Name: live images of glut4 protein trafficking in mouse primary hypothalamic neurons using deconvolution microscopy
Uploaded: 2017-12-07T15:00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy at JoVE.com

Vi är tacksamma för de bidrag som tillhandahålls av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) och Socialstyrelsen avgiftsbelagd för tobaksvaror - MOHW106-TDU-B-212-144001 till S-Y C.

Alla protokoll och metoder används i animaliska ämnen har godkänts av institutionella djur vård och användning kommittéer (IACUC) Taipei Medical University (protokoll nummer: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. primära Neuron kultur
<ol><li>Förberedelser innan kultur
	<ol>
<li>Coat kultur rätter med poly-D-lysin (tabell 1) en dag före kultur. För en 6-väl skål, tillsätt 1,5 mL poly-D-lysin (0,05 mg/mL) i varje brunn. För live-imaging, kultur celler på ett 12 x 12 mm täckglas i en standard belagda 6-bra platta.</li>
		<li>Ta bort/återvinna den poly-D-lysin och diska två gånger med 2 mL ddH2O.</li>
		<li>Förbereda de kirurgiska verktyg: ett par mikro-dissekera saxen, böjda-tipped pincett och standard rak-tipped pincett. Sterilisera kirurgiska verktyg och hålla dem i 75% etanol under operation.</li>
		<li>Fyll 10 cm petriskålar med 20 mL tvätta medium (tabell 1) och hålla på is.</li>
		<li>Fyll ett 15 mL provrör med 15 mL tvätta medium och hålla röret på is.</li>
	</ol></li>
	<li>Hjärnans vävnad isolering från olika hjärnregioner
	<ol>
<li>Offra 16-19 dag gammal dräktiga honmöss med standard dödshjälp protokoll genom att placera möss i en icke ventilerade bur och sedan berusande med CO2. E15.5 ~ E16.5 embryon rekommenderas för hypotalamus neuronala kultur och E16.5 ~ E17.5 är mer lämpade för hippocampus och kortikala neuronala kultur.</li>
		<li>Sterilisera den plattform, dissekera mikroskopet och kirurgi verktyg med 75% etanol att undvika kontaminering.</li>
		<li>Skär runt navelsträngen området (mörka röda området, figur 1A, 1B streckad linje) för att isolera ungarna lätt utan att skada dem (figur 1 c, 1 D).</li>
		<li>Ta bort huvudet portion av varje valp med en sax (figur 1E, F) och sedan skydda huvudet portion in med spetsig raka pincetten för regionen ögat (figur 1 g). Använd en annan spetsig böjd pincett för att ta bort den yttre huden och skalle från två sidor och lossnar dem från den främre i dorsal riktning (figur 1 H, svart pilen pekar i riktning). Hjärnan bör isoleras utan skador (figur 1I). Obs: Det är viktigt att upprätthålla integriteten i hjärnan för att säkerställa noggrannheten när isolera olika regioner av hjärnan.</li>
		<li>Hålla isolerade hjärnor i en ren petriskål med iskall tvätta medium för följande steg.</li>
		<li>Vänd hjärnan och hålla den ventral sidan. Hypothalamus är en rund struktur i mitten av hjärnan (figur 1J, pilen pekar på hypotalamus regionen). Isolera hypotalamus vävnaden med spetsig böjd pincett. Ta bort meningerna (som har en gulröd färg) noggrant. Varning: Fullständig borttagning av hjärnhinnorna är ett viktigt steg för att undvika fibroblast kontaminering.</li>
		<li>Håll den luktsinnet LOB med vassa pincetten och lossnar tunna hjärnhinnan som omger hela hjärnan med böjda tången (figur 1 K, L).</li>
		<li>Hippocampus är en banan-liknande form som är inbäddad i den nedre delen av hjärnbarken. Vänd på undersidan av cortex och separera hippocampus från cortex genom att dra det åt sidan med böjda pincetten (bild 1 MN, och O). Glöm inte att ta bort alla återstående hjärnhinnor som omger hjärnvävnaden.</li>
		<li>När alla regioner av hjärnan har isolerats, hacka dessa vävnader i 15 mL rör som innehåller iskall tvätta medium med hjälp av tången (steg 1.1.5). Obs: Hjärnans vävnader kan hållas i det iskalla tvätta mediet för 2-3 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Vävnaden matsmältningen, plätering och kultur
