Name: live images of glut4 protein trafficking in mouse primary hypothalamic neurons using deconvolution microscopy
Uploaded: 2017-12-07T15:00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy at JoVE.com

Мы благодарны за субсидии, предоставленные Министерством науки и технологии, Тайвань - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) и здравоохранения и социального обеспечения за дополнительную плату табачных изделий - MOHW106-TDU-B-212-144001 с S-Y.

<ol>
	<li>Levin, B. E., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glucose+homeostasis:+does+brain+insulin+matter?.">Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter?.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).</li><li>Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+action+in+brain+regulates+systemic+metabolism+and+brain+function.">Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function.</a> Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).</li><li>Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+in+central+nervous+system:+more+than+just+a+peripheral+hormone.">Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone.</a> J Aging Res. 2012, 384017 (2012).</li><li>Vogt, M. C., Bruning, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+insulin+signaling+in+the+control+of+energy+homeostasis+and+glucose+metabolism+-+from+embryo+to+old+age.">CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age.</a> Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).</li><li>Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+insulin+receptor+signaling+in+the+brain.">The role of insulin receptor signaling in the brain.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+insulin+receptor+substrate+2+in+beta+cells+and+brain+causes+obesity+and+diabetes.">Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).</li><li>Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+due+to+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate-1+at+serine+302.">Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302.</a> J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).</li><li>Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+inflammation:+marker+or+mechanism+of+obesity+pathogenesis?.">Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis?.</a> Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).</li><li>Milanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hypothalamic+inflammation+reverses+diet-induced+insulin+resistance+in+the+liver.">Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver.</a> Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypothalamic+inflammation+associated+with+the+susceptibility+to+obesity+in+rats+exposed+to+high-fat+diet.">Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).</li><li>Kitade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5+plays+a+critical+role+in+obesity-induced+adipose+tissue+inflammation+and+insulin+resistance+by+regulating+both+macrophage+recruitment+and+M1/M2+status.">CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status.</a> Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).</li><li>Kennedy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CCR5+results+in+glucose+intolerance+in+diet-induced+obese+mice.">Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).</li><li>Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+CCL5+regulates+glucose+uptake+and+AMP+kinase+signaling+in+activated+T+cells+to+facilitate+chemotaxis.">The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis.</a> J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).</li><li>Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines/intercrines+and+central+regulation+of+feeding.">Chemokines/intercrines and central regulation of feeding.</a> Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).</li><li>Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+cell+lines+to+investigate+neuroendocrine+control+mechanisms.">Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms.</a> Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).</li><li>Lizunov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+fusion,+but+not+tethering,+of+GLUT4+vesicles+in+skeletal+muscle+of+HA-GLUT4-GFP+transgenic+mice.">Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).</li><li>Chou, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL5/RANTES+contributes+to+hypothalamic+insulin+signaling+for+systemic+insulin+responsiveness+through+CCR5.">CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5.</a> Sci Rep. 6, 37659 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Возможность контролировать живых клеток, при CCL5 или инсулин стимуляции, является критически важным для изучения быстрого эффекта CCL5 или инсулина на GLUT4 движения. В самом деле это позволяет нам визуализировать существенное различие между WT и CCR5- / - нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина. Мы выполнили поверхности маркировки эндогенного белка GLUT4 в WT и CCR5- / - нейронов гипоталамуса в разное время точках после инсулина стимуляции17. Маркировки белков клеток поверхности требует высокой специфичности антитела с низким фоном. Кроме того поверхности флуоресценции количественной оценки также может быть сложным и трудоемким. Таким образом покадровой записи позволяет нам быть уверены, что эффект CCL5 или инсулин является истинной физиологических изменений, основанных на экспериментальных условиях, вместо того, чтобы статистические вариации. Вместе с поверхности маркировки эндогенного GLUT4, мы предоставляем убедительные доказательства и экспериментов, чтобы продемонстрировать, как CCL5 и CCR5 участвуют в GLUT4 транслокации и инсулина сигнализации.
В современной клеточной биологии и молекулярной биологии исследования многие эксперименты требуют использования микроскопии флуоресцирования. Эта технология позволяет ученым для визуализации пространственных отношений между белков и/или клеточных органелл, помимо направления движения и скорости, стимулирующее воздействие, морфологические изменения и белка людьми. Однако, эта технология по-прежнему имеет свои ограничения: при возбуждении флуорофоров, сигналов от целевого белка (или области) может быть перегружены фон флуоресценции. В результате флуоресценции изображения можно размытым с ожидаемой сигналов, похоронены глубоко в фон сигналов. Это явление особенно очевидна для наблюдения за мембраны прыгните белков.
Общая микроскопии флуоресцирования внутреннего отражения (TIRFM) была разработана для преодоления этой трудности. Это позволяет ученым представить возбуждения отдельных привязанных к поверхности флуорофоров, не затрагивая фон флуорофоров. Это позволяет ученым выборочно охарактеризовать функции и события на очень тонкой поверхности региона например плазматической мембраны. Деконволюция микроскопии-образ интенсивных вычислений, обработки технику, что стало возможным с помощью технологических достижений за последние годы. Он часто использовались для улучшения разрешения изображения цифровой флуоресценции. Как упоминалось ранее, когда флуорофоров возбуждаются любые виды освещения (например, лазерные и светодиодные), все флуорофоров будет излучать световые сигналы независимо от если они находятся в центре внимания или нет, поэтому изображение всегда будет размытым. Это размывание вызвано явление под названием «Точка распространения функция» (ФСФ), как свет приходя от источника небольшой флуоресцентные (яркое пятно) будет распространяться дальше и стать не в фокусе (размытие). В принципе это событие будет производить Песочные часы как формы флуоресцентного сигнала, и образ флуоресценции может состоять из многочисленных такие световые сигналы. Деконволюция процесс может переназначить все сигналы флуоресценции к своей первоначальной форме яркие пятна и устранить большинство из фокус света улучшить контрастность изображения.
В последние годы деконволюция алгоритмы создают изображения с сопоставимыми резолюции что конфокального микроскопа. Кроме того по сравнению с TIRFM, который предотвращает размытие вне фокуса будучи обнаруженным ограниченной возбуждения региона,-поля микроскопии позволяет всем свет сигналы, чтобы быть обнаружены и переназначает их обратно к их источнику через процесс деконволюции. Таким образом на практике, деконволюции микроскопии стала не только более эффективный метод получения изображения, но и более эффективный метод по сравнению с TIRF микроскопии.

