Name: studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain
Uploaded: 2018-01-04T12:30:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain at JoVE.com

אנו אסירי תודה תמך משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), הבריאות והרווחה, תמורת תשלום נוסף של מוצרי טבק - MOHW106-TDU-B-212-144001 S-Y. סי

הערה: כל הפרוטוקולים ואת שיטות המשמשות בנושאים בעלי חיים אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש ועדות (IACUC) של האוניברסיטה לרפואה טייפה (פרוטוקול מספרים: LAC-2014-0387)
1. הכנת מערכות מיקרו-Osmotic משאבת אינפוזיה
הערה: להכין את המשאבה מאגר מלאכותי הנוזל השדרתי (כלנית חדד), סמים (פתרון חלבון Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL בכלנית חדד)) בתנאים סטריליים באמצעות מאגרי מסונן עם 0.2 µm מסננים, לנהל את כל ההליכים מתחת למכסה המנוע תרבות עם כפפות. ניתוחים נערכים כדלקמן:
<ol>
	<li>להכין את המשאבות מיקרו-osmotic יום אחד לפני הניתוח: למלא את משאבת מיקרו-osmotic המוח עם נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) עם מזרק 1 מ"ל ואת המחט ראש-בלאנט מסופקים יחד עם הערכה. לטבול את משאבת מיקרו-osmotic כלנית חדד, הניחו אותו על מטרף ומנערים בעדינות בין לילה. התראה: המשאבה צריך להיות מלא כלנית חדד, יש להימנע בועות אוויר בתוך המשאבה (איור 1 א').</li>
	<li>לפני תחילת הניתוח, להכין את הפתרון חלבון רקומביננטי Met-CCL5/RANTES (10 ננוגרם למ"ל, חנה המבר מדולל ב) כדי לשמש את הניסוי. חנה המבר להסיר המשאבה, למלא את המשאבה עם הפתרון סמים לאט עד עודף ידלוף החוצה. הערה: חנה המבר 15 מ"ל או פתרון Met-CCL5/RANTES הוא מספיק עבור 5-8 משאבות. התראה: חזור על התהליך כדי להבטיח המשאבה מתמלא לחלוטין התרופה ללא בועות בפנים.</li>
	<li>לחתוך את צינורות קטטר לתוך לאורך הרצוי וחבר אותם עם מחט עירוי קצה קהה המוח ערכת אינפוזיה המוח. למלא את ערכת אינפוזיה וצינורות עם התרופה.</li>
	<li>לבסוף, להרכיב, לצרף משאבת מיקרו-osmotic ערכת אינפוזיה של המוח. התראה: אין בועות צריך להיווצר ברכבת התחתית או המשאבה (איור 1 א').</li>
	<li>לטבול את פיוז'ן מוח-משאבת osmotic כולו להגדיר חנה המבר בשפופרת סטיריליים 50 מ ל כדי למנוע את המשאבה מתייבשת. קבוצת פיוז'ן מוח-משאבת osmotic מוכן כעת לשמש לניתוח. הערה: מערכת משאבת מיקרו-osmotic יכול לשמש עבור אינפוזיה סמים לטווח ארוך. פעולה זו מבטיחה מצב נוח ובטוח של משלוח סמים לתוך המוח העכבר.</li>
</ol>
2. גרם ניתוח חדרית – השרשה של המשאבה osmotic מיקרו
התראה: לעקר את הסביבה כירורגית עם 75% אתנול ולהבטיח כי האנשים המעורבים במחקר לובש כפפות סטריליות, חלוק מעבדה נקייה. כלי ניתוח / מכשירים חייב להיות בלוק יבשים לפני השימוש, לאחר מכן סטיריליים עם 75% אתנול עכברים שביניהם ניתוחים.
<ol>
	<li>שוקל את העכבר ואת עזים ומתנגד אותו באמצעות הזרקת התוך הצפק (IP) עם קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (קטמין 50 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים 10 מ"ג/ק"ג). התראה: עכברים משקולות גוף נמוך יותר מאשר 24 g לא מומלצים לניתוח ההשתלה osmotic המשאבה.</li>
	<li>הר ולתקן את הראש העכבר על המנגנון סטיאוטטי (איור 1B).</li>
	<li>השתמש זוג מספריים כירורגיים, מכשירים כדי לחתוך את העור החיצונית המכסה את הגולגולת. השתמש יוד כדי לנקות את הגולגולת היקפיים.</li>
	<li>הפרד בין השכבה החיצונית ביותר של העור מן העור תת עורית בעזרת זוג לחצם בלנט-הראש ליד האזור הצוואר להשתלה מוח-משאבת osmotic פיוז'ן set (איור 1C).</li>
	<li>לסמן את נקודת אינפוזיה עם reference על המפה המוח (איור 1D) באמצעות המנגנון סטיאוטטי. בניסוי זה, המחט צריך להיות קטנטנים באזור החדר 3רואד (Bregma: 0.0 מ מ לרוחב, 1.3 מ מ אחורי, הגחון 5.7 mm).</li>
	<li>לקדוח חור באמצעות תרגיל מסמר מסביב לאזור המסומן על הגולגולת (איור 1E). זהירות: יש להיזהר לא לשבור את העכבר קרומי המוח וכלי הדם, וכך להימנע מהפרעה של מיקרו-הדם במוח.</li>