	<ol>
<li>Skölj vävnaderna genom att vända den vävnad innehållande 15 mL rör 2 - 3 gånger och sedan hålla röret rakt så att vävnaderna att bosätta sig på (1-3 min).</li>
		<li>Ta bort det övre mediet använder glaset Pasteur-pipett bifogas ett vakuumsystem. För att tvätta vävnaden, tillsätt 15 mL ice cold wash medium och Invertera röret 2 - 3 gånger. Tvätta stegen 3 gånger innan nästa steg. Varning: Var försiktig med vävnader på botten när du tar bort övre mediet använder ett vakuumsystem.</li>
		<li>Efter den sista tvättningen, ta bort tvätta mediet med hjälp av 1 mL pipett.</li>
		<li>Inkubera vävnader med Papain-Trypsin matsmältningen buffert (tabell 1) i 37 ° C vattenbad för 7-14 min. skaka rören var två min så alla vävnader utsätts ordentligt för matsmältningen bufferten. Obs: Inkubationstiden och volymen av matsmältningen buffert kan justeras baserat på vävnad storleken. För hypotalamus vävnad som samlats in från 6-8 ungar, rekommenderas 300 µL Papain-Trypsin buffert och 7 min inkubering koktiden. Mer vävnad kommer att kräva mer matsmältningen buffert.</li>
		<li>Neutralisera den enzymaktivitet genom att lägga till 1 volymdel fetalt bovint serum. Skaka provröret 3 - 5 gånger i rumstemperatur.</li>
		<li>Håll röret på rack och vänta 1-2 min så att vävnaderna att bosätta sig; ta bort supernatanten noggrant med en 1 mL pipett.</li>
		<li>Tillsätt 6 mL plätering medium (tabell 1) in i provröret och Pipettera vävnaden up-and-down 50 gånger med 5 mL pipett försiktigt (för en 6-well platta, 1,5 mL plätering medium per brunn rekommenderas). De flesta celler kommer att separera in enstaka celler efter upprepad pipettering. Obs: Försök att undvika bildandet av bubblor under utförande av detta steg. De flesta laboratorier använder flammade glas betesmark pipetter för att sära på vävnaden. En 5 mL pipett med en smal spets kan vara ett bra alternativ för det här steget.</li>
		<li>Hålla en tub på racket och vänta 1-2 min att tillåta chunky, un-dissocierade vävnader att slå sig ner. Ta den övre fasen som innehåller differentierade celler till en ny tub och späd med plätering medium (5 x volym plätering medium per 1 x volym dissocierade celler. Till exempel, tillsätt 5 mL plätering medium för 1 mL separerade celler).</li>
		<li>Beräkna cell densiteten med hjälp av en hemocytometer och utsäde det nödvändiga antalet celler i kultur plattan belagd med poly-D-lysin som i steg 1.1.1. Vi rekommenderar 2-4 x 105 celler per brunn för en 6 väl maträtt/35 mm maträtt rekommenderades för neuron studier avbildning. Högre densitet skulle behövas för protein insamling och analys. Obs: Lägg inte för mycket plätering medium, 1-1,5 mL plätering medium i en 6-väl maträtt är tillräcklig för fastsättning. En överdriven mängd medium kommer att förlänga den tid som krävs för korrekt cell fastsättning.</li>
		<li>Vänta 2-3 h och kontrollera de seedade nervcellerna under mikroskopet. Nervceller börjar växa neurit när de fäster ordentligt.</li>
		<li>Ta bort plätering medium och tillsätt 2 mL värmde tvätta medium (37 ° C) i skålen att tvätta bort plätering medium. Upprepa detta steg två gånger.</li>
		<li>Tillsätt 2 mL komplett odlingsmedium (tabell 1) i varje brunn i 6-väl skålen.</li>
		<li>Ändra hälften av medlet efter 3-4 dagar. Förbereda det komplett mediet nymalen varje gång. Nervceller som odlade från annan mus av hjärnan har olika morfologi och egenskaper (figur 2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. transfection av Plasmid DNA in i primära Neuron med Liposom System
FÖRSIKTIGHET: För neuron transfection rekommenderas en endotoxinfria plasmid DNA rening kit (Material tabell) för DNA beredning. Ytterligare etanol nederbörd kan ta bort överflödig vätska och förbättrar DNA-koncentration.
