Name: high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis at JoVE.com

R.V. trabajo fue apoyado por una Beca Postdoctoral de la Roche (2014-2017).

<ol>
	<li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maintenance+of+the+BBB.">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, 8-16 (2015).</li><li>Chow, B. W., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Constituents+of+the+Blood-Brain+Barrier.">The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier.</a> Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).</li><li>Niewoehner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Brain+Penetration+and+Potency+of+a+Therapeutic+Antibody+Using+a+Monovalent+Molecular+Shuttle.">Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.</a> Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).</li><li>Yu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+bispecific+antibodies+cross+the+blood-brain+barrier+in+nonhuman+primates.">Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates.</a> Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).</li><li>Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis+of+macromolecules+at+the+blood-brain+barrier.">Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier.</a> Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Into+rather+unexplored+terrain-transcellular+transport+across+the+blood-brain+barrier.">Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier.</a> Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).</li><li>Bien-Ly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+receptor+(TfR)+trafficking+determines+brain+uptake+of+TfR+antibody+affinity+variants.">Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants.</a> J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).</li><li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding.">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP-1-mediated+intracellular+antibody+delivery+to+the+Central+Nervous+System.">LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System.</a> Sci Rep. 5, 11990 (2015).</li><li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+binding,+uptake,+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier.">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li><li>Siupka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+apical-basal+traffic+of+the+cation-independent+mannose-6-phosphate+receptor+in+brain+endothelial+cells.">Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li><li>Zlokovic, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saturable+mechanism+for+transport+of+immunoglobulin+G+across+the+blood-brain+barrier+of+the+guinea+pig.">A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig.</a> Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).</li><li>Deane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG-assisted+age-dependent+clearance+of+Alzheimer's+amyloid+beta+peptide+by+the+blood-brain+barrier+neonatal+Fc+receptor.">IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.</a> J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).</li><li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier.">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Collin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+uptake+of+tau/pS422+antibody+and+reduced+progression+of+tau+pathology+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).</li><li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+Endogenous+Immunoglobulins+by+Endothelial+Cells+at+the+Blood-Brain+Barrier.">Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.</a> Sci Rep. 6, 25658 (2016).</li><li>Villasenor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+permeability+of+the+blood-brain+barrier+upon+pericyte+loss.">Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).</li><li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).</li><li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).</li><li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Foret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+theoretical+framework+to+infer+endosomal+network+dynamics+from+quantitative+image+analysis.">A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis.</a> Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li><li>Bell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging.">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li><li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).</li><li>Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+vesicles+in+the+blood-brain+barrier:+are+they+related+to+permeability.">Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability.</a> Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).</li><li>Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing+-+multi-scale+spatio-temporal+imaging+towards+in+vivo+cell+biology.">Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology.</a> J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).</li></ol>

Autores están bajo empleo remunerado por Roche.

