Name: live images of glut4 protein trafficking in mouse primary hypothalamic neurons using deconvolution microscopy
Uploaded: 2017-12-07T15:00:00
Duration: 8 min 47 s
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हम विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा प्रदत्त अनुदान के लिए आभारी हैं, ताइवान-MOST105-2628-b-038-005-MY3 (1-3) और तंबाकू उत्पादों के स्वास्थ्य और कल्याण अधिभार-MOHW106-TDU-b-212-144001 to S-Y C.

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	<li>Levin, B. E., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glucose+homeostasis:+does+brain+insulin+matter?.">Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter?.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).</li><li>Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+action+in+brain+regulates+systemic+metabolism+and+brain+function.">Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function.</a> Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).</li><li>Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL5/RANTES+contributes+to+hypothalamic+insulin+signaling+for+systemic+insulin+responsiveness+through+CCR5.">CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5.</a> Sci Rep. 6, 37659 (2016).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

CCL5 या इंसुलिन उत्तेजना पर रहते कोशिकाओं की निगरानी करने की क्षमता, GLUT4 आंदोलन पर CCL5 या इंसुलिन के तेजी से प्रभाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. वास्तव में, यह हमें WT और CCR5 के बीच महत्वपूर्ण अंतर कल्पना करने के लिए अनुमति देता है-/ इंसुलिन उत्तेजना पर हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस । हम WT और CCR5-/- हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में इंसुलिन उत्तेजना17के बाद अलग समय अंक पर अंतर्जात GLUT4 प्रोटीन की सतह लेबलिंग प्रदर्शन किया है । सेल की सतह प्रोटीन के लेबल कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च विशिष्टता एंटीबॉडी की आवश्यकता है । इसके अलावा, भूतल प्रतिदीप्ति ठहराव भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है और समय लगता है । इस प्रकार, समय चूक रिकॉर्डिंग हमें निश्चित है कि CCL5 या इंसुलिन का प्रभाव प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर एक सच्चे शारीरिक परिवर्तन है, बल्कि एक सांख्यिकीय भिन्नता की अनुमति देता है । अंतर्जात GLUT4 की सतह लेबलिंग के साथ साथ, हम मजबूत सबूत और प्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए कैसे CCL5 और CCR5 GLUT4 translocation और इंसुलिन सिग्नलिंग में भाग लेने प्रदान करते हैं ।
आधुनिक कोशिका जीवविज्ञान और आणविक जीवविज्ञान अध्ययन में, कई प्रयोगों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग की आवश्यकता होती है. यह तकनीक वैज्ञानिकों को आंदोलन की दिशा और गति, stimulatory प्रभाव, रूपात्मक परिवर्तन, और प्रोटीन की तस्करी के अलावा प्रोटीन और/या सेलुलर organelles के बीच के स्थानिक संबंध की कल्पना करने की अनुमति देता है । हालांकि, इस तकनीक अभी भी अपनी सीमा है: जब fluorophores उत्साहित कर रहे हैं, लक्ष्य प्रोटीन से उत्सर्जित संकेत (या क्षेत्र) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से अभिभूत किया जा सकता है । नतीजतन, प्रतिदीप्ति छवियों धुंधला पृष्ठभूमि संकेतों में गहरी दफन संकेतों के साथ प्रकट कर सकते हैं । यह घटना झिल्ली से बंधे प्रोटीन के अवलोकन के लिए विशेष रूप से स्पष्ट है ।
इस कठिनाई को दूर करने के लिए कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) विकसित की गई थी. यह वैज्ञानिकों को पृष्ठभूमि fluorophores को प्रभावित किए बिना चयनित सतह बंधे fluorophores के उत्तेजना कल्पना करने के लिए अनुमति देता है । यह वैज्ञानिकों चुनिंदा सुविधाओं और ऐसी एक प्लाज्मा झिल्ली के रूप में एक बहुत पतली सतह क्षेत्र पर घटनाओं की विशेषता के लिए अनुमति देता है । Deconvolution माइक्रोस्कोपी एक अभिकलनीय गहन छवि प्रसंस्करण तकनीक है कि हाल के वर्षों में तकनीकी प्रगति की मदद से संभव बनाया है । यह अक्सर डिजिटल प्रतिदीप्ति छवि संकल्प में सुधार करने के लिए उपयोग किया गया है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, जब fluorophores (जैसे लेजर या एलईडी) रोशनी के किसी भी प्रकार से उत्साहित किया जा रहा है, सभी fluorophores प्रकाश संकेतों का उत्सर्जन होगा चाहे वे ध्यान में है या नहीं, तो छवि हमेशा धुंधला दिखाई देगा । यह धुंधला एक बुलाया घटना के कारण होता है "प्वाइंट फैल समारोह" (पीएसएफ), प्रकाश के रूप में एक छोटे फ्लोरोसेंट स्रोत से आ रहा है (उज्ज्वल स्थान) बाहर फैल जाएगा और ध्यान से बाहर हो (धुंधला) । सिद्धांत रूप में, इस घटना के आकार फ्लोरोसेंट संकेत की तरह एक hourglass का उत्पादन होगा, और एक प्रतिदीप्ति छवि कई ऐसे प्रकाश संकेतों से बनाया जा सकता है । deconvolution प्रक्रिया अपने मूल उज्ज्वल स्पॉट फार्म करने के लिए सभी प्रतिदीप्ति संकेतों को फिर से असाइन कर सकते हैं, और छवि कंट्रास्ट में सुधार करने के लिए आउट-की-फ़ोकस लाइट के अधिकांश को समाप्त ।
हाल के वर्षों में, deconvolution एल्गोरिदम एक फोकल माइक्रोस्कोप की है कि तुलनीय संकल्प के साथ छवियों को उत्पन्न किया है. इसके अलावा, TIRFM, जो बाहर से रोकता है की तुलना में एक सीमित उत्तेजना क्षेत्र द्वारा पता लगाया जा रहा से कलंक, व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी सभी प्रकाश संकेतों का पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है और उंहें वापस पून deconvolution प्रक्रिया के माध्यम से अपने स्रोत के लिए । इसलिए, व्यवहार में, deconvolution माइक्रोस्कोपी न केवल एक अधिक कुशल छवि अधिग्रहण विधि बन गया है, लेकिन यह भी एक अधिक लागत प्रभावी विधि जब TIRF माइक्रोस्कोपी की तुलना में.