<ol><li>
Liposom-baserad DNA transfection i primära nervceller. Obs: Transfection tiden beror på mognad status krävs i experiment. Hypotalamus nervceller var transfekterade på DIV 7-10 (DIV, dagar in vitro).<ol>
<li>DNA: Liposom blandningsförberedelsen: Späd GFP-GLUT4 plasmid DNA16 (2 µg) i en mikrocentrifug rör innehållande 300 µL låga serum odlingsmedium. Förbereda en annan mikrocentrifug rör med 2 µL Liposom i 300 µL låga serum odlingsmedium och inkubera i 5 min i rumstemperatur.</li>
		<li>Kombinera innehållet i båda rören och inkubera i 20-30 min i rumstemperatur.</li>
		<li>Ta bort neuron odlingssubstratet från kultur skålen. Lägga till 600 µL DNA-Liposom blandning i varje brunn och inkubera vid 37 ° C i 4-6 h.</li>
		<li>Efter 4-6 h, ta bort DNA-Liposom blandningen och tillsätt 2 mL odlingsmedium.</li>
		<li>Fluorescerande signaler, till exempel GFP ensam och GLUT4 protein konjugerat med GFP tagg (figur 3 och figur 4), kan observeras efter 18-72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. levande bildinspelning
<ol><li>
Förbereda celler för Live Imaging
	<ol>
<li>Kultur WT och CCR5- / - hypotalamus neuron celler som uttrycker grön fluorescens protein märkt glukostransportör 4 (GFP-GLUT4) på #1.5 (eller 0.17 mm tjocklek) täckglas som varit före belagda med poly-D-lysin i steg 1.1.1 i 6-brunnen plattan.</li>
		<li>Försiktigt bort coverslips med nervceller med pincett och placera den på glasskivor med försiktighet.</li>
		<li>Ta bort överflödig medium/vätska med delikat uppgift våtservetter. Vik våtservetter två gånger, och försiktigt placera dem ovanpå täckglaset. Tryck försiktigt ned våtservetter utan att flytta på täckglas. Varning: Tryck inte på täckglas mot glasskiva kraftfullt. Syftet med detta steg är att säkerställa att den täckglas inte flytta/drift under Bild Förvärvandet orsakas av stark kraft.</li>
		<li>Placera coverslips och diabilder på deconvolution Mikroskop scenen, med täckglas vänd nedåt och säkrade ordentligt. Detta steg är att se till att positionen bilden förblir konstant så att användare kan spåra samma uppsättning målceller senare.</li>
		<li>Iaktta WT och CCR5- / - hypotalamus neuron celler med en 60 x / 1,42 NA olja nedsänkning objektiv.</li>
		<li>Behandla de markerade cellen proverna med CCL5 (10 ng/mL) eller insulin (10 E/mL) för en min. Tillsätt 1,5 µL utspädda insulin på kanten av täckglaset.</li>
		<li>Visualisera och spela in de markerade cellen proverna omedelbart. Program den videoinspelning programvaran för att spela in i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deconvolution mikroskopi och analys Obs: Denna del av protokollet kräver användning av en avfaltning mikroskopet och specialiserad programvara för analys.<ol>
<li>Slå på strömmen av bildgivande systemet, tillåta Mikroskop scenen för att initiera korrekt, och slå sedan på den LED-ljuskällan.</li>
		<li>Lägg till nedsänkning olja (brytningsindex 1.520 för levande prover vid 37 ° C) på en 60 x 1,42 NA objektiv. Placera provet bilden på mikroskopet med den täckglas vänd mot objektivet och säkra bilden ordentligt.</li>
		<li>Använd ljusa fält eller fluorescens belysning för att identifiera målceller. Justera fokus tills målceller tydligt kan observeras. Flytta inte objektivet utanför området täckglas för att undvika onödiga repor.</li>
		<li>Identifiera grön fluorescens protein konjugerat glukos Transporter 4 (GFP-GLUT4) av GFP signalen. Identifiera önskad målceller för bild förvärv. Valda målpositionen cell kan memoreras för framtida referens (figur 4).</li>
		<li>Setup rätt experimentella parametrar (inklusive PIXELet numrerar, excitation våglängd, överföring procentandel, exponeringstid, stack tjocklek, tidsintervall och total imaging tid) på varje målcellen. För detta experiment fastställdes bild pixel antalet till 512 x 512 (det kan ställas in på 1 024 x 1 024 för högre upplösning) för god Jordbrukarsed signaler. Exponeringstiden var inställd mellan 0,025 till 0,05 s för varje 5 min. mindre lateral x, y och z justeringar kan styras av rekommenderade programvara (material tabell).</li>
		<li>Ange parametern exponering till cirka 2.000 till 3.000 räknas att uppnå maximal pixel intensitet. För att minimera fluorescens fotoblekning, minska andelen ljus magnetiseringsöverföringen så mycket som möjligt medan hålla exponeringen tid mindre än 1 s. Upprepa dessa steg för varje ytterligare fluorescens kanal och varje enskilt intresseområde.</li>
		<li>Ange den övre och undre gränsen för Z-stacken på varje målcellen. Detta kan uppnås genom att flytta Mikroskop scenen tills toppen och botten av målcellen är båda något ur fokus. Användare kan justera bildupplösningen i z-axeln genom att ställa in antalet bilder mellan den övre och undre gräns (vilket kan göras genom att ställa in avståndet mellan varje bild).</li>