	<li>למקם את ערכת פיוז'ן מוח-משאבת מיקרו-osmotic המכיל כלנית חדד (כפקד) או סמים (Met-CCL5/RANTES חלבון פתרון) מתחת לעור מאחורי באזור הצוואר ואת הוספה המוח החדרת מחט לתוך החור מסועף כדי להשרות את התרופה לתוך המוח עכבר ( איור 1E). המחט חודרת קרומי המוח ולהיכנס הנוזלים. לתקן את המחט במקום על הגולגולת באמצעות ג'ל ביטול הרגישות פני השטח (איור 1F) והמתן 1-2 דקות עד שהדבק מתייבש. בשלב הבא, אחתוך את החלק מקרין על המחט (איור 1 ג'י- H).</li>
	<li>השתמש דבק דבק רקמות כדי לרפא את הפעולה פצע על הראש. החל µL 50 של הדבק על הפצע, תתעשת על שני הצדדים של העור, לחכות 30 s כדי לאפשר לעור לאטום (איור 1I). התראה: השתמש בלוח אלכוהול 100% כדי לנקות את הפצע אחרי ניתוח ו 100 פניצילין ul עם סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום. הערה: העכבר העור ליצור רקמה צלקתית, לרפא בתוך כמה ימים בעקבות הממשל של דבק כירורגי. היתרון העיקרי של הדבק הוא ההתרחקות תפרים כירורגי, אשר עלולים לגרום גירוי בעור או דלקת.</li>
	<li>המקום העכבר בתוך כלוב נקי שמרה על צלחת חמה (מחוממת עד 37 ° C) ולחכות עד העכבר והשיחזור השפעת הרדמה. התראה: חיוני כדי לשמור על טמפרטורת גוף של העכבר כדי לשפר את הסיכוי לשרוד לאחר הניתוח.</li>
	<li>לאחר תקופה של שבוע התאוששות, העכברים יהיה מוכן לניסויים נוספים, כגון מבחן רגישות גלוקוז דרך הפה (OGTT), מבחן עמידות לאינסולין (ITT).</li>
</ol>
3. בדיקת עמידות הגלוקוז אוראלי (OGTT)
הערה: לבצע את הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה 7 ימים לאחר העירוי של כלנית חדד, MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). לשמור על ה 6 מהיר עבור העכברים לפני OGTT עם אספקת מים מספקת. להרחיק את החיות על אותו ספסל עבודה היכן הניסויים יבוצעו כך הם יכול להתאקלם הסביבה כדי להפחית את הלחץ במהלך ההליך.
<ol>
	<li>גלוקוז פתרון הכנה: לפני ביצוע הניסוי, להכין תמיסת גלוקוז על ידי המסת 3.75 g גלוקוז 15 מ"ל מזוקקים H2O.</li>
	<li>להגדיר לוח זמנים כדי להקליט את הקריאות במהלך ההליך ניסיוני (טבלה 1). הערה: חשוב להגדיר זמן-שולחן עם מרווחי נכונה בין כל בדיקת דם כדי לאפשר מדויק הקלטה במהלך הניסוי.</li>
	<li>שוקל כל העכבר לאחר צום, לחשב את הכמות המתאימה של גלוקוז כדי להיות מוזרק.</li></ol>לדוגמה, אם העכבר שוקל 30 גרם, הכמות של תמיסת גלוקוז ינוהלו להיות 300 µL.
	<li>הכנת הכלים הבאים העבודה:<ol>
		<li>סוכר (לחץ לחצן התחל כדי לבדוק את מצב הסוללה, לוודא שהוא מתפקד לפני המבחן.)</li>
		<li>גלוקוז צ'יפ</li>
		<li>מזרק אינסולין (מזרק אינסולין 0.3 mL)</li>
		<li>סכיני גילוח</li>
		<li>שעון עצר</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ברגע הספסל מוגדר, למדוד, להקליט את רמת הסוכר בדם כדלקמן: לשים נקי, גלוקוז חדש צ'יפ לתוך סוכר, לחצו על לחצן start לאפס אותה.</li>
	<li>הרם את העכבר על-ידי האחורי של הצוואר ולטף את הזנב מספר פעמים כדי להבטיח זרימת דם מספקת באזור הזנב.</li>
	<li>בעזרת סכין גילוח חדשה לחתוך חתיכה קטנה של הזנב, לסחוט טיפת דם אחת קטנה (בערך 10-20 µL) לתוך השבב גלוקוז. הדם צריך למלא את השבב כדי לאפשר מדידה מדויקת. סוכר יציג רמת הסוכר באופן מיידי. אם המכונה מראה "שגיאה", חזור על התהליך עם שבב גלוקוז חדש. הערה: השבב גלוקוז דורשת רק טיפה אחת של דם. כאשר דגימת הדם צריך להיות שנאספו יותר מפעם אחת, פשוט הפעילו לחץ על-ידי הפעלת את האצבעות לאורך זנב העכבר מספר פעמים תוך החזקת סוף הזנב ישירות על גבי השבב כדי לאסוף את הדם. אין צורך לחתוך את הזנב בכל פעם תוך איסוף דגימות דם.</li>
	<li>בשלב הבא, להאכיל העכברים גלוקוז (0.25 g/mL) בעל-פה על-ידי שימוש בטכניקה intragastric gavage. האם יש לחשב את כמות הגלוקוז ינוהלו באמצעות הנוסחה: 10 X גוף תמיסת גלוקוז משקל (BW) µL (לדוגמה, אם העכבר שוקל 30 גרם, הכמות של תמיסת גלוקוז ינוהלו יהיה 300 µL). התחל את הטיימר מיד לאחר מתן גלוקוז דרך הפה.</li>
	<li>חזור על הפעולות מדידה גלוקוז-15, 30, 60, 90, 120 דקות.</li>
	<li>לאחר כל גלוקוז ברמת הקריאות תועדו, למחוק את סכיני וטוגנים גלוקוז במיכל חומרים מסוכנים. לשים את האוכל בחזרה לתוך הכלובים עכברים ולהחזיר אותם לחדר בעלי חיים.</li>