El protocolo descrito anteriormente describe la preparación de secciones del cerebro flotante, tinción inmunofluorescente, adquisición de imágenes y parámetros de análisis de microscopía de alta resolución de la BBB. Este método se ha utilizado recientemente para investigar la localización del anticuerpo entrega plataformas3, el transporte de IgG endógeno a través de la BBB17y la heterogeneidad de la BBB a pericyte pérdida18. Diferentes pasos en el protocolo pueden ser modificados para adaptarse al objetivo específico del experimento. En primer lugar, el uso de secciones gruesas (100 μm) facilita su manipulación durante el procedimiento de inmunotinción y montaje. También permite para reconstrucción 3D de la red capilar, de la unidad neurovascular y para la generación de capilar y cortes transversales NVU. Sin embargo, penetración de anticuerpos dentro de las secciones de tejido puede variar y algunas manchas del anticuerpo pueden ser restringido a la capa superficial del tejido cerca el cubreobjetos. El protocolo puede modificarse aumentando la concentración de detergente durante el paso de permeabilización o la longitud del paso de permeabilización para mejorar la penetración de anticuerpos en el tejido. En segundo lugar, la calidad de imagen puede verse comprometida cuando se trata de adquisición de imágenes más profundas dentro del tejido (generalmente de 20 a 30 μm por debajo de la superficie) debido a la dispersión de la luz así como aberraciones ópticas de índice de refracción de desajuste. Para superar este problema, nuevos métodos de tejido claro y anticuerpo activa penetración20 pueden combinarse con este protocolo a volúmenes más grandes de la imagen de los tejidos. En tercer lugar, la deconvolución se realiza después de la adquisición de imagen para mejorar la resolución axial de la imagen. La elección del algoritmo de deconvolución ciega utilizado en este protocolo se basó en (i) su facilidad de uso, ya que ningún cálculo previo de la función de punto de propagación se requiere, (ii) su robustez para mejorar la calidad de imagen21y (iii) la falta de artefactos en mIgG estructuras intracelulares después de la implementación. Dependiendo de las estructuras intracelulares visualizadas en la muestra, pueden resultar otros algoritmos de deconvolución en alta calidad de imagen. Las siguientes referencias21,22 proporciona una discusión extensa sobre las ventajas y limitaciones de los algoritmos adicionales para la deconvolución de la imagen. Finalmente, el uso de un paquete de software de análisis de imagen permitió la segmentación de los capilares y estructuras intracelulares en tres dimensiones. Claramente el análisis de imagen no se limita al software descrito en el protocolo y paquetes alternativos, por ejemplo las que se discuten en la referencia23, puede utilizarse para imágenes de segmento. La idoneidad de los programas de software diferentes para el análisis de las estructuras intracelulares a través de la BBB debe ser verificada empíricamente mediante la evaluación de la precisión de la segmentación de la imagen.
Debido a que este método se basa en muestras fijadas, proporciona información directa sobre la dinámica de transcitosis a través de la BBB. Sin embargo, se puede combinar con experimentos del curso del tiempo24, por ejemplo por vía intravenosa inyección de la molécula de interés y midiendo su acumulación dentro de BECs en diferentes momentos después de la inyección, para reconstruir la cinética de transporte intracelular. La ventaja de este enfoque es que permite el análisis de regiones profundas del cerebro, como se muestra en el18, que son actualmente inaccesibles para enfoques imagen vivo intravital. Un paso crítico durante el protocolo es el monitoreo cuidadoso de la fijación del tejido. Fijación con 4% PFA dramáticamente reduce la inmunogenicidad de los organelos intracelulares y de inmunoglobulinas endógenas o administrado periféricamente17 (figura 1B). Una limitación de este protocolo es su requisito de anticuerpos de alta calidad (es decir, bajo tinción inespecífica, baja reactividad cruzada) adecuados para inmunofluorescencia. Siempre que tales reactivos están disponibles, el método puede ser aplicado para investigar la localización intracelular de cualquier proteína de interés. Por ejemplo, el protocolo se utilizó para identificar los lisosomas en las células endoteliales de cerebro17. Debe señalarse también que, puesto que este protocolo se basa en microscopía confocal, la resolución lateral está limitado por difracción y no puede resolver las estructuras más pequeñas de aproximadamente 175 a 250 nm (figura 2).
Estudios previos han realizado un análisis detallado de la composición celular de la unidad neurovascular utilizando microscopía confocal25,26. Sin embargo, investigando el transporte intracelular en el BBB se basa principalmente en el uso de microscopia electrónica de transmisión19,27,28. Mientras que este método ofrece la máxima resolución lateral de estructuras intracelulares, microscopía sigue siendo una técnica difícil con bajo rendimiento. Por otra parte, el número de dianas moleculares diferentes que pueden ser visualizados de EM es muy limitado. Este protocolo ofrece una alternativa accesible para investigar el transporte intracelular en el BBB. El procedimiento completo de colección de cerebro para análisis de imágenes, puede realizarse en 5 a 6 días. Si se dispone de anticuerpos adecuados, inmunofluorescencia permite la detección simultánea de múltiples tipos de célula/moléculas dentro de la misma muestra. Por otra parte, este protocolo podría combinarse con técnicas de microscopía de superresolución para superar las limitaciones de resolución espacial29. En general, el protocolo descrito anteriormente permite la cuantificación de los cambios en la localización intracelular de proteínas de interés dentro de la unidad neurovascular. Su aplicación para diferentes perturbaciones genéticas o farmacológicas permitirá investigar las funciones de estructura y transporte intracelulares de la BBB en vivo.