		<li>Travar av bilder var deconvolved och senare analyseras med hjälp av respektive programvaran – hastighet från PerkinElmer i detta fall.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Levin, B. E., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glucose+homeostasis:+does+brain+insulin+matter?.">Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter?.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).</li><li>Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+action+in+brain+regulates+systemic+metabolism+and+brain+function.">Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function.</a> Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).</li><li>Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+in+central+nervous+system:+more+than+just+a+peripheral+hormone.">Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone.</a> J Aging Res. 2012, 384017 (2012).</li><li>Vogt, M. C., Bruning, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+insulin+signaling+in+the+control+of+energy+homeostasis+and+glucose+metabolism+-+from+embryo+to+old+age.">CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age.</a> Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).</li><li>Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+insulin+receptor+signaling+in+the+brain.">The role of insulin receptor signaling in the brain.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+insulin+receptor+substrate+2+in+beta+cells+and+brain+causes+obesity+and+diabetes.">Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).</li><li>Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+due+to+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate-1+at+serine+302.">Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302.</a> J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).</li><li>Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+inflammation:+marker+or+mechanism+of+obesity+pathogenesis?.">Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis?.</a> Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).</li><li>Milanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hypothalamic+inflammation+reverses+diet-induced+insulin+resistance+in+the+liver.">Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver.</a> Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypothalamic+inflammation+associated+with+the+susceptibility+to+obesity+in+rats+exposed+to+high-fat+diet.">Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).</li><li>Kitade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5+plays+a+critical+role+in+obesity-induced+adipose+tissue+inflammation+and+insulin+resistance+by+regulating+both+macrophage+recruitment+and+M1/M2+status.">CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status.</a> Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).</li><li>Kennedy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CCR5+results+in+glucose+intolerance+in+diet-induced+obese+mice.">Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).</li><li>Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+CCL5+regulates+glucose+uptake+and+AMP+kinase+signaling+in+activated+T+cells+to+facilitate+chemotaxis.">The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis.</a> J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).</li><li>Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines/intercrines+and+central+regulation+of+feeding.">Chemokines/intercrines and central regulation of feeding.</a> Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).</li><li>Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+cell+lines+to+investigate+neuroendocrine+control+mechanisms.">Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms.</a> Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).</li><li>Lizunov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+fusion,+but+not+tethering,+of+GLUT4+vesicles+in+skeletal+muscle+of+HA-GLUT4-GFP+transgenic+mice.">Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).</li><li>Chou, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL5/RANTES+contributes+to+hypothalamic+insulin+signaling+for+systemic+insulin+responsiveness+through+CCR5.">CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5.</a> Sci Rep. 6, 37659 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Möjlighet att övervaka levande celler, vid CCL5 eller insulin stimulering, är kritiskt viktigt för att studera snabba effekten av CCL5 eller insulin på GLUT4 rörelse. I själva verket tillåter det oss att visualisera den signifikanta skillnaden mellan WT och CCR5- / - hypotalamus nervceller vid insulin stimulering. Vi har utfört ytan märkning av endogena GLUT4 protein i WT och CCR5- / - hypotalamus nervceller vid olika tidpunkter efter insulin stimulering17. Märkning av cell ytproteiner kräver hög-specificitet antikroppar med låg bakgrund. Dessutom kan ytan fluorescens kvantifiering också vara utmanande och tidskrävande. Således, time-lapse recording tillåter oss att vara säker på att effekten av CCL5 eller insulin är en sann fysiologisk förändring baserat på experimentella förhållanden, i stället för en statistisk variation. Tillsammans med surface märkning av endogena GLUT4, erbjuder vi starka bevis och experiment för att visa hur CCL5 och CCR5 delta i GLUT4 translokation och insulin signalering.