4. אינסולין רגישות הבדיקה (ITT)
הערה: מבחן עמידות לאינסולין ואת העמסת צריכה להיות מתוכננת לפחות 7 ימים בנפרד כדי להפחית את השפעת צום על בעלי חיים. עבור הבדיקה עמידות לאינסולין (ITT), אינסולין אנושי (0.75 U/Kg) תנוהל באמצעות הזרקת ה-IP.
<ol>
	<li>הכנה של 0.25 U אינסולין פתרון: לדלל אינסולין אנושי 100U ביחס של 1:400 בתמיסת.</li>
	<li>שוקל כל העכבר לאחר צום, ולחשב את כמות האינסולין מוזרק בהתאם: הנפח (µL) של אינסולין U 0.25 להיות מוזרק IP = 3 X BW (0.75 U אינסולין/ק"ג משקל גוף). לדוגמה: לעכבר השוקל 28.8 g, להזריק: 28.8 X 3 = 86.4 µL (0.25 U מדולל אינסולין) (טבלה 2). התראה: החיות באותה ייתכן שיהיה גוף שונים משקולות לאחר 6 שעות צום בימים שונים. לכן, זה הכרחי למדוד את משקל הגוף לפני ואחרי צום והתנהגות ש-OGTT ולבדוק ITT. משקל הגוף העכבר יכול להוריד בהתאם מינים, מין, משך צום. במינונים גבוהים יותר של אינסולין יכול לגרום להלם אינסולין, יוביל למוות של החיה.</li>
	<li>להגדיר טבלה (טבלה 2) כדי להקליט את הקריאות במהלך ההליך ניסיוני. חזור על השלבים 3.4. ל 3.8. עבור רמות הגלוקוז בדם מדידה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines/intercrines+and+central+regulation+of+feeding.">Chemokines/intercrines and central regulation of feeding.</a> Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).</li><li>Milanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+hypothalamic+inflammation+reverses+diet-induced+insulin+resistance+in+the+liver.">Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver.</a> Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypothalamic+inflammation+associated+with+the+susceptibility+to+obesity+in+rats+exposed+to+high-fat+diet.">Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet.</a> Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).</li><li>Benomar, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+leptin+induce+Glut4+plasma+membrane+translocation+and+glucose+uptake+in+a+human+neuronal+cell+line+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+dependent+mechanism.">Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism.</a> Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).</li><li>Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+regulation+of+insulin+signaling+through+IRS-1+phosphorylation.">Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation.</a> Biochimie. 87, 99-109 (2005).</li><li>Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+due+to+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate-1+at+serine+302.">Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).</li><li>Boura-Halfon, S., Zick, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+IRS+proteins,+insulin+action,+and+insulin+resistance.">Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance.</a> American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).</li><li>Chou, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL5/RANTES+contributes+to+hypothalamic+insulin+signaling+for+systemic+insulin+responsiveness+through+CCR5.">CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5.</a> Sci Rep. 6, 37659 (2016).</li><li>Calegari, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+of+the+hypothalamus+leads+to+defective+pancreatic+islet+function.">Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function.</a> J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).</li><li>Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+inflammation+to+the+brain-liver+axis.">Linking inflammation to the brain-liver axis.</a> Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).</li><li>Tavares, E., Minano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANTES:+a+new+prostaglandin+dependent+endogenous+pyrogen+in+the+rat.">RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat.</a> Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).</li><li>Appay, V., Rowland-Jones, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANTES:+a+versatile+and+controversial+chemokine.">RANTES: a versatile and controversial chemokine.</a> Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).</li><li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system.">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> J Vis Exp. , e50326 (2013).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Admission+blood+glucose+and+in-hospital+clinical+outcome+among+patients+with+acute+stroke+in+Inner+Mongolia,+China.">Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China.</a> Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).</li><li>Olsen, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+glucose+in+acute+stroke.">Blood glucose in acute stroke.</a> Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).</li><li>De Jong, W. H., Borm, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+and+nanoparticles:applications+and+hazards.">Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards.</a> Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).</li><li>Kitade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5+plays+a+critical+role+in+obesity-induced+adipose+tissue+inflammation+and+insulin+resistance+by+regulating+both+macrophage+recruitment+and+M1/M2+status.">CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status.</a> Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).</li><li>Kennedy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CCR5+results+in+glucose+intolerance+in+diet-induced+obese+mice.">Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המנגנון של דלקת כרונית של נוגדנים קשורים כגון CCL5 והקולטן שלו – CCR5 להתפתחות סוכרת מסוג 2-עדיין לא ברור. דלקת כרונית גורמת מקרופאג חדירה לתוך רקמות adipose ומשפיע ברגולציה של adipokines; בינתיים, זה גם מושך תאי-β, מחליש את הפרשת האינסולין מ איי לנגרהנס בתגובה הגלוקוז בדם. ההיפותלמוס במוח ממלא תפקיד חשוב כמרכז הבקרה בתיאום אותות רקמות היקפיים מערכתית בוויסות התיאבון, מטבוליזם הגלוקוז הדם ההיקפיים, תגובת אינסולין אינסולין ו- adipokine. מחקרים גם מראים כי דלקת היפותלמי מוביל פגומים ויסות האנרגיה הומאוסטזיס וכן פגומים הלבלב איון של תפקודי כבד2,3,9,10. CCL5 במוח תורמת המזון צריכת וגוף לוויסות טמפרטורת11,ההיפותלמוס12; עם זאת, המתאם של CCL5 אל ההיפותלמוס ומערכתית אינסולין איתות ברור. CCL5 כל הגוף נוקאאוט עכבר (CCL5- / -) נוצרה כדי להתייחס לשאלה זו, אשר מראה של פנוטיפ עמידות לאינסולין עם רמות אינסולין גבוהות, רמות הגלוקוז בדם גבוהה בדם8. עם זאת, זה דורש הרבה זמן לפתח את פנוטיפ T2DM וזה קשה לחקור את התפקיד ואת מנגנון CCL5 אינסולין היפותלמי אות עקב תופעות אפשריות הבולמוס לטווח ארוך. לכן טפלול ישיר של CCL5 איתות בנוירונים ההיפותלמוס היא הגישה הטובה ביותר. יש, עם זאת, מספר סוגים של נוירונים באזור ההיפותלמוס, וזה די יקר וצורך ליצור תאים ספציפיים נוקאאוט עכברים. ניצול של ICV אינפוזיה מערכת יכול ובכך לחסוך זמן ומספקים גישה ספציפי יותר לתמרן את הפונקציה CCL5 ישירות במוח, תוך עקיפת אפשרי תגובות דלקתיות היקפיים.