टाइप 2 मधुमेह (T2DM) एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट है । T2DM इंसुलिन संकेतन हानि और परिधीय ऊतकों में जीर्ण सूजन की विशेषता है । hypothalamus नियंत्रण केंद्र है जो शरीर की ऊर्जा homeostasis, भूख, और circadian लय नियंत्रित करता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, hypothalamus भी इंसुलिन संकेत जवाबदेही प्रणालीगत चयापचय1,2,3,4,5को विनियमित करने के लिए मध्यस्थता । हाइपोथैलेमस इंसुलिन संकेतन मार्ग बाधित इंसुलिन प्रतिरोध6,7प्रेरित कर सकता है. hypothalamus सेलुलर ऊर्जा की स्थिति और हार्मोन के स्राव निर्देशांक, जैसे इंसुलिन और adipokines (उदा, लेप्टिन) परिधीय ऊतकों से, प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय को विनियमित करने के लिए, इंसुलिन जवाबदेही, और भोजन का सेवन. इंसुलिन रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट (आईआरएस) प्रोटीन, जो तो इंसुलिन बहाव को सक्रिय अणुओं को सक्रिय करता है, जैसे PI3K (phosphatidylinositol 3-कळेनासे) और एकेटी (प्रोटीन कळेनासे बी (PKB/एकेटी)), प्रेरित करने के लिए GLUT4 झिल्ली translocation. न्यूरॉन्स इंसुलिन के जवाब में ग्लूकोज के लिए बड़ा लक्ष्य नहीं कर रहे हैं; हालांकि, GLUT4 अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण स्तर हाइपोथैलेमस arcuate नाभिक (ARC) क्षेत्र में पहचान की गई है । इसलिए, हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में GLUT4 के विनियमन मस्तिष्क परिधीय धुरी में इंसुलिन संकेतन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है.
कई अध्ययनों से सुझाव दिया है कि जीर्ण सूजन और भड़काऊ chemokines hypothalamus में भी मधुमेह और मोटापे के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और हाइपोथैलेमस सूजन के निषेध आहार-प्रेरित इंसुलिन प्रतिरोध रिवर्स कर सकते हैं 8 , 9 , 10. इसके अलावा, chemokine-CCL5 (सी-सी आकृति ligand 5, भी rants के रूप में जाना जाता है, विनियमित-पर-सक्रियण-सामांय-टी-सेल व्यक्त की और स्रावित) और इसकी रिसेप्टर CCR5 स्तर भी T2DM के विकास के साथ सहसंबंधी बनाना11,12. इंसुलिन फंक्शन और ग्लूकोज़ चयापचय में CCL5 और CCR5 की भूमिकाएँ अस्पष्ट रहती हैं. एक अध्ययन में बताया गया है कि CCR5 की कमी से संरक्षित चूहों मोटापा प्रेरित सूजन, macrophage भर्ती, और इंसुलिन प्रतिरोध11; इसके विपरीत, एक और अध्ययन की रिपोर्ट है कि CCR5 की कमी प्रणालीगत ग्लूकोज सहिष्णुता, साथ ही साथ adipocyte और मांसपेशी इंसुलिन संकेतन12। CCL5 टी कोशिकाओं में ग्लूकोज को बढ़ाने के लिए और hypothalamus13,14पर अपनी कार्रवाई के माध्यम से भोजन का सेवन कम करने के लिए पाया जाता है, तथापि, दोनों कार्रवाई के तंत्र और शामिल रिसेप्टर्स अभी तक की पहचान की जानी है ।
यह हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में इंसुलिन के कार्य पर परिधीय ऊतक सूजन के प्रभाव अंतर्निहित सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए मुश्किल है. यह सेलुलर विविधता और ंयूरॉन सर्किट प्रतिक्रिया विनियमों के कारण है । इस कारण से, एक इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल हाइपोथैलेमस इंसुलिन संकेत विनियमन पर chemokine के प्रभाव की जांच करने के लिए एक स्वच्छ मॉडल प्रदान करता है । हालांकि कई स्थापित कर रहे है अनुसंधान के उपयोग के लिए अमर हाइपोथैलेमस ंयूरॉन सेल लाइनों, इन सेल लाइनों विभिंन मार्करों व्यक्त की है, और इसलिए, हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस के विभिंन प्रकार के15प्रतिनिधित्व करते हैं । भले ही प्राथमिक हाइपोथैलेमस संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए मुश्किल हो सकता है, वे इंसुलिन उत्तेजना पर हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस की सबसे यथार्थवादी प्रतिक्रिया प्रदान कर सकते हैं, और भी संभावित अज्ञात प्रभाव है जो खेलने में आने के लिए जब कोशिकाओं को बनाए रखने से बचने कर सकते है कृत्रिम विकास कारकों के साथ संस्कृति माध्यम में दीर्घकालिक ।
इस के साथ साथ, हम दोनों C57BL/6 wildtype (WT) माउस और CCR5 नॉकआउट (CCR5-/) माउस से प्राथमिक हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस का उपयोग, और transfect-GFP के साथ दोनों प्रकार की कोशिकाओं का निर्माण । इंसुलिन मध्यस्थता GLUT4 झिल्ली की तस्करी करने के लिए CCR5 के योगदान की जांच करने के लिए, GFP-GLUT4 transfected न्यूरॉन्स इंसुलिन या संयोजक CCL5 के साथ इलाज किया गया. हम तो Deconvolution माइक्रोस्कोपी के साथ प्राथमिक हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में प्लाज्मा झिल्ली पर GFP-GLUT4 के आंदोलन की विशेषता.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="935">
	<tbody>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:257px;">DeltaVision deconvolution microscope</td>
			<td style="width:173px;">Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">SoftWorX application software</td>
			<td style="width:173px;">Applied Precision Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">used to control microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">VoloCITY software&#160;</td>
			<td style="width:173px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">used to analyze the images</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Actrapid, Denmark</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Liposome</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668019</td>
			<td style="width:387px;">Lipofectamine&#174; 2000, used for plasmid DNA transfection</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">GFP control plasmid DNA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">provided by Professor Samuel Cushman</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">GFP-GLUT4 plasmid DNA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">provided by Professor Samuel Cushman</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Anti-mouse Alex-488</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A-11001</td>
			<td style="width:387px;">Secondary anitbody</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Anti-rabbit IgG -Alex-568</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A-11036</td>
			<td style="width:387px;">Secondary anitbody</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">CCL5/RANTES</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">478-MR-025</td>
			<td style="width:387px;">10ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:173px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">#FL42572A</td>
			<td style="width:387px;">0.17mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">12 mm Microscope coverglass</td>
			<td style="width:173px;">Deckglaser</td>
			<td style="width:119px;">#41001112</td>
			<td style="width:387px;">used for immmunstaining study</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">micro-dissecting scissors</td>
			<td style="width:173px;">Klappenecker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">curved-tipped forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ideal-tek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">standard straight-tipped forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ideal-tek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:173px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:387px;">Purify Endotoxin free plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">5 ml pipette&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Corning costar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4487</td>
			<td style="width:387px;">dissociate brain tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live images of glut4 protein trafficking in mouse primary hypothalamic neurons using deconvolution microscopy