I modern cellbiologi och molekylärbiologi studier kräver många experiment utnyttjandet av fluorescensmikroskopi. Denna teknik tillåter forskare att visualisera rumsliga förhållandet mellan proteiner och/eller cellulära organeller, förutom rörelseriktning och hastighet, stimulerande effekter, morfologiska förändringar och protein människohandel. Denna teknik har dock fortfarande sin begränsning: när fluorophores är upphetsad, signaler som sänds från målproteinet (eller område) kan bli överväldigad av bakgrunden fluorescens. Som ett resultat, kan fluorescens bilder suddiga med förväntade signaler begravd djupt i bakgrunden signaler. Detta fenomen är särskilt tydligt för observationen av membran-bundna proteiner.
Total inre reflektion Fluorescence mikroskopi (TIRFM) utvecklades för att övervinna denna svårighet. Det tillåter forskare att visualisera excitation av valda yta-bundna fluorophores utan att påverka den bakgrunden fluorophores. Det tillåter forskare att selektivt karakteriserar funktioner och händelser på en mycket tunn yta region som ett plasmamembran. Deconvolution mikroskopi är ett arbetsintensivt bildbehandling teknik som möjliggörs med hjälp av tekniska framsteg under de senaste åren. Det har ofta använts för att förbättra digital fluorescens bildupplösning. Som nämnts tidigare, när fluorophores exciteras av någon typ av belysning (såsom laser eller LED), avger alla fluorophores ljus signaler oavsett om de är i fokus eller inte, så bilden visas alltid suddiga. Detta oskärpa som orsakas av ett fenomen som kallas ”punkt sprida funktion” (PSF), eftersom ljus kommer från en liten fluorescerande källa (ljuspunkt) kommer att sprida ut ytterligare och bli ur fokus (oskärpa). I princip denna händelse kommer att producera en timglas-liknande formade fluorescerande signal och en fluorescens bild kan bestå av många sådana ljussignaler. Deconvolution processen kan omtilldela alla fluorescens signaler till dess ursprungliga ljusa spot form, och eliminera de flesta av out-of-fokus ljuset att förbättra bildens kontrast.
Under de senaste åren har deconvolution algoritmer genererade bilder med jämförbar upplösning som confocal Mikroskop. Dessutom i jämförelse med TIRFM, som förhindrar out-of-fokus oskärpa från att bli upptäckt av en begränsad excitation region, wide-fältet mikroskopi låter alla ljus signalerar att upptäckas och tilldelar dem tillbaka till deras källa genom deconvolution processen. Därför i praktiken blivit deconvolution mikroskopi inte bara en mer effektiv bild förvärvsmetod, men också en mer kostnadseffektiv metod jämfört med Frida mikroskopi.

Diabetes mellitus typ 2 (T2DM) är en global hälsa kris. T2DM kännetecknas av insulin signalering njurfunktion och kronisk inflammation i perifera vävnader. Hypothalamus är Kontrollcenter som reglerar kroppens energi homeostas, aptit och dygnsrytm. Viktigast av allt, förmedlar hypotalamus också insulin signal lyhördhet för att reglera systemisk metabolism1,2,3,4,5. Störa hypotalamus insulin signalering utbildningsavsnitt skulle kunna framkalla insulin resistens6,7. Hypothalamus samordnar cellulär energistatus och utsöndringen av hormoner såsom insulin och adipokines (e.g., leptin) från perifera vävnader, att reglera systemisk glukosmetabolism, insulin lyhördhet och födointag. Insulin bindande till insulin receptor aktiveras insulin receptor substrat (IRS) proteiner, som sedan aktivera insulin nedströms signalmolekyler, såsom PI3K (fosfatidylinositol 3-Kinas) och AKT (proteinkinas B (PKB/AKT)), att framkalla GLUT4 membranet translokation. Nervceller är inte det stora målet för glukosupptag i svar till insulin; dock har betydande nivåer av GLUT4 uttryck identifierats i regionen hypotalamus arcuate nucleus (ARC). Regleringen av GLUT4 i hypotalamus nervceller kan därför spela en viktig roll i insulin signalering i hjärnan-perifera axeln.