לימודי ניצול משאבות osmotic שכבר פורסמו בעבר, מתן דוגמאות נהדר והדגמות של טכניקות מעורב ההשתלה של משאבות osmotic מכרסמים13. עם זאת, אנחנו בפני כמה אתגרים בעת ביצוע פרוטוקולים אלה במחקר שלנו. ראשית, חלק מהציוד בשימוש בפרוטוקול הוא די יקר, כולל 1) מערכת החשמל כדי להגיע למיקום, ציור, החדרת המחט לתוך מוח העכבר, 2) מערכת תרמו לשמירה על טמפרטורת הגוף עכבר ו- 3)-החמצן-איזופלוריין אספקת מערכת לניהול הרדמה לעכברים. שנית, הטכניקות המתוארות במאמרים אחרים היו קשים לשכפל כי היינו רק מסוגל להשתמש בבעלי חיים בתוך טווח קטן של משקולות הגוף בגילאים מסוימים עבור המחקר שלנו. . אנחנו מודעים לכך עכברים גדולים יותר מתאים יותר ניתוח ההשתלה. עם זאת, במחקר שלנו, נאלצנו להשתמש עכברים קטנים יותר ויותר צעירות כדי להימנע מעודף משקל ו השפעות ההזדקנות על תקנה גלוקוז לאינסולין ודם: רק זכר עכברים עם הגוף משקל 25 ± 2 g וגיל בסביבות בן חודשיים נבחרו במחקר. לפיכך, קשה לבצע ניתוח, תפר את הפצע על הראש העכבר. שלישית, לתגובה דלקתית יש ולהגזים לאחר הניתוח מאז ציטוקינים דלקתיים המטרה במחקר זה. עכברים וחולדות באפשרותך להסיר תפרים ולאחר פצעים פתוחים בקלות לאחר הניתוח, אשר לגרום לדלקת, להגדיל כימוקין תגובות. לכן, אסטרטגיה כדי להגיע את המיקום ואת לצייר את המחט לתוך מוח העכבר זה מונע זיהום משני הוא הכרחי. לכן, אנחנו ששינה את הפרוטוקולים שתואר לעיל כדי להפוך טכניקה זו העלות האפקטיבית, קל יותר, פחות מזיקים על חיות כמתואר בפסקה הבאה.
ראשית, היינו תרגיל הציפורן באופן ידני לקדוח חור סביב אזור היעד מסומן על הגולגולת, כפי שמתואר בשלב 2.6. בשיטה זו הוא העלות האפקטיבית, ומאפשר לנו לנטר את כל ההליך על מנת למנוע נזק את העכבר קרומי המוח וכלי הדם. תקנה גלוקוז בדם הוא לקוי לאחר שבץ חריפה, כגון דימום תת במוח. היפרגליקמיה חריפה והסימפטומים כמו סוכרת נצפו גם לאחר שבץ בתוך הגדרות קלינית14,15. בדומה לכך, מצאנו גם תגובת אינסולין וברמת גלוקוז לקוי בעכברים עם דימום ומוגלה במוח. אנו מודעים כי שליטה טובה יותר של הניתוח מבוסס על המדריך הכרחי להבטיח עקביות בתוצאות. שנית, אנחנו ניצלו biomaterial רפואי פיתח נפוץ במרפאות, רקמות דבק דבק (שלב 2.8), כדי לאטום את העור על הראש העכבר לאחר ניתוח, לפיכך, הימנעות תפרים, מאיץ את קצב הריפוי. זה מקל על ביצוע ניתוחים, מקטין את הסיכוי של דלקת משנית. שלישית, משך הזמן הנדרש לביצוע הליך כירורגי כולו הוא יחסית קצר יותר, אשר מגדילה את הסיכוי של ההישרדות של העכברים, מוריד את המינון של סם הרדמה להיות מוזרק intraperitoneally. אנחנו ציין שיעור הישרדות גבוה (95%) וקיבלתי תוצאות מדויקות יחסית לפי פרוטוקול זה שונה.
המגבלה של טכניקה זו היא מסגרת זמן קצרה יחסית של תרופות. למרות משאבת osmotic ניתן להציב לתוך הגוף העכבר לחלופין ללא פתיחה מחדש של המוח, המחקר שלנו רק מתמקד כימוקין דלקתיות ההשפעה על המוח לווסת את האיתות היקפית לאינסולין מערכתית. בניתוח נוסף ברקמות היקפיים יכול יכול לגרום לתגובה דלקתית ברקמות היקפיים, אשר אז להגדיל את הביטוי כימוקין דלקתיות להשפיע על התוצאות. שנית, זמן מחצית החיים של התרופה מגביל גם את משך הזמן של המחקר. חומרים כגון כימוקין בדרך כלל יש תוחלת חיים קצרה יותר, שמאבדת את פעילותה לאורך זמן, אבל זה גם מאפשר לנו לחקור את ההשפעה של CCL5 חוסמת איתות במוח לטווח קצר. מחקרים קודמים שלנו תיארו גם בגישה ההנדסה הגנטית ליצירת עכבר נוקאאוט CCL5, אשר מספק מודל עם השפעות לטווח ארוך8.
ישנם כמה טכניקות חדשות, שיטות אלטרנטיביות לספק סמים לתוך המוח. ננו-טכנולוגיה היא טכניקה חזקה, אשר יכול לשמש כדי לספק סמים לתוך מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, תרופות רבות thermosensitive, יכול להיהרס כשאתה מנסה לארוז אותן לתוך חלקיקים16. בנוסף, חלקיקים יכולים לעבור BBB ולהיות uptaken על ידי תאים המתאימים siRNA או הסמים הנפוצים ביותר, אבל זה לא שיטה אידיאלית עבור איגוד קולטן ליגנד.CCL5 דורשת. מחייב את הקולטן שלו, CCR5, בתוך הנוירונים ARC ההיפותלמוס לקחת אפקט8, ואת מסירת CCL5 אנטגוניסט MetCCL5 לתוך הנוירונים באמצעות חלקיקים עלולה לגרום לאובדן של היכולת לאגד ולחסום CCR5 על התא השטח.
רמת הסוכר בדם היה גבוה משמעותית בעכברים מנוהל עם CCL5 MetCCL5-אנטגוניסט לעומת הפקדים (עכברים עם חנה המבר) במבחן סובלנות גלוקוז דרך הפה. אינסולין נוסף המינהל (מבחן עמידות לאינסולין) היתה גם אפשרות להורדת רמת הסוכר בדם ב- MetCCL5 קבלת עכברים (איור 4B), אשר טוען כי אינסולין אנדוגני וחיצוניים לא יכול להפחית את רמות הגלוקוז בדם בעת חסימת האיתות CCL5 ההיפותלמוס. עכברים הפך עמידות לאינסולין ללא פעילות CCL5 בהיפותלמוס. זרחון serine302 מוגבר של מס הכנסה-1 נמצאה בעכברים שקיבלו Met-CCL5 לעומת בקרת עכברים שקיבלו כלנית חדד (איור 5A-B). זרחון סרין 302 של מס הכנסה-1 הוכח לגרום דיסוציאציה גופנית של מס הכנסה-1 של הקולטן אינסולין, אשר הוא הגורם העיקרי עמידות לאינסולין6; אינסולין הוא מצליח להפעיל את אותות הזרם כגון מסלול PI3K-Akt. Ex-vivo אינסולין גירוי מחקר אישר האינסולין מולקולת איתות במורד הזרם Akt (p-AktS473) לא הופעלה על ידי אינסולין ברקמת היפותלמי העכבר רווי Met-CCL5 והגדילה, במקום זאת, זרחון סרין 302. בסך הכל, נתונים פיזיולוגיים (OGTT ו- ITT) והן במחקר מולקולרי מדגימים כי איתות CCL5 ההיפותלמוס שמתווכת התקנה האות ההיפותלמוס אינסולין, אשר תורמת חילוף החומרים, התנגדות, גלוקוז, אינסולין שיטתית.
התפקיד ואת מנגנון של CCL5 ושל CCR5 בחולי סוכרת השמנת יתר-הקשורים עדיין לא ברור. . Kitade et al. דיווח כי מחסור CCR5 מוגן עכברים דלקת הנגרמת השמנת יתר, גיוס macrophage, עמידות לאינסולין17. עם זאת, מחקרים אחרים על ידי קנדי. et al. למצוא תוצאה הפוכה המציין כי CCR5 לקוי פוגע גלוקוזה מערכתית, כמו גם אינסולין adipocyte ושרירים איתות18. שני המחקרים להחיל דיאטה עתירת שומן לזירוז השמנה, מה שמוביל דלקת כרונית כל הגוף ותגובה הבולמוס. מחקרים אלו לא סיפקו מנגנונים נקי וברור של CCL5 ושל CCR5 אינסולין איתות רגולציה. מצד שני, הטכניקה משאבת osmotic מאפשר אינפוזיה מסוים של המוח ומונעת תגובה לתת פיצוי עם מסירתה מוגבל בזמן.
לסיכום, למרות המשאבה osmotic עם מערכת העירוי המוח נראה טכניקת "מיושן", הוא מספק שיטה זול יותר, קל יותר, פחות מזיק של תרופות, מסייעת לחקור את הפונקציה של ליגנד קולטן איתות ב המוח.