La barrera blood - brain (BBB) es una barrera celular continua formada por astrocitos, pericitos, las neuronas y las células endoteliales que separa el sistema nervioso central (SNC) de la circulación de la sangre1. La regulación del transporte a través de la BBB desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del cerebro y está mediada por las características especializadas de las células endoteliales del cerebro (BECs). La presencia de uniones intercelulares estrechas entre BECs y una baja tasa basal de transcitosis limitar el transporte paracelular y transcelular de moléculas por la sangre, respectivamente2. Recientemente, la vía transcitosis en BECs ha sido aprovechada para mejorar la entrega de grandes moléculas terapéuticas al cerebro3,4. Sin embargo, los mecanismos de la transcitosis a través de la BBB aún no han sido completamente caracterizadas5,6.
Trabajo extenso se ha hecho en vitro para descifrar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el transporte intracelular a través de BECs7,8,9,10, 11, pero estos sistemas no recapitular la compleja arquitectura y fisiología de la unidad neurovascular (NVU). Por otro lado, estudios en vivo12,13 proporcionar información cuantitativa detallada sobre las tarifas de transporte a través de la BBB, pero no proporcionan penetraciones en los mecanismos intracelulares de transporte. Por lo tanto, investigar los componentes celulares e intracelulares de la NVU in vivo y ex vivo sigue siendo muy difícil14. Sólo un número limitado de técnicas es susceptible de analizar estructuras subcelulares dentro de las células del NVU. Mayoría de los estudios utiliza la microscopia electrónica, pero esta técnica está limitada por los protocolos complejos necesarios para preparación de tejido adecuado y manejo de la muestra. Por lo tanto, hemos establecido una metodología basada en microscopía confocal de alta resolución que facilite el procesamiento de muestras de cerebro, el análisis y la cuantificación de compartimentos subcelulares dentro de las células del NVU.
Aquí, describimos un protocolo que utiliza secciones libre-flotante del cerebro de ratón para realizar la proyección de imagen cuantitativa de la BBB y NVU a nivel celular y subcelular. Había probado y validado una serie de anticuerpos de la imagen y reconstruir el NVU en tres dimensiones. Además, este protocolo permite la proyección de imagen en la resolución óptica máxima de difracción limitada de orgánulos dentro de los capilares del cerebro. Junto con análisis de imagen, este protocolo puede utilizarse para investigar el transporte intracelular de macromoléculas a través de la BBB bajo diferentes condiciones experimentales, por ejemplo, en modelos de ratón de la enfermedad de la neurodegeneración.

<table style="border-collapse:collapse;width:665pt" width="886">
	<colgroup>
		<col style="width:223pt" width="297" />
		<col style="width:98pt" width="130" />
		<col style="width:93pt" width="124" />
		<col style="width:251pt" width="335" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Novus Biologicals</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MCA2388</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Brain Endothelial Cells 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody against Podocalyxin</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">MAB1556</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lumen of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Biotrend</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">BT21-5014-70</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Basement membrane of capillaries 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Goat polyclonal antibody against CD13</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">R&#38;D Systems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">AF2335</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels pericytes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl22" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Abcam</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">ab49874</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Astrocytes 
			Use at dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rabbit polyclonal antibody against Iba-1</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Wako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">019-19741</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Microglia 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="105" style="height:78.75pt">
			<td class="xl22" height="105" style="width:223pt;height:78.75pt" width="297">Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Fitzgerald</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">10R-CD107BBMSP</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Labels Lysosomes 
			Use at dilution 1:100 
			detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl23" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21203</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21202</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">LifeTechnologies</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">A21422</td>
			<td class="xl21">Use at dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Filter paper</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">WHA10334347</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Whatman prepleated qualitative filter paper 
			Grade 0858 1/2, grained</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Cyanoacrylate glue</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Roth Carl</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">258.1</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Roti Coll 1</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Fluorescent Mounting medium</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Dako</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">S3023</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Dako fluorescent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Adult mice</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">The Jackson Laboratory</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">000664</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">C57BL/6J male or female mice 
			between 9 and 19 months of age</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="21" style="width:223pt;height:15.75pt" width="297">Vibratome</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" class="xl18" style="width:93pt" width="124">14047235612</td>
			<td class="xl21">Leica VT100S vibrating blade microtome</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl18" style="width:251pt" width="335">Leica TCS SP8 X with HyD detectors 
			and White light laser</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image processing software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Leica Microsystems</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl18" height="42" style="width:223pt;height:31.5pt" width="297">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">Bitplane scientific software</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl21">Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64</td>
		</tr>
		<tr height="99" style="height:74.25pt">
			<td class="xl18" height="99" style="width:223pt;height:74.25pt" width="297">Fluorescence SpectraViewer</td>
			<td class="xl18" style="width:98pt" width="130">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl18" style="width:93pt" width="124">NA</td>
			<td class="xl25" style="width:251pt" width="335">https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science 
			/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution confocal imaging of the blood-brain barrier: imaging, 3d reconstruction, and quantification of transcytosis