Сахарный диабет типа 2 (T2DM) представляет собой кризис глобального здравоохранения. T2DM характеризуется инсулина, сигнализации обесценения и хронического воспаления в периферических тканях. Гипоталамус является центр управления, который регулирует энергетического гомеостаза организма, аппетит и циркадные ритмы. Самое главное гипоталамус также посредником инсулин сигнал реагировать регулировать системного метаболизма1,2,3,4,5. Нарушая гипоталамуса инсулина сигнализации, путь может индуцировать инсулин сопротивление6,7. Гипоталамус координирует клеточной энергии статус и секреции гормонов, таких как инсулин и адипокинов (например, лептин) от периферических тканей, регулируют метаболизм системных глюкозы, инсулина быстродействие и приема пищи. Инсулин связывание с рецепторами инсулина активирует рецепторов инсулина субстрата (IRS) белков, которые затем активировать инсулина течению сигнальных молекул, таких как PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназы) и AKT (протеинкиназы B (PKB/AKT)), чтобы побудить GLUT4 транслокации мембраны. Нейроны не являются основной мишенью для поглощение глюкозы в ответ инсулина; Однако значительные уровни выражения GLUT4 были определены в регионе гипоталамуса дугообразном ядре (ARC). Таким образом регулирование GLUT4 в нейронов гипоталамуса могут играть важную роль в инсулине сигналов в мозг периферической оси.
Многие исследования показали, что хроническое воспаление и воспалительные chemokines в гипоталамусе также играют важную роль в развитии диабета и ожирения, и подавление гипоталамо воспаления может обратить вспять диета индуцированного инсулина сопротивления 8 , 9 , 10. Кроме того, хемокиновых CCL5 (C-C мотив лигандом 5, также известный как RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) и его рецептор CCR5 уровнях также коррелирует с развитием T2DM11,12. Роли CCL5 и CCR5 в функции и глюкозы метаболизм инсулина остаются неясными. Одно исследование сообщало, что CCR5 дефицит защищенных мышей от ожирения индуцированной воспаления, макрофагов вербовки и инсулин сопротивление11; в отличие от другого исследования сообщили, что CCR5 дефицит ухудшает системных глюкозе, а также Адипоцит и мышцы инсулина, сигнализации12. CCL5 найдена увеличить поглощение глюкозы в Т-клеток и уменьшить потребление пищи через свои действия на гипоталамус13,14, однако, механизм действия и рецепторов, участвующих еще должны быть определены.
Это трудно изучение клеточных механизмов, лежащих в основе эффект воспаление периферических тканей на инсулин, функционирующих в нейронов гипоталамуса. Это по соображениям сотовой неоднородность и нейрон цепь обратной связи. По этой причине в пробирке модель культуры клеток обеспечивает чистую модель для изучения последствий хемокиновых гипоталамуса инсулин сигнал регулирования. Хотя есть много установленных увековечен гипоталамуса нейрональных клеточных линий для использования в исследовательских целях, эти клеточные линии выразили различные маркеры и поэтому представляют собой различные типы нейронов гипоталамуса15. Хотя основной гипоталамуса культур может быть трудно поддерживать, они могут обеспечить наиболее реалистичный ответ нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина и можно также избежать возможных неизвестные эффекты, которые приходят в играть при поддержании клеток Долгосрочный в питательной среды с искусственных факторов роста.
Здесь мы используем первичной нейронов гипоталамуса C57BL/6 wildtype (WT) мыши и CCR5 нокаут (CCR5- / -) Мышь и transfect обоих типов клеток с GFP-GLUT4 конструкции. Расследовать CCR5 вклад инсулина при посредничестве GLUT4 мембраны людьми, GFP-GLUT4 transfected нейронов относились с инсулина или рекомбинантным CCL5. Мы затем характеризуют движение GFP-GLUT4 на плазматической мембране в первичной нейронов гипоталамуса с деконволюция микроскопии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="935">
	<tbody>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:257px;">DeltaVision deconvolution microscope</td>
			<td style="width:173px;">Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">SoftWorX application software</td>
			<td style="width:173px;">Applied Precision Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">used to control microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">VoloCITY software&#160;</td>
			<td style="width:173px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">used to analyze the images</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Actrapid, Denmark</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Liposome</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668019</td>
			<td style="width:387px;">Lipofectamine&#174; 2000, used for plasmid DNA transfection</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">GFP control plasmid DNA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">provided by Professor Samuel Cushman</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">GFP-GLUT4 plasmid DNA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">provided by Professor Samuel Cushman</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Anti-mouse Alex-488</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A-11001</td>
			<td style="width:387px;">Secondary anitbody</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Anti-rabbit IgG -Alex-568</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A-11036</td>
			<td style="width:387px;">Secondary anitbody</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">CCL5/RANTES</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">478-MR-025</td>
			<td style="width:387px;">10ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:173px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">#FL42572A</td>
			<td style="width:387px;">0.17mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">12 mm Microscope coverglass</td>
			<td style="width:173px;">Deckglaser</td>
			<td style="width:119px;">#41001112</td>
			<td style="width:387px;">used for immmunstaining study</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">micro-dissecting scissors</td>
			<td style="width:173px;">Klappenecker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">curved-tipped forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ideal-tek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">standard straight-tipped forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ideal-tek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:173px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:387px;">Purify Endotoxin free plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">5 ml pipette&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Corning costar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4487</td>
			<td style="width:387px;">dissociate brain tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live images of glut4 protein trafficking in mouse primary hypothalamic neurons using deconvolution microscopy