האינסולין משפיע על מגוון רחב של רקמות כולל המוח. אינסולין עובר דרך מחסום הדם - מוח, מזין את מערכת העצבים המרכזית (CNS), נקשר עם קולטן לאינסולין (IR) בהיפותלמוס לווסת את צריכת המזון, הפעילות הסימפתטית ואת תגובת אינסולין היקפיים. דלקת כרונית ברקמות adipose היקפיים הוצע לתרום סוג 2 סוכרת (T2DM), אך כיצד תגובות דלקתיות אלו משפיעות על אינסולין מאותת בהיפותלמוס לתווך מערכתית אינסולין התגובה ואי סבילות לגלוקוז עדיין לא ברור. נוגדנים מסוימים להשתתף ויסות התיאבון וגם לוויסות טמפרטורת הגוף ההיפותלמוס1 כגון גידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNFα), אינטרלויקין (IL)-6, IL-1β, מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1), ו- CCL5 (C-C מוטיב ליגנד 5 ). בנוסף, דלקת בהיפותלמוס מוביל תנגודת לאינסולין T2DM2,3.
בין אלה נוגדנים, משינוי של רמות הביטוי של כימוקין CCL5 הקולטן שלו, CCR5, ברקמות adipose שויכה טרשת עורקים ואי סבילות לגלוקוז ב T2DM בני אדם, כמו גם בעלי חיים. CCL5 יש גם פונקציות נוירואנדוקריניים, לרבות ויסות טמפרטורת הגוף ושמירה מזון, בהיפותלמוס. לכן חשוב לחקור אם CCL5 משתתפת אינסולין אות הפעלה בתוך ההיפותלמוס או רקמות היקפיים.
אינסולין איתות מוסדר בחוזקה בתוך התאים. הכריכה של קולטני אינסולין כדי אינסולין (IR) מפעיל קולטן אינסולין חלבונים המצע (מס הכנסה), ואחריו phosphatidylinositol 3-קינאז (PI3K), חלבון קינאז B (PKB/AKT) הפעלה של גלוקוז טרנספורטר-4 (GLUT4) ממברנה טרנסלוקציה4 . חלבונים מס הכנסה הם הרגולטורים מפתח מסלול איתות זה: יש להם מספר שאריות טירוזין, סרין, אשר יכול להיות phosphorylated בתגובה חיובית או שלילית אינסולין מאותת5. לדוגמה, זרחון סרין 302-מס הכנסה-1 יכול להוביל דיסוציאציה גופנית של מס הכנסה-1 של IR, לחסום אותות אינסולין, שמוביל אינסולין ההתנגדות6. פעילות ירידת ערך של חלבונים מס הכנסה בהיפותלמוס הוכח לזירוז תנגודת לאינסולין וקנאות גלוקוז ב עכברים7.
אחת הדרכים הנפוצות ללמוד את הפונקציה של גן מסוים היא המניפולציה של הביטוי של גנים היעד מופצים ברחבי הגוף כולו של האורגניזם. עם זאת, ייתכן זה מספר חסרונות: 1) הוא יכול לייצר שונים תקינה או הבולמוס היזון חוזר לאורך זמן, שיטה 2) זו לא עוזר לנו להמחיש את התפקיד של החלבון היעד של אזורים ספציפיים במוח. בנוסף, ספציפיים ברקמות או תא ג'ין ההסתרה חיות זמן רב להתרבות, יקרות. לפיכך, אנו משתמשים במערכת משאבת osmotic לטווח קצר אינפוזיה המוח - דרך מהירה ונוחה יחסית להתערב עם האיתות של החלבון המטרה במוח בעזרת התרופה אנטגוניסט כדי להתגבר על הבעיות הנ. זריקות סטיאוטטי היה דורש מיומנות כירורגית מורכבות והשקעה נרחב במכשור ובזמן. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים דרך פשוטה ובטוחה לביצוע הזרקה סטיאוטטי, שיטה מהירה, פחות מזיק, מיידי לזהות את ריכוז הגלוקוז בדם ולחקור את התפקיד של CCL5 בהיפותלמי אינסולין איתות רגולציה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>#1049SB</td>
			<td>The glue used to seal the lesion site on the mouse head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE 454 instant adhesive</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#8670</td>
			<td>The glue used to fix the needle on the mouse skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet Micro- Osmotic Pump</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#9922</td>
			<td>0.11 &#956;l per hour, 28 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain infusion system</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#8851</td>
			<td>1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucometer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#06870244001</td>
			<td>Used to measure the blood glucose level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose chip</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#06454011020</td>
			<td>Used to load the blood sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#MKBK0523V</td>
			<td>To demonstrate the drug infusion area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>#3232145 C</td>
			<td>Used to administer insulin intraperitoneally</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIO NE116 CONTROL UNIT 
			(nail drill)</td>
			<td>Mio System</td>
			<td>#E235-015</td>
			<td>To drill a hole in the skull of the mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL5/Met-RANTES Protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>#ADB0111081</td>
			<td>Recombinant Human CCL5, E-coli derived</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF formula</td>
			<td>119 mM NaCl 
			26.2 mM NaHCO3 
			2.5 mM KCl 
			1 mM NaH2PO4 
			1.3 mM MgCl2 
			10 mM glucose</td>
			<td></td>
			<td>Filter sterilize with a 0.22 &#956;m filter apparatus, and store at 4&#176;C. 
			aCSF is stable for 3-4 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS-1 Serine302 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12879</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRS-1 (D23G12) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12879</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt Serine 473 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9916</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt (pan) (C67E7) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9916</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals: C57BL/6</td>
			<td>NAR Labs</td>
			<td></td>
			<td>Wild type mice strain used in the study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain

אינסולין מווסת את חילוף החומרים שיטתית ההיפותלמוס ואת התגובה לאינסולין היקפיים. לתגובה דלקתית ברקמות adipose היקפיים תורמת סוג 2 סוכרת (T2DM) פיתוח ותקינה התיאבון בהיפותלמוס. כימוקין CCL5 ו C-C קולטן כימוקין הקלד 5 רמות (CCR5) הציעו לתווך טרשת עורקים ואי סבילות לגלוקוז בסוכרת סוג 2 (T2DM). בנוסף, CCL5 תפקיד נוירואנדוקריניים בהיפותלמוס על ידי ויסות מזון צריכת וגוף טמפרטורה, לפיכך, ומעודדת אותנו לחקור את תפקידה של ההיפותלמוס אינסולין איתות ועל ויסות חילוף החומרים של הגלוקוז היקפיים.
מערכת אינפוזיה משאבת מיקרו-osmotic המוח היא דרך מהירה ומדויקת לתמרן CCL5 פונקציה וללמוד את השפעתו במוח. הוא מספק גם גישה אלטרנטיבית נוחה לייצר חיה נוקאאוט הטרנסגניים. במערכת זו, CCL5 איתות נחסמה על ידי אינפוזיה intracerebroventricular (ICV) של היריב שלו, MetCCL5, באמצעות משאבה מיקרו-osmotic. התגובתיות של אינסולין מטבוליזם הגלוקוז היקפיים זוהה על ידי מבחן רגישות גלוקוז דרך הפה (OGTT) מבחן עמידות לאינסולין (ITT). אינסולין איתות פעילות נותחה לאחר מכן על ידי חלבון כתם של דגימות רקמה נגזר מן החיות.
לאחר 7-14 ימי MetCCL5 אינפוזיה, חילוף החומרים של גלוקוז, אינסולין התגובה היה לקוי בעכברים, כפי שניתן לראות את התוצאות של OGTT, ITT. מס הכנסה-1 serine302 זירחון הוגדל, הפעילות Akt צומצם בנוירונים היפותלמי עכברים בעקבות עיכוב CCL5. בסך הכל, הנתונים שלנו מציע כי חסימת CCL5 במוח העכבר מגביר זירחון של מס הכנסה-1 S302, פסיקות היפותלמי אינסולין איתות, המוביל לירידה בתפקוד האינסולין רקמות היקפיים, כמו גם ירידת ערך של גלוקוז חילוף החומרים.

