBB. Этот протокол потенциально могут применяться к исследованию механизмов, контролирующих BBB Трансцитоз различных молекул в естественных условиях.

Как представитель примеры изображений, полученный из протокола, описанные здесь, секции мозга мыши были окрашенных с антителами, признавая различные компоненты NVU включая базальной мембраны, астроциты, pericytes, и эндотелиальных клеток (см. Таблица материалов для специфических антител используемых) (рис . 1A, D и E). В этой резолюции можно выделить отдельные Астроцитарная процессы и конец ноги, которые находятся в непосредственном контакте с капиллярами.
Чтобы выделить пригодность этого протокола для обнаружения внутриклеточных структур, секции мозга от животных, периферийно вводят человека анти Тау mAb86 антитела16 окрашивали дневно помечены анти человека антител ( Рисунок 1B). mAb86 как известно специально целевой нейронов, выражая патологические формы Тау16. Используя протокол, описанные здесь, mAb86 был обнаружен с дифракционный резолюции в рамках отдельных везикулярного структур в рамках нейронов (Рисунок 1-B-C). Кроме того эндогенного мыши IgG был обнаружен в внутриклеточных структур в эндотелиальных клеток, но не в pericytes (рис. 1D-E и рис. 2).
Приобретение высокого разрешения конфокальный z стеки сосудистую мозга позволяет трехмерной сегментации капилляров и внутриклеточных везикулы на BBB. На рисунке 2 показан пример процесса рендеринга и сегментации капилляр помечены CollagenIV и мыши IgG позитивных внутриклеточных везикулы. Путем количественной оценки полного набора данных сегментирована изображений, например, измеряя количество пузырьков на капиллярной объема, это возможно для изучения изменений в процессах внутриклеточного транспорта в различных условиях. Рисунок 3 B-C показывает различия в mIgG везикул номер и флуоресценции интенсивности соответствует mIgG на паренхимы мозга, соответственно, после перицит истощения в модель мыши pdgf-b,сход/сход как сообщалось ранее 17. тот же подход был также недавно используется для анализа изменений в внутриклеточного транспорта на уровне BBB между различными мозга регионов18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Маркировка несколько типов клеток и внутриклеточных структур нервно-сосудистого исполнимых Представитель образы нервно-сосудистого аппарата (A и D) и внутриклеточных везикулы, содержащихся в нейроны (B) или эндотелиальных клеток (E), полученных с настоящим Протоколом. Максимальная интенсивность проекции изображения в A (вверху) показывает распределение СВМС позитивных астроциты (красный) окружающих капилляры, сторонниками CollagenIV (зеленый). Стрелки указывают на отдельных Астроцитарная процессов. Шкалы бар = 20 мкм. В этой резолюции отдельные экзоцитоз процессы и конец ноги хорошо видны, как показано в увеличенном изображении в штучной упаковке региона (внизу). Стрелки указывают на Астроцитарная конце ноги. Шкалы бар = 10 мкм. Изображения в B показано накопление периферически вводят антител, mAb86 (зеленый), в пределах гиппокампа нейрона. Стрелки указывают на отдельные mAb86-положительных везикулы. Шкалы бар = 10 мкм. На диаграмме в C линия профиля интенсивности одного пузырьков. Размер пузырьков оценивалась от полной ширины в половину максимум Гаусса fit (черная сплошная линия) кривой интенсивности (зеленой линии и круги). Изображения в D показывают трехмерная реконструкция эндотелиальных клеток (зеленый), окруженный перицит (красный) в пределах базальной пластинки (CollagenIV, серый). Нижней панели показывают флуоресценции отдельных каналов. Шкалы бар = 10 мкм. E снимках локализации mIgG (красный) в внутриклеточного везикулы в эндотелиальных клеток (левая панель, CD31 зеленым) но не в pericytes (правая панель, CD13 зеленым). Во всех изображениях DAPI окрашенных ядер отображаются синим цветом. Шкалы бар = 5 мкм. панели D и E были изменены ссылка17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Рисунок 2 : Трёхмерный рендеринг капилляров и внутриклеточных везикулы в blood - brain барьер. С протоколом описал конфокальная изображения с высоким разрешением CollagenIV положительных капилляров (зеленый) и мыши IgG, внутриклеточный везикулы (красный) были приобретены (A). Левая панель показывает один оптический раздел с поперечным сечением. Стрелки указывают на отдельные mIgG позитивных везикулы в эндотелиальных клеток мозга. Программное обеспечение для обработки изображений панели справа показывает 3D реконструкции с использованием полного z стека (см. Таблицу материалы). Капиллярные тома (B) и отдельные пузырьки (C) были вынесены в трех измерениях и количественно с помощью программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалы). Во всех изображениях DAPI окрашенных ядер отображаются синим цветом. Масштаб баров = 5 мкм. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Рисунок 3 : Количественная оценка mIgG внутриклеточной локализации на уровне BBB. Представитель изображения показаны (A) трехмерной реконструкциями капилляров (помечены collagenIV, зеленый) и распределение mIgG (красный) в мышей C57BL/6 и pdgf-b,сход/сход перицит истощены мышей описано в19. Масштаб баров = 10 мкм. B снимках сегментации внутриклеточных везикулы в пределах маски CollagenIV. THe график в B показывает, количественная оценка и сравнение mIgG везикул число на количество капилляров. Каждая точка представляет измерения от отдельных капилляров сегментов. Сплошная линия показывает среднее и погрешностей представляют собой стандартное отклонение данных. Изображения в шоу C mIgG флуоресценции сигнал вне CollagenIV маска. Аналогично график в C показывает количественной оценки и сравнения интенсивности флуоресценции mIgG в паренхиме мозга мышей C57BL/6 и pdgf-b,сход/сход перицит истощены мышей. Интенсивность флуоресценции единиц были нормализованы по интенсивности паренхимы средняя mIgG, измеряется в всех мышей C57BL/6. Эта цифра была изменена ссылка17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis at JoVE.com

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Высоким разрешением конфокальная томография Blood - brain барьер: Визуализация, 3D-реконструкции и количественной оценки Трансцитоз

Здесь мы представляем это протокол на основе микроскопии высокого разрешения изображений и трехмерной реконструкции мыши блок нервно-сосудистого и blood - brain барьер мозга свободно плавающего секций. Этот метод позволяет для визуализации, анализа и количественной оценки внутриклеточных органелл в BBB.

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Высокое разрешение функциональной магнитно-резонансной томографии методы по правам мозга

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Высокое разрешение<em&gt; В Vivo</em&gt; Руководство Сегментация Протокол по населенным гиппокампа подполей Использование 3Т Магнитно-резонансная томография

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Высокое разрешение Структурная магнитно-резонансная томография в подкорке человека<I&gt; В Vivo</I&gt; И Посмертный

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Высокое разрешение Количественный Immunogold Анализ мембранными рецепторами на сетчатки синапсах ленточного

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

С помощью микрофлюидика устройства для механической стимуляции и высокой резолюции визуализация C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Высоким разрешением объем изображений из нейронов путем использования флуоресценции исключения метод и посвятил Microfluidic приборы

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Высокое разрешение 3D Изображение бешенства вирусной инфекции в Solvent-очищенных мозговой ткани

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Высокой пропускной способностью изображения руководствуясь стереотаксической нейронавигации и целенаправленной ультразвуковой системы для гемовеленно-мозгового барьера Открытие у грызунов

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Измерение посттактного церебрального отека, зоны инфаркта и пробок гемо-мозгового барьера в одном наборе образцов мозга грызунов

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...