Många studier har föreslagit att kronisk inflammation och inflammatoriska chemokiner i hypotalamus också spela en viktig roll i utvecklingen av diabetes och fetma, och hämning av hypotalamus inflammation kan återföra kost-inducerad insulinresistens 8 , 9 , 10. övrigt, chemokine-CCL5 (C-C motiv ligand 5, även känd som RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) och dess receptor CCR5 nivåer korrelerar också med utveckling av T2DM11,12. CCL5 och CCR5 roller i insulin funktion och glukos metabolism förblir oklart. En studie rapporterade att CCR5-brist skyddade möss från fetma-inducerad inflammation, makrofag rekrytering och insulin resistens11; Däremot rapporterade en annan studie att CCR5-brist försämrar systemisk glukostolerans, liksom fettceller och muskel insulin signalering12. CCL5 återfinns att öka glukosupptag i T-celler och minska födointaget genom sitt agerande på hypotalamus13,14, dock båda verkningsmekanismen och receptorerna som är inblandade är ännu identifieras.
Det är svårt att studera cellulära mekanismerna bakom effekten av perifer vävnadsinflammation på insulin funktion i hypotalamus nervceller. Detta beror på cellulära heterogenitet och neuron krets feedback förordningar. Av denna anledning ger en kultur i vitro cell modell en ren modell för att undersöka effekterna av chemokine på hypotalamus insulin signal förordning. Det finns många etablerade förevigade hypotalamus neuronala cellinjer för forskningsändamål, dessa cellinjer uttryckt olika markörer, och representerar därför olika typer av hypotalamus nervceller15. Även om primära hypotalamus kulturer kan vara svårt att upprätthålla, de kan ge den mest realistiska Svaren av hypotalamus nervceller vid insulin stimulering, och kan också undvika potential okända effekter som kommer in i spela vid underhåll celler långsiktig odlingsmedium med konstgjorda tillväxtfaktorer.
Häri, vi använda primära hypotalamus nervceller från både C57BL/6 vildtyp (WT) mus och CCR5 knockoutmus (CCR5- / -) och transfect båda typer av celler med GFP-GLUT4 konstruktion. För att undersöka CCR5 bidrag till insulin medierad GLUT4 membran människohandel, behandlades GFP-GLUT4 transfekterade nervceller med insulin eller rekombinant CCL5. Vi präglar sedan rörelsen av GFP-GLUT4 på plasmamembranet i primära hypotalamus nervceller med Deconvolution mikroskopi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="935">
	<tbody>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:257px;">DeltaVision deconvolution microscope</td>
			<td style="width:173px;">Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">SoftWorX application software</td>
			<td style="width:173px;">Applied Precision Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">used to control microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">VoloCITY software&#160;</td>
			<td style="width:173px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">used to analyze the images</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Actrapid, Denmark</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Liposome</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668019</td>
			<td style="width:387px;">Lipofectamine&#174; 2000, used for plasmid DNA transfection</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">GFP control plasmid DNA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">provided by Professor Samuel Cushman</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">GFP-GLUT4 plasmid DNA</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">provided by Professor Samuel Cushman</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Anti-mouse Alex-488</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A-11001</td>
			<td style="width:387px;">Secondary anitbody</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Anti-rabbit IgG -Alex-568</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">#A-11036</td>
			<td style="width:387px;">Secondary anitbody</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">CCL5/RANTES</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">478-MR-025</td>
			<td style="width:387px;">10ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:173px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">#FL42572A</td>
			<td style="width:387px;">0.17mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">12 mm Microscope coverglass</td>
			<td style="width:173px;">Deckglaser</td>
			<td style="width:119px;">#41001112</td>
			<td style="width:387px;">used for immmunstaining study</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">micro-dissecting scissors</td>
			<td style="width:173px;">Klappenecker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">curved-tipped forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ideal-tek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">standard straight-tipped forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ideal-tek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:387px;">Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:257px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:173px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:387px;">Purify Endotoxin free plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">5 ml pipette&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Corning costar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">4487</td>
			<td style="width:387px;">dissociate brain tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live images of glut4 protein trafficking in mouse primary hypothalamic neurons using deconvolution microscopy

Diabetes mellitus typ 2 (T2DM) är en global hälsa kris som kännetecknas av insulin signalering njurfunktion och kronisk inflammation i perifera vävnader. Hypothalamus i det centrala nervsystemet (CNS) är ett kontrollcenter för energi och insulin signal svar förordning. Kronisk inflammation i perifera vävnader och obalanser i vissa chemokiner (t.ex. CCL5, TNFα och IL-6) bidra till diabetes och fetma. De funktionella mekanismerna ansluta chemokiner och hypotalamus insulin signal förordning fortfarande är dock fortfarande oklart.