ניתוחי השתלות של משאבות עירוי osmotic המכיל גם חנה המבר שליטה או CCL5 אנטגוניסט MetCCL5 (כדי לחסום את ההשפעות CCL5 במוח) נערכו על העכברים. ב 7 ל 14 ימים לאחר הניתוח, גלוקוזה היקפיים והיענות אינסולין של עכברים נותחו באמצעות OGTT (לאחר 7 ימים), ITT (לאחר 14 ימים) כאמור בפרוטוקול. בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ואת מבחן עמידות לאינסולין (ITT) של עכברים בוצעו לאחר 6 שעות צום. עכברים נוהלו עם גלוקוז בעל פה, עם הסכום בהתבסס על משקל הגוף בהתאמה שלהם. השינויים ברמות הגלוקוז בדם נרשמו, כפי שמוצג באיור3. אינסולין רגישות הבדיקה בוצעה על ידי הזרקת אינסולין (IP) בקרום הבטן לתוך עכברים, השינוי של רמת הגלוקוז בדם נמדדה באופן מיידי. השינויים של רמות הגלוקוז בדם על גירוי האינסולין בעכברים עם אינפוזיה שונים תרופות נרשמו, כפי שמוצג באיור4. רמת הסוכר בדם צומצם רק במעט אחרי גלוקוז המינהל (איור 3B), הזרקת אינסולין (איור 4B) בעכברים עם אינפוזיה אנטגוניסט (MetCCL5) CCL5 לעומת עכברים עם חנה המבר אינפוזיה. תוצאות אלו מציעים לליקויים בתפקוד האינסולין על חילוף החומרים של הגלוקוז היקפיים בעכברים עם CCL5 Metמנוהל במוח.
בשלב הבא, ניתחנו את ההפעלה של אינסולין איתות המעריכה את זרחון IRS-1 ואת רמות הפעלה Akt ברקמות ההיפותלמוס. זרחון סרין-302 של מס ההכנסה-1 הייתה upregulated עכברים שטופלו אנטגוניסט (MetCCL5) (איור 5B-C) כאשר עכברים הואכלו באופן נורמלי. בקבוצת הביקורת, חנה המבר נוהלה על ההיפותלמוס עכברים ומופעל האתגר אינסולין מולקולת איתות במורד הזרם Akt (phosphorylated Akt סרין 473) (איור 5D, F) מבלי להגדיל את מס הכנסה-1 serine302 הפעלה ( איור 5D -E) Akt serine473 זרחון. לעומת זאת, האות Akt לא הוגדל בעכברים רווי MetCCL5, אך חלה עלייה ב זירחון של מס הכנסה-1 סרין 302 במקום. בינתיים, חוסם את האות CCL5 במוח העכבר התפרץ לפעילות האינסולין ההיפותלמוס ומתפקדים אינסולין היקפיים לקוי. מן הממצאים שלנו הכללית, כגון תוצאות ITT, OGTT, ואתגר שמחוץ אינסולין, הגענו למסקנה כי CCL5 בהיפותלמוס תורמת אינסולין אות הפעלה מטבוליזם הגלוקוז היקפיים על גירוי האינסולין.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg"> 
איור 1. משאבת osmotic השרשה והכנה הליך כירורגי עכבר. (א) החדרת המוח ואת משאבת הכנה perfused עם סמים פתרון. חצים אדומים מציינים הצינורות הקטטר מלא נוזלים. תיקון (B), הר הראש העכבר על המנגנון סטיאוטטי. (ג) נפרד השכבה החיצונית ביותר של העור מן העור תת עורית עבור ההשתלה של מוח-משאבת מיקרו-osmotic ערכת אינפוזיה; מקף קווים מציינים את המיקום של משאבת osmotic שתלים. (ד) החץ מצביע על הצד אינפוזיה. (E) לקדוח חור סביב האזור המסומן על הגולגולת. (F) מקום העירוי מוח-משאבת osmotic להגדיר לחלק האחורי של העכבר והכנס את המחט אינפוזיה המוח לתוך החור קדח (מקף בעיגול). (G) לתקן את המחט לתוך הגולגולת באמצעות דבק רקמות-דבק ולנתק את החלק העליון של המחט (מספריים הצביע בסול) כפי שמוצג (H). (אני) חותם הפצע באמצעות רקמות דבק דבק. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg"> 
איור 2- תמונות נציג של האזור דיפוזיה סמים כאשר התרופה ניתנת באזור חדרית באמצעות המשאבה osmotic. הכחול של אוון הוא הסם נציג בשימוש האיור אינפוזיה משאבה osmotic סמים לתוך האזור חדרית (A) ודיפוזיה לתוך החדרים הצדדיים והשלישי (B). סרגל קנה מידה = 0.5 ס מ. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg"> 
איור 3- מטבוליזם הגלוקוז של העכברים לאחר הניתוח נמדדת במבחן סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT). ההתפלגות של רמות הגלוקוז בדם השתנה להלן המינהל אוראלי של גלוקוז בעכברים WT חלוט עם כלנית חדד (A), אנטגוניסט, מ'CCL5 (B). נתונים כמוצג זאת אומרת ± SE. (דמות שונה מ-8). * p &#60; 0.05, מאת אנובה דו-כיווני. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg"> 
איור 4. אינסולין פונקציה של רמת הסוכר בדם עכברים - הבדיקה עמידות לאינסולין (ITT). ההתפלגות של רמות הגלוקוז בדם השתנה בעקבות הזרקת אינסולין בעכברים WT רווי כלנית חדד (A), ו חדורים עם אנטגוניסט, מ'CCL5 (B). נתונים שהוצגו כמו זאת אומרת ± SE (דמות שונה מ-8). p &#60; 0.001, מאת אנובה דו-כיווני. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg"> 
איור 5. האות לפעילות האינסולין בעכברים לאחר הניתוח. סופג המערבי (A), צורת מעכבות סרין 302 זרחון IRS-1 (אינסולין התגובה המצע-1, pIRS1S302) ברקמות ההיפותלמוס עכברים שטופלו כלנית חדד או CCL5 אנטגוניסט, MetCCL5 (CCL5מ') משאבת אינפוזיה. (B) קשורים רמות של זרחן-מס הכנסה-1S302 לאחר אינפוזיה של ההיפותלמוס עכברים עם האכלה רגילה.(ג) המערבי סופג של זירחון S302 של הפעלת מס הכנסה-1 ו- Akt (פוספור-Akt S473, pAktS473) עם או בלי גירוי האינסולין ברקמות היפותלמי לאחר כלנית חדד או אינפוזיה METCCL5. (D-E) רמות היחסי שלS302חיישנים-1, pS6KT421, pAktS473. ("2" בכל גרף מייצג: n = 2 עבור כל quantifications). (עזב מהברים ריק ב 5D-E,: ללא אינסולין; בפסי רצועות ב 5D-E, נכון: עם אינסולין). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>מזהה העכבר</td>
			<td>הגוף</td>
			<td>גלוקוז</td>
			<td>התחל</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>משקל</td>
			<td>ΜL = 10xBW</td>
			<td>זמן</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25.8g</td>
			<td>258</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25.3g</td>
			<td>253</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1- לוח הזמנים להקלטה מבחן רגישות גלוקוז דרך הפה (OGTT)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>מזהה העכבר</td>
			<td>הגוף</td>
			<td>אינסולין 0.25IU</td>
			<td>התחל</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>משקל</td>
			<td>ΜL = 3xBW</td>
			<td>זמן</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
			<td>דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28.8g</td>
			<td>86.4</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:00</td>
			<td>9:15</td>
			<td>9:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25.3g</td>
			<td>75.9</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:07</td>
			<td>9:22</td>
			<td>9:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2. לוח הזמנים להקלטה מבחן עמידות לאינסולין (ITT)