टाइप 2 मधुमेह (T2DM) एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट है जो इंसुलिन संकेतन हानि और परिधीय ऊतकों में जीर्ण सूजन की विशेषता है । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में hypothalamus ऊर्जा और इंसुलिन संकेत प्रतिक्रिया विनियमन के लिए नियंत्रण केंद्र है । परिधीय ऊतकों और कुछ chemokines (जैसे CCL5, TNFα, और IL-6) के असंतुलन में जीर्ण सूजन मधुमेह और मोटापे के लिए योगदान करते हैं । हालांकि, कार्यात्मक तंत्र (ओं) को जोड़ने chemokines और हाइपोथैलेमस इंसुलिन संकेत विनियमन अभी भी अस्पष्ट रहते हैं ।
इन विट्रो में प्राथमिक ंयूरॉन संस्कृति मॉडल सुविधाजनक और सरल मॉडल है जो हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में इंसुलिन संकेत विनियमन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस अध्ययन में, हमने इंसुलिन उत्तेजना पर GFP झिल्ली GLUT4 को ट्रैक करने के लिए प्राथमिक हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में GFP (GLUT4-translocation) के साथ exogeneous GLUT4 प्रोटीन संयुग्मित पेश किया. GFP के समय चूक छवियों-GLUT4 प्रोटीन की तस्करी deconvolution माइक्रोस्कोपी, जो उपयोगकर्ताओं को उच्च गति उत्पंन करने के लिए अनुमति दी द्वारा दर्ज किए गए, उच्च संकल्प छवियों ंयूरॉंस को नुकसान पहुंचाने के दौरान काफी प्रयोग करते हुए । इंसुलिन विनियमित GLUT4 translocation में CCR5 का योगदान CCR5 की कमी हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में मनाया गया था, जो अलग और CCR5 नॉकआउट चूहों से कल्चरित थे. हमारे परिणामों का प्रदर्शन किया है कि GLUT4 झिल्ली translocation दक्षता इंसुलिन उत्तेजना के बाद CCR5 कमी हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में कम हो गया था ।