Сахарный диабет типа 2 (T2DM) представляет собой кризис глобального здравоохранения, который характеризуется инсулина, сигнализации обесценения и хронического воспаления в периферических тканях. Гипоталамуса в центральной нервной системе (ЦНС) является центром управления для энергетики и инсулин сигнал ответа регулирования. Хроническое воспаление в периферических тканях и диспропорций в некоторых chemokines (например, CCL5, TNFα и IL-6) способствуют диабета и ожирения. Однако функциональные механизм(ы) соединения chemokines и гипоталамо инсулин сигнал регулирование по-прежнему остаются неясными.
В vitro первичный нейрон культуры модели являются удобной и простой модели, которые могут быть использованы для изучения инсулин сигнал регулирования в нейронов гипоталамуса. В этом исследовании мы внедрили периферийной GLUT4 белка с GFP (GFP-GLUT4) в первичных нейронов гипоталамуса отслеживать GLUT4 мембраны транслокации после стимуляции инсулина. Промежуток времени изображения оборота белка GFP-GLUT4 были записаны деконволюция микроскопии, что позволило пользователям создавать высокоскоростной, с высоким разрешением изображения без повреждения нейронов значительно во время проведения эксперимента. В CCR5 несовершенным нейронов гипоталамуса, которые были изолированы и культивировали от CCR5 нокаут мышей наблюдалось вклад CCR5 в инсулин регулируется GLUT4 транслокации. Наши результаты показывают, что эффективность транслокации мембраны GLUT4 был уменьшен в CCR5 несовершенным нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина.