In vitro primära neuron kultur modeller är bekväm och enkel modeller som kan användas för att undersöka insulin signal förordning i hypotalamus nervceller. I denna studie introducerade vi främmande GLUT4 protein konjugerat med GFP (GFP-GLUT4) till primära hypotalamus nervceller att spåra GLUT4 membran translokation vid insulin stimulering. Time-lapse bilder för GFP-GLUT4 protein människohandel spelades in av deconvolution mikroskopi, som får användare att generera höghastighetståg, högupplösta bilder utan att skada nervceller betydligt samtidigt genomför experimentet. Bidraget av CCR5 i insulin regleras GLUT4 translokation observerades i CCR5 bristfällig hypotalamus nervceller, som var isolerade och odlade från CCR5 knockoutmöss. Våra resultat visade att GLUT4 membran translokation effektivitet reducerades i CCR5 bristfällig hypotalamus nervceller insulin stimulation.

Hypotalamus nervceller odlade från möss identifierades ytterligare genom immunfärgning med hypotalamus specifikt protein - pro-opiomelanocortin (POMC) antikropp och neuronala markör - mikrotubulära-associerade protein 2 (MAP2) (figur 2A). Vi bekräftade den primära odlade hypotalamus nervceller uttryckt hypotalamus protein POMC. Uttrycket av CCR5 receptor och CCL5 i hypotalamus nervceller identifierades med specifika antikroppar och samtidig märkt med POMC antikropp (figur 2A, 2B).
Efter 3 dagars odling, nervceller var transfekterade med GFP DNA (figur 3) eller GFP konjugerat GLUT4 (figur 4). GFP uttryck kan vanligtvis hittas över cellen utan ett visst mönster (figur 3) men den GLUT4-GFP kommer att uttrycka som en punktuell-liknande struktur i cytosolen (figur 4). Transfection kit används i denna studie är inte den effektivaste metoden för neuron transfection; Det är dock en mindre stränga metod för bättre cellöverlevnad efter transfection, vilket bidrar till bättre live-cell imaging/inspelning senare. Bilder av GFP-GLUT4 uttrycker nervceller togs innan time-lapse filmer (figur 4A-B, kompletterande video 1, 2) insulin stimulering eller CCL5 stimulering (figur 4 c, kompletterande video 3). Signalerar av god Jordbrukarsed och GFP-GLUT4 är tydliga och starka i nervceller.