La barrera blood - brain (BBB) es una interfaz multicelular dinámica que regula el transporte de moléculas entre la circulación y el cerebro. Transcitosis a través de la BBB regula la entrega de hormonas, metabolitos y anticuerpos terapéuticos a la parenquimia del cerebro. Aquí, presentamos un protocolo que combina la inmunofluorescencia de secciones libre-flotante con láser de barrido, microscopia confocal y análisis de imágenes para visualizar organelos subcelulares dentro de las células endoteliales en el BBB. La combinación de este conjunto de datos con software de análisis de imagen en 3D permite la segmentación semiautomática y cuantificación de volumen capilar y superficie, así como el número y la intensidad de los organelos intracelulares en el BBB. La detección de mouse endógena de la inmunoglobulina (IgG) dentro de vesículas intracelulares y su cuantificación en el BBB se utiliza para ilustrar el método. Potencialmente, este protocolo puede aplicarse a la investigación de los mecanismos de control BBB transcitosis de diferentes moléculas en vivo.

Como ejemplos representativos de las imágenes obtienen desde el protocolo descrito aquí, secciones de cerebro de ratón fueron teñidas con anticuerpos reconocer distintos componentes de NVU incluyendo la membrana basal, astrocitos, pericitos y células endoteliales (véase Tabla de materiales para anticuerpos específicos utilizados) (figura 1A, D y E). En esta resolución es posible distinguir los procesos astrocytic individuales y final-pies que están en contacto directo con los capilares.
Para resaltar la idoneidad de este protocolo para la detección de estructuras intracelulares, secciones del cerebro de animales inyectados periféricamente con el anticuerpo humano anti-Tau mAb86 de16 fueron teñidas con un anticuerpo antihumano marcado con fluorescencia ( Figura 1B). mAb86 es conocido específicamente las neuronas objetivo expresar de una forma patológica de Tau16. Utilizando el protocolo descrito en este documento, mAb86 fue detectado con la resolución de la difracción limitada dentro de estructuras vesiculares individuales dentro de las neuronas (figura 1B-C). Además, endógeno ratón IgG fue detectado en las estructuras intracelulares en las células endoteliales, pero no en pericitos (D-E de lafigura 1y figura 2).
La adquisición de alta resolución z-pila confocal de la vasculatura cerebral permite segmentación tridimensional de capilares y de vesículas intracelulares en el BBB. La figura 2 muestra un ejemplo del proceso de procesamiento y segmentación de un capilar con CollagenIV y ratón IgG positiva intracelular vesículas. Mediante la cuantificación de un conjunto completo de datos de imágenes segmentadas, por ejemplo midiendo el número de vesículas por volumen capilar, es posible estudiar los cambios en los procesos de transporte intracelular bajo diferentes condiciones. Figura 3 B-C muestra las diferencias en intensidad de número y de la fluorescencia de la vesícula de mIgG correspondientes a mIgG en el parénquima cerebral, respectivamente, sobre pericyte agotamiento en el modelo de ratón de pdgf-bret/ret como previamente divulgados 17. el mismo método fue utilizado recientemente para analizar cambios en el transporte intracelular en el BBB entre cerebro diferentes regiones18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Figura 1: Etiquetado de múltiples tipos de células y estructuras subcelulares de la neurovascular unidad. Imágenes representativas de la unidad neurovascular (A y D) y vesículas intracelulares dentro de las neuronas (B) o las células endoteliales (E) obtenidas con este protocolo. La imagen de proyección de intensidad máxima en A (arriba) muestra la distribución de astrocitos GFAP-positivo (rojo) que rodean los capilares etiquetados por CollagenIV (verde). Las flechas apuntan hacia los procesos astrocytic. Barra de escala = 20 μm. En esta resolución, los procesos de los astrositos y final-pies son claramente visibles, como se muestra en la imagen ampliada de la región en caja (abajo). Puntas de flecha señalan al final-pies astrocíticos. Barra de escala = 10 μm. La imagen B muestra la acumulación de un anticuerpo inyectado periféricamente, mAb86 (verde), dentro de una neurona del hipocampo. Puntas de flecha señalan a vesículas mAb86-positivas individuales. Barra de escala = 10 μm. El gráfico c muestra la intensidad del perfil de línea de una sola vesícula. El tamaño de la vesícula se estimó de la anchura total en medio