चूहों से प्रसंस्कृत हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स आगे हाइपोथैलेमस विशिष्ट प्रोटीन के साथ immunostaining द्वारा पहचाने गए थे-प्रो-opiomelanocortin (POMC) एंटीबॉडी और न्यूरॉन मार्कर-microtubule-जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) (चित्रा 2a). हम प्राथमिक प्रसंस्कृत हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस हाइपोथैलेमस प्रोटीन POMC व्यक्त की पुष्टि की । CCR5 रिसेप्टर और हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में CCL5 की अभिव्यक्ति विशिष्ट एंटीबॉडी और POMC एंटीबॉडी के साथ सह-लेबल के साथ पहचाने गए थे (चित्रा 2a, बी).
संवर्धन के 3 दिनों के बाद, न्यूरॉन्स GFP डीएनए (चित्रा 3) या GFP संयुग्मित GLUT4 (चित्रा 4) के साथ transfected थे. GFP अभिव्यक्ति आमतौर पर सभी सेल पर एक विशिष्ट पैटर्न के बिना पाया जा सकता है (चित्रा 3) लेकिन GLUT4-GFP cytosol (चित्रा 4) में एक कबरा की तरह संरचना के रूप में व्यक्त करेंगे । इस अध्ययन में प्रयुक्त अभिकर्मक किट न्यूरॉन अभिकर्मक के लिए सबसे कारगर विधि नहीं है; हालांकि, यह बेहतर सेल अस्तित्व के लिए एक कम कड़े विधि अभिकर्मक के बाद है, जो बेहतर रहते है सेल इमेजिंग में योगदान/ GFP-GLUT4 एक्सप्रेस न्यूरॉन्स की छवियों समय चूक फिल्मों (चित्रा 4a-बी, अनुपूरक वीडियो 1, 2) इंसुलिन उत्तेजना या CCL5 उत्तेजना (चित्रा 4c, अनुपूरक वीडियो 3) पर पहले ले जाया गया. GFP और GFP-GLUT4 के सिग्नल न्यूरॉन्स में स्पष्ट और मजबूत होते हैं ।
हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स के साथ GLUT4-GFP अभिकर्मक आगे इंसुलिन के साथ इलाज किया गया (४० यू) GFP-GLUT4 की विशेषता के नलए. Reprehensive वीडियो GLUT4-GFP दोनों WT और CCR5 में इंसुलिन उत्तेजना पर आंदोलन-हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स वीडियो 1 और वीडियो 2, क्रमशः के रूप में दिखाए जाते हैं. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig1.jpg"> चित्रा 1: भ्रूण चरण (१६.५ दिन) में माउस मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों से ऊतकों का अलगाव. (A-D) अपरा से पिल्ले की जुदाई में शामिल कदम । (E, F) शरीर से एक पिल्ला सिर के विच्छेदन । (G-I) खोपड़ी से पूरे मस्तिष्क के अलगाव में शामिल कदम । इस दिशा में काले तीर बिंदुओं को संदंश का प्रयोग करते हुए खोपड़ी को हटाकर खींचा जाए. (J) hypothalamus का अलगाव । काले तीर संदंश के बीच हाइपोथैलेमस क्षेत्र के लिए अंक । (K-L) माउस मस्तिष्क के प्रांतस्था का अलगाव । काले तारे को इंगित करता है माउस मस्तिष्क के cortical क्षेत्र और सफेद तीर अंक पूरे मस्तिष्क से प्रांतस्था की जुदाई के लिए । (एम-ओ) प्रांतस्था से हिप्पोकैम्पस भाग की जुदाई । ऊपरी सफेद तीर हिप्पोकैम्पस ऊतक के निशान और निचले सफेद तीर cortical ऊतक के निशान । स्केल पट्टियां = 1 सेमी (A-F), २०० µm (G-O) । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig2.jpg"> चित्रा 2: हाइपोथैलेमस न्यूरॉन मार्कर के लक्षण वर्णन-POMC और CCL5 और CCR5 की सह-अभिव्यक्ति. (क) प्राथमिक कल्चरल हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स को हाइपोथैलेमस न्यूरॉन मार्कर के साथ लेबल किया गया-POMC (लाल), CCR5 की सह-अभिव्यक्ति (हरा), और न्यूरॉन मार्कर MAP2 (ग्रे). (ख) CCL5 (हरी) अभिव्यक्ति में POMC (लाल) सकारात्मक हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स (संदर्भ17के अनुपूरक डेटा से अनुकूलित). यहां, DAPI नीले रंग के साथ नाभिक लेबल । स्केल पट्टियां = ५० µm (A) और (B) । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig3.jpg"> चित्रा 3: माउस प्राथमिक ंयूरॉंस में GFP प्रोटीन अभिव्यक्ति । GFP प्लाज्मिड डीएनए transfected प्राथमिक प्रसंस्कृत न्यूरॉन्स में 4 दिनों के बाद संस्कृति (DIV4) के साथ liposome और एक और 3 दिनों के लिए व्यक्त (DIV7). (A-B) GFP न्युरैटिस और सोमा दोनों में अभिव्यक्त होता है. (C-D) न्यूरॉन्स नकली अभिकर्मक के साथ; DAPI में नाभिक लेबल (B, D) । स्केल बार्स = १०० µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig3large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig4.jpg"> चित्रा 4: GFP के स्नैपशॉट-हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में GLUT4. (क, ग) GFP-GLUT4 प्रोटीन Wildtype में व्यक्त (WT) हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स और (ख) CCR5-/ हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स. न्यूरॉन्स इंसुलिन (ए, बी) या CCL5 (सी) के साथ उत्तेजित थे. तीर GFP को इंगित करते हैं-GLUT4 कबरा से पहले न्युरैटिस में (-) और उसके बाद (+) इंसुलिन या CCL5 उत्तेजना और तारक बिंदु को सतह GLUT4-GFP से पहले (-) और उसके बाद (+) CCL5 उत्तेजना में (ग)। (आंकड़ा17से अनुकूलित चित्रा) । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>5x बोराडे बफर</td>
			<td>कंपनी</td>
			<td>कैटलॉग संख्या</td>
			<td>वॉल्यूम</td>
		</tr>
<tr>
<td>बोरिक एसिड</td>
			<td>सिग्मा-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>१.५५ छ</td>
		</tr>
<tr>
<td>बोरेक्रस</td>
			<td>सिग्मा-Aldrich</td>
			<td>७१९९७</td>
			<td>२.३७५ छ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>१०० एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>फ़िल्टर्ड, 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>20x पाली-डी-Lysine स्टॉक</td>
			<td>कंपनी</td>
			<td>कैटलॉग संख्या</td>
			<td>वॉल्यूम</td>
		</tr>
<tr>
<td>पाली-डी-Lysine</td>
			<td>सिग्मा-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>१०० मिलीग्राम</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>१०० एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>फ़िल्टर किया गया, पर रखें-20 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x पाली-डी-Lysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>वॉल्यूम</td>
		</tr>
<tr>
<td>20x पाली-डी-Lysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x बोराडे बफर</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH२हे</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>७५ एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td>कुल</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>१०० एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 डिग्री सेल्सियस पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>धो मध्यम</td>
			<td>कंपनी</td>
			<td>कैटलॉग संख्या</td>
			<td>वॉल्यूम</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM-उच्च ग्लूकोज</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>४९५ एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td>एंटीबायोटिक-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>5 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>कुल</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>५०० एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 ° C पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain-Trypsin पाचन बफर:</td>
			<td>कंपनी</td>
			<td>कैटलॉग संख्या</td>
			<td>मात्रा अंतिम एकाग्रता/</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain (10 मिलीग्राम/</td>
			<td>सिग्मा-Aldrich</td>
			<td>P4762</td>
			<td>२०० µ l (2 mg/</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA (०.२५%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>२०० µ l (०.०५%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>धो मध्यम</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>६०० µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>कुल</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>१,००० µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>-20 डिग्री सेल्सियस पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>चढ़ाना मध्यम:</td>
			<td>कंपनी</td>
			<td>कैटलॉग संख्या</td>
			<td>वॉल्यूम</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal माध्यम</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>१७६ एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td>भ्रूण गोजातीय सीरम</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>20 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-ग्लूटामेट (२०० mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>२५०३०</td>
			<td>2 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>एंटीबायोटिक-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>2 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>कुल</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>२०० एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 डिग्री सेल्सियस पर रखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>संपूर्ण संस्कृति माध्यम</td>
			<td>कंपनी</td>
			<td>कैटलॉग संख्या</td>
			<td>वॉल्यूम</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal माध्यम</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>९५ एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 अनुपूरक (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 अनुपूरक (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-04</td>
			<td>2 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-ग्लूटामेट (२०० mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>२५०३०</td>
			<td>1 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>एंटीबायोटिक-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>कुल</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>१०० एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>हौसले से तैयार</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: पाचन बफर और मीडिया इस अध्ययन में प्रयुक्त संरचना ।
अनुपूरक वीडियो 1: इंसुलिन उत्तेजित GFP-GLUT4 WT हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में आंदोलन । <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-1.mov">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>
अनुपूरक वीडियो 2: इंसुलिन उत्तेजित GFP-GLUT4 CCR5 में आंदोलन-हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-2.mov">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>
अनुपूरक वीडियो 3: CCL5 उत्तेजित GFP-GLUT4 WT हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में आंदोलन (वीडियो संदर्भ17से अनुकूलित) । <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-3.mov">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy at JoVE.com