Hypotalamus nervceller med GLUT4-GFP transfection behandlades ytterligare med insulin (40 U) att karakterisera GFP-GLUT4 människohandel. Klandervärt videor GLUT4-GFP rörlighet vid insulin stimulering i både WT och CCR5- / - hypotalamus nervceller visas som Video 1 och Video 2, respektive.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig1.jpg"> Figur 1: isolering av vävnader från olika regioner av hjärnan som musen på embryostadiet (dag 16,5). (A-D) De olika stegen i separation av valpar från moderkakan. (E, F) Dissektion av ett pup huvud från kroppen. (G-jag) De olika stegen i isolering av hela hjärnan från skallen. Svart pilen pekar i riktningen att dras när du tar bort skallen med pincett. (J) isolering av hypotalamus. Den svarta pilen pekar på hypotalamus regionen mellan tången. (K-L) Isolering av cortex av mus hjärnan. Svart asterisken indikerar kortikala regionen mus hjärnan och vita pilen pekar till avskiljandet av cortex från hela hjärnan. (M-O) Avskiljandet av hippocampus portion från cortex. Den övre vita pilen markerar Hippocampus vävnaden och den nedersta vita pilen markerar kortikal vävnad. Skala barer = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig2.jpg"> Figur 2: karakterisering av hypotalamus neuronala markör - POMC och samtidig uttryck för CCL5 och CCR5. (A) primär odlade hypotalamus nervceller var märkt med hypotalamus neuronala markör - POMC (röd), samtidig uttrycket av CCR5 (grön) och neuron markör MAP2 (grå). (B), CCL5 (grön)-uttryck i POMC (röd) positiva hypotalamus nervceller (anpassad från kompletterande data referens17). Här, märkt DAPI kärnan med blå färg. Skala barer = 50 µm i (A) och (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig3.jpg"> Figur 3: GFP proteinuttryck i mus primära nervceller. GFP plasmid DNA transfekterade till primära odlade nervceller efter 4 dagar kultur (DIV4) med Liposom och uttryckt för en annan 3 dagar (DIV7). (A-B) GFP uttrycks i både neurit och soma. (C-D) Nervceller med mock transfection; DAPI märkt kärnan i (B, D). Skala barer = 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56409/56409fig4.jpg"> Figur 4: ögonblicksbilder av GFP-GLUT4 i hypotalamus nervceller. (A, C) GFP-GLUT4 protein uttryckt i vildtyp (WT) hypotalamus nervceller och (B) CCR5- / - hypotalamus nervceller. Nervceller stimuleras med insulin (A, B) eller CCL5 (C). Pilarna pekar på den GFP-GLUT4 punktuell i neurit innan (-) och efter (+) insulin eller CCL5 stimulering och asterisker peka på den ytan GLUT4-GFP innan (-) och efter (+) CCL5 stimulering i (C),. (Figur anpassad från referens17). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/56409fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>5 x Borade buffert</td>
			<td>Företaget</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borsyra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>1.55 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71997</td>
			<td>2.375 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filtrerad, hålla vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x Poly-D-lysin lager</td>
			<td>Företaget</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filtrerad, hålla på-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 x Poly-D-lysin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x Poly-D-lysin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x Borade buffert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hålla vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tvätta Medium</td>
			<td>Företaget</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM-hög glukos</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>495 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotika-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hålla vid 4° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain-Trypsin matsmältningen buffert:</td>
			<td>Företaget</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Volym/slutlig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762</td>
			<td>200 µL (2 mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>200 ΜL (0,05%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tvätta Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hålla vid-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plätering medium:</td>
			<td>Företaget</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>176 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetalt bovint Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamat (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotika-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hålla vid 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komplett odlingsmedium</td>
			<td>Företaget</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Volym</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>95 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 tillägg (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 tillägg (50 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-04</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamat (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiotika-Antimyotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nylagade</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Matsmältningen buffert och media sammansättning används i denna studie.
Kompletterande Video 1: Insulin stimulerat GFP-GLUT4 rörelse i WT hypotalamus nervceller. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-1.mov">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Video 2: Insulin stimulerat GFP-GLUT4 rörelse i CCR5- / - hypotalamus nervceller. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-2.mov">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Video 3: CCL5 stimuleras GFP-GLUT4 rörelse i WT hypotalamus nervceller (Video anpassad från referens17). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56409/JoVE-Video-3.mov">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy at JoVE.com

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Det här protokollet beskriver en teknik för observation av realtid grönt fluorescerande Protein (GFP) taggade glukos Transporter 4 (GLUT4) protein människohandel på insulin stimulans och karakterisering av CCR5 biologiska roll i det insulin – GLUT4 signalering utbildningsavsnitt med Deconvolution mikroskopi.

Levande bilder av GLUT4 Protein människohandel mus primära hypotalamus nervceller använder Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Dubbla Somatisk Inspelningar från gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) Nervceller Märkt med grönt fluorescerande protein (GFP) i hypotalamus Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Primär kultur av neuroner isolerade från embryonala mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk märkning av pyramidal neuroner i hjärnan skivor och i primär cell kultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Kvantifiera spontana Ca2 + flussmedel och deras nedströms effekter i Primär Mus Midbrain Nervceller

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...