Нейронов гипоталамуса, культивированный от мышей были далее определены иммуноокрашивания с гипоталамуса конкретных - про opiomelanocortin (POMC) антитела и нейрональных маркер - микротрубочек связанный протеин 2 (MAP2) (рис. 2A). Мы подтвердили, что основной культурный нейронов гипоталамуса выразил гипоталамуса белка POMC. Выражение рецептор CCR5 и CCL5 в нейронов гипоталамуса были определены с специфическими антителами и совместно помечены POMC антитела (рисунок 2A, 2B).
После 3 дней культивирования, нейроны были transfected с GFP ДНК (рис. 3) или GFP проспряганное GLUT4 (рис. 4). Экспрессия гена GFP обычно можно найти все, что клетки без определенного шаблона (рис. 3), но GLUT4-GFP будет выражать как пунктата как структура в цитозоле (рис. 4). Трансфекция комплект, используемые в данном исследовании не является наиболее эффективным методом для transfection нейрона; Однако это менее строгие метод для лучшего выживаемость клеток после трансфекции, которая способствует лучше жить клеточной изображений/записи позже. Изображения выражая нейронов GFP-GLUT4 были взяты до замедленной съемки фильмов (Рисунок 4A-B, дополнительные видео 1, 2) при стимуляции инсулина или CCL5 стимуляции (рис. 4 c, дополнительные видео 3). Сигналы GFP и GFP-GLUT4 являются ясными и сильным в нейроны.
Нейронов гипоталамуса с transfection GLUT4-ГФП были далее лечение инсулином (40 ед) характеризовать GFP-GLUT4 людьми. Возмутительное видео GLUT4-GFP движения после стимуляции инсулина в WT и CCR5- / - нейронов гипоталамуса показаны видео 1 и видео 2, соответственно.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig1.jpg"> Рисунок 1: изоляции тканей из разных регионов мозга мыши на эмбриональной стадии (день 16.5). (A-D) Этапы в отделение щенков от плаценты. (E, F) Рассечение головы щенка от тела. (G-я) Этапы в изоляции весь мозг от черепа. Черная стрелка указывает в направлении быть вытащил во время удаления черепа с помощью щипцов. (J) изоляции гипоталамуса. Черная стрелка указывает на гипоталамические региона между щипцами. (K-L) Изоляция коры головного мозга мыши. Черный звездочка указывает регионе коры головного мозга мыши и белая стрелка указывает к разделению корой от весь мозг. (M-O) Отделение части гиппокампа от коры. Верхняя белая стрелка знаменует гиппокампа ткани и нижняя белая стрелка знаменует кортикального слоя ткани. Масштаб баров = 1 см (A-F), 200 мкм (G-O). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig2.jpg"> Рисунок 2: характеристика нейронов гипоталамуса маркера - POMC и Сопредседатель выражение CCL5 и CCR5. (A) основным культивировали нейронов гипоталамуса были помечены нейронов гипоталамуса маркер - POMC (красный), Сопредседатель выражение CCR5 (зеленый) и нейрон маркера MAP2 (серый). (B) CCL5 (зеленый) выражение в POMC (красный) положительных нейронов гипоталамуса (адаптировано из дополнительных данных ссылка17). Здесь DAPI помечены ядро с синим цветом. Масштаб баров = 50 мкм в (A) и (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig3.jpg"> Рисунок 3: белка экспрессия гена GFP в мышь первичной нейронов. GFP плазмида ДНК transfected в основной культурный нейроны после 4 дней культуры (DIV4) с липосомами и выражена еще 3 дней (DIV7). (A-B) GFP выражается в невриты и сома. (C-D) Нейроны с макет трансфекции; DAPI помечены ядро в (B, D). Масштаб баров = 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig4.jpg"> Рисунок 4: снимки GFP-GLUT4 в нейронов гипоталамуса. (A, C) Белка GFP-GLUT4 в Wildtype (WT) нейронов гипоталамуса и (B) выразил CCR5- / - нейронов гипоталамуса. Нейроны были стимулируется с инсулина (A, B) или CCL5 (C). Стрелки указывают GFP-GLUT4 пунктата в неврит до (-) и после (+) инсулин или CCL5 стимуляции и звездочки указывают на поверхности GLUT4-GFP до (-) и после (+) CCL5 стимуляции (C). (Рисунок адаптировано из ссылка17). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>5 х Borade буфера</td>
			<td>Компания</td>
			<td>Номер каталога</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Борная кислота</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>1.55 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Буры</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71997</td>
			<td>2,375 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Фильтруется, хранить при 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x поли-D-лизин фондовой</td>
			<td>Компания</td>
			<td>Номер каталога</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Поли D-лизин</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>100 мг</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Фильтруется, держите при температуре-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x поли D-лизин</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x поли D-лизин</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 х Borade буфера</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>75 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Итого</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Хранить при 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вымойте среднего</td>