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain at JoVE.com

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

פרוטוקול זה לומד את התפקיד של ליגנד (מוטיב C-C) כימוקין 5 (CCL5) בהיפותלמוס על-ידי אספקת אנטגוניסט, MetCCL5, לתוך המוח העכבר באמצעות מערכת מיקרו-osmotic משאבת אינפוזיה המוח. זה עיכוב ארעית של פעילות CCL5 התפרץ היפותלמי אינסולין איתות, המוביל גלוקוז סובלנות ורגישות לאינסולין מערכתית היקפיים.

לומדים את האות ההיפותלמוס אינסולין סובלנות גלוקוז היקפי עם מערכת עירוי רציף סמים לתוך המוח העכבר

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

משלוח סמים האוסמוטי לhindlimbs איסכמי וטפטוף של כלי דם עם Microfil למייקרו-טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Image-guided Convection-enhanced Delivery into Agarose Gel Models of the Brain

משלוח משופר הסעה מודרכת תמונה לתוך מודלים Agarose ג&#39;ל של המוח

Convection-enhanced delivery (CED) has been proposed as a treatment option for a wide range of neurological diseases. Neuroinfusion catheter CED allows ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

שימוש Saccadometry עם דיפ גירוי המוח לחקר תפקוד מוח נורמלי ופתולוגיים

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema

עירוי IV רציף הוא כביש טיפול הבחירה עבור ארגינין-וזופרסין קולטן חוסם Conivaptan עכברים ללמוד בצקת מוחית עורר שבץ

Stroke is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Stroke is complicated by brain edema and other pathophysiological events. Among ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

השתלת לתוך כרית עכבר השחלות שומן

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

דור שערה ותרופות repurposing שימוש &quot;RE: סמים בסדר&quot; מערכת

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

עירוי צינור הלבלב: שיטה יעילה וסלקטיבית של סמים ומשלוח ויראלי

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

מודל פציעה דרוזופילה In Vivo ללמוד Neuroregeneration ב ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...