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

इस प्रोटोकॉल का अवलोकन के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है वास्तविक समय ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) टैग ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GLUT4) इंसुलिन उत्तेजना और इंसुलिन में CCR5 की जैविक भूमिका के लक्षण वर्णन पर प्रोटीन तस्करी – GLUT4 Deconvolution माइक्रोस्कोपी के साथ मार्ग संकेतन.

माउस प्राथमिक हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में GLUT4 प्रोटीन की तस्करी की लाइव छवियां Deconvolution माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

दोहरी दैहिक रिकॉर्डिंग gonadotropin विमोचन हार्मोन (GnRH) hypothalamic स्लाइसें में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के द्वारा पहचाने न्यूरॉन्स

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

इमेजिंग Hypothalamic माउस मस्तिष्क स्लाइस की GFP टैग न्यूरॉन्स में कैल्शियम प्रतिक्रियाएँ

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

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मस्तिष्क टुकड़ा Biotinylation: एक<em&gt; पूर्व vivo</emवयस्क न्यूरॉन्स में क्षेत्र विशेष के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी करने के लिए उपाय&gt; दृष्टिकोण

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

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Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

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Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

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माउस प्राथमिक अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स में ंयूरॉन मौत और अध कि मॉडलिंग

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Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

भ्रूणीय माउस सेरिबैलम से अलग न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

मस्तिष्क स्लाइस में और प्राथमिक सेल संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स की बैलिस्टिक लेबलिंग

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

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Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

प्राथमिक माउस मिडब्रेन न्यूरॉन्स में सहज Ca2 + फ्लक्स और उनके डाउनस्ट्रीम प्रभावों की मात्रा निर्धारित करना

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...