			<td>Компания</td>
			<td>Номер каталога</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глюкоза DMEM-высокий</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>495 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Антибиотик Antimyotic</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Итого</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Хранить при 4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Папаин-трипсин пищеварение буфер:</td>
			<td>Компания</td>
			<td>Номер каталога</td>
			<td>Объем/окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Папаин (10 мг/мл)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762</td>
			<td>200 мкл (2 мг/мл)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Трипсин ЭДТА (0,25%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>200 МКЛ (0,05%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Вымойте среднего</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Итого</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Хранить при температуре от-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Обшивка среднего:</td>
			<td>Компания</td>
			<td>Номер каталога</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal средний</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>176 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Плода бычьим сывороточным</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>20 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-глутаминовой кислоты (200 мм)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25030</td>
			<td>2 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Антибиотик Antimyotic</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>2 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Итого</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Хранить при 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полная культуры среднего</td>
			<td>Компания</td>
			<td>Номер каталога</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal средний</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>95 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 дополнение (100 x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 дополнение (50 x)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504-04</td>
			<td>2 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-глутаминовой кислоты (200 мм)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25030</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Антибиотик Antimyotic</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Итого</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Свежеприготовленные</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Пищеварение буфера и СМИ состав используется в данном исследовании.
Дополнительные видео 1: Инсулин стимулирует GFP-GLUT4 движение в WT нейронов гипоталамуса. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-1.mov">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительные видео 2: Инсулин стимулирует GFP-GLUT4 движение в CCR5- / - нейронов гипоталамуса. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-2.mov">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительные видео 3: CCL5 стимулирует GFP-GLUT4 движение в WT нейронов гипоталамуса (Видео взято из ссылка17). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-3.mov">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy at JoVE.com

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Этот протокол описывает метод для наблюдения в реальном времени зеленый флуоресценции белков (ГПУП) меткой 4 транспортера глюкозы (GLUT4) белки людьми после стимуляции инсулина и характеристика биологической роли CCR5 в инсулин GLUT4 сигнальный путь с деконволюция микроскопии.

Изображения в реальном времени GLUT4 белка оборота первичной нейронов гипоталамуса мыши с помощью микроскопии деконволюция

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Двойной Записи Соматические от гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) Нейроны, идентифицируемый зеленый флуоресцентный белок (GFP) в гипоталамус Ломтики

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Изображениями кальция Ответы на GFP с метками нейроны гипоталамуса фрагменты мозга мыши

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Первичная культура Mouse дофаминергических нейронов

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Количественная оценка спонтанных потоков Ca2 и их эффектов вниз по течению в первичных нейронах среднего мозга мыши

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...