máximo de un ajuste gaussiano (línea continua negra) de la curva de intensidad (línea verde y círculos). Las imágenes en D muestran una reconstrucción tridimensional de una célula endotelial (verde) rodeada por un pericyte (rojo) dentro de la lámina basal (CollagenIV, gris). Los paneles inferiores muestran los canales individuales de la fluorescencia. Barra de escala = 10 μm. Las imágenes en E muestran la localización de mIgG (rojo) en vesículas intracelulares en las células endoteliales (panel, CD31 en verde a la izquierda) pero no en pericitos (panel de la derecha, CD13 en verde). En todas las imágenes, DAPI manchado núcleos aparecen en azul. Barra de escala = 5 μm. paneles D y E han sido modificados de la referencia17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Figura 2 : Representación tridimensional de capilares y de vesículas intracelulares en la barrera blood - brain. Con el protocolo descrito, alta resolución imágenes confocales de capilares CollagenIV-positiva (verde) y el ratón IgG vesículas intracelulares (rojo) fueron adquirieron (A). El panel izquierdo muestra una sola sección óptica con cortes transversales. Las flechas señalan individuales positivo mIgG vesículas dentro de las células endoteliales del cerebro. El panel sobre la reconstrucción de la derecha muestra el 3D de la z-stack completo utilizando software de procesamiento de la imagen (véase Tabla de materiales). El volumen capilar (B) y vesículas individuales (C) se representa en tres dimensiones y cuantificado utilizando software de procesamiento de imagen (véase Tabla de materiales). En todas las imágenes, DAPI manchado núcleos aparecen en azul. Barras de la escala = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Figura 3 : Cuantificación de localización intracelular mIgG en el BBB. Imágenes representativas que muestran (A) reconstrucción tridimensional de capilares (etiquetados con collagenIV, verde) y la distribución de mIgG (rojo) en ratones C57BL/6 y el pdgf-bret/ret pericyte agotan ratones descrito previamente en19. Barras de la escala = 10 μm. Las imágenes en B muestran la segmentación de vesículas intracelulares dentro de la máscara de CollagenIV. THe el gráfico b muestra la cuantificación y comparación de número de vesícula mIgG por volumen del tubo capilar. Cada punto representa las medidas de los segmentos capilares individuales. La línea continua muestra la media y las barras de error representan el desvío estándar de los datos. Las imágenes de ver C el señal de fluorescencia mIgG fuera de la máscara de CollagenIV. Asimismo, el gráfico en C muestra la cuantificación y comparación de la intensidad de fluorescencia mIgG en el parénquima cerebral entre ratones C57BL/6 y pdgf-bret/ret ratones pericyte agotado. Unidades de intensidad de fluorescencia se normalizaron por la intensidad de parénquima mIgG promedio medida en todos los ratones C57BL/6. Esta figura se ha modificado de la referencia17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis at JoVE.com

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis

Aquí presentamos un protocolo basado en la microscopía para la proyección de imagen de alta resolución y una reconstrucción tridimensional del ratón unidad neurovascular y barrera blood - brain con secciones libres del cerebro. Este método permite la visualización, análisis y cuantificación de los organelos intracelulares en el BBB.

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

De alta resolución Magnética Funcional por imágenes de los métodos de resonancia cerebro medio humano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Investigación

Neurociencias

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Alta resolución<em&gt; En Vivo</em&gt; Protocolo Segmentación Manual for Human hipocampo subcampos Usando 3T Imágenes por Resonancia Magnética

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

De alta resolución de imagen de resonancia magnética estructural del subcorteza Humano<I&gt; En Vivo</I&gt; Y Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Alta resolución volumen imágenes de neuronas por la exclusión de uso de fluorescencia método y dispositivos microfluídicos dedicada

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Medición del edema cerebral post-accidente cerebrovascular, zona infarta y descomposición de la barrera hematoencefálica en un solo conjunto de muestras cerebrales de